Name: Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania serca do badania proliferacji kardiomiocytów i dynamiki komórkowej po urazie. Technika ta umożliwia śledzenie populacji komórek w procesie regeneracji mięśnia sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez Szkołę Medycyny i Zdrowia Publicznego UW z Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), oraz American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po użytkowaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Szkole Medycyny i Zdrowia Publicznego na Uniwersytecie Wisconsin-Madison. Wszystkie metody przeprowadzono na dzikich liniach myszy C57BL/6J (B6) i transgenicznych uzyskanych z Jackson Laboratories.
1. Niedrożność tętnicy wieńcowej (zawał mięśnia sercowego) wywołana przez podwiązanie lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) u 1-dniowych noworodków myszy6
<ol>
	<li>Oddziel 1-dniowe młode nowonarodzone od matki, umieszczając je w czystej klatce wraz z częścią oryginalnego materiału gniazdowego.</li>
	<li>Umieść połowę klatki na poduszce grzewczej ustawionej na średnie ciepło. Szczenięta powinny pozostać po nieogrzewanej stronie klatki, a dopiero po operacji umieszczać je na ogrzewanej stronie.</li>
	<li>Stwórz sterylne pole operacyjne pod mikroskopem operacyjnym. Zbierz wysterylizowany sprzęt chirurgiczny (Tabela 1).</li>
	<li>Znieczulenie szczeniaka przez hipotermię: owiń szczenię gazą, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu skóry z lodem i zakop je w lodzie na około 3-4 minuty. Okresowo sprawdzaj hipotermię myszy, wykonując szczypanie palca u nogi. Noworodki dobrze znoszą hipotermię, jednak długotrwałe narażenie na hipotermię może skutkować odmrożeniami, a następnie śmiertelnością.</li>
	<li>Po znieczuleniu umieść mysz na obszarze operacyjnym w pozycji leżącej, zabezpieczając ręce i nogi taśmą. Wysterylizuj obszar chirurgiczny myszy roztworem antyseptycznym.</li>
	<li>Zlokalizuj dolną część klatki piersiowej i wykonaj poprzeczne nacięcie w skórze małymi nożyczkami preparującymi. Aby poszerzyć pole widzenia chirurgicznego żeber, oddziel skórę od mięśnia, delikatnie unosząc skórę za pomocą kleszczy opatrunkowych i delikatnie dociśnij do mięśni międzyżebrowych małymi nożyczkami w pozycji zamkniętej.</li>
	<li>Zlokalizuj czwartą przestrzeń międzyżebrową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i wykonaj małe, powierzchowne nakłucie za pomocą ostrych kleszczy, uważając, aby nie przebić żadnych narządów wewnętrznych. Wykonaj rozwarstwienie, poszerzając obszar między mięśniami międzyżebrowymi za pomocą kleszczy opatrunkowych. Prawidłowe anatomiczne umiejscowienie nacięcia jest niezbędne do prawidłowego dostępu do serca.</li>
	<li>Delikatnie wyprowadź serce z jamy klatki piersiowej, kładąc palec i wywierając coraz większy nacisk na lewą stronę brzucha, jednocześnie przytrzymując otwartą przestrzeń międzyżebrową kleszczami opatrunkowymi (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Gdy serce znajdzie się na zewnątrz klatki piersiowej, zdejmij kleszcze opatrunkowe, zmniejsz nacisk i pozwól sercu spocząć na mięśniach międzyżebrowych.</li>
	<li>Zlokalizuj LAD jako obszar serca, który ma mniej nagromadzonej krwi i znajduje się we właściwej pozycji anatomicznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). LAD można zobaczyć pod mikroskopem tylko wtedy, gdy dostęp do serca nastąpi w ciągu kilku minut od rozpoczęcia operacji.</li>
	<li>Wykonaj podwiązanie LAD, zszywając LAD szwem 6-0 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Zawiąż kwadratowy węzeł dwa razy, aby wywołać zawał mięśnia sercowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Głębokość szwu w mięśniu sercowym może być różna, jednak prawidłowe anatomiczne ułożenie podwiązania LAD ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności. Podczas podwiązywania LAD szew powinien być mocno naciągnięty, ale ostrożnie, aby nie przeciąć LAD. Blanszowanie na wierzchołku serca będzie widoczne natychmiast (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E)</li>
	<li>Pozwól, aby serce wsunęło się z powrotem do jamy klatki piersiowej; proces ten można delikatnie ułatwić za pomocą kleszczy opatrunkowych. Zszyj żebra razem z węzłem chirurgicznym, a następnie węzłem kwadratowym, używając kleszczy, aby podnieść górny zestaw żeber, jednocześnie przechodząc szwem 6-0 przez górny i dolny zestaw żeber.</li>
	<li>Usuń taśmę, która była używana do zabezpieczenia tylnych nóg szczeniaka.</li>
	<li>Sklej skórę ze sobą, nakładając niewielką ilość kleju do skóry na górną część brzucha. Następnie chwyć skórę dolnej części brzucha cienkimi kleszczami i zakryj odsłoniętą część klatki piersiowej. Ogranicz ilość nadmiaru kleju, który pozostaje na szczeniętach, ponieważ może to zwiększyć prawdopodobieństwo odrzucenia i kanibalizmu przez matkę.</li>
	<li>Natychmiast ułatw powrót do zdrowia po znieczuleniu, umieszczając szczeniaka na poduszce grzewczej ustawionej na średnie ciepło. Okresowo zmieniaj ułożenie noworodków, aby równomiernie ogrzać wszystkie części ciała.</li>
	<li>Pozwól noworodkowi pozostać bezpośrednio na poduszce grzewczej przez 10–15 minut. Zazwyczaj ruch jest odzyskiwany w ciągu 5 minut od umieszczenia na ogniu.</li>
	<li>Oczyść resztki krwi i kleju wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Zakryj obce zapachy noworodków, pocierając całe ciało pościelą z oryginalnej klatki. Umieść szczeniaka w klatce po ogrzewanej stronie, podczas gdy wykonywane są inne operacje.</li>
	<li>Gdy wszystkie operacje zostaną zakończone, a młode będą ciepłe i ruchliwe, przenieś miot wraz z oryginalnym materiałem gniazdowym do klatki matki.</li>
	<li>Monitoruj myszy przez 30–60 minut po operacji i obserwuj, czy matka akceptuje młode poprzez zagnieżdżanie i/lub pielęgnację.</li>
	<li>Sprawdź myszy rano po zabiegu. Jeśli matka jest zestresowana i nie zagnieździła szczeniąt, rozważ przybraną matkę dla szczeniąt.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie serca myszy za pomocą umiejętności pasywnej CLARITY21,22,23
<ol>
	<li>Znieczulij mysz izofluranem. Uszczypnij palec u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni uspokojona.</li>
	<li>Umieść mysz na czystym, chirurgicznym obszarze w pozycji leżącej, zabezpieczając ręce i nogi taśmą.</li>
	<li>Utrzymać sedację izofluranem u myszy za pomocą stożka nosowego do momentu ekstrakcji serca.</li>
	<li>Otwórz dolną część klatki piersiowej, przytrzymując futro tuż poniżej wyrostka mieczykowatego kleszczami tkankowymi i wykonaj nacięcie na całej szerokości klatki piersiowej za pomocą dużych nożyczek preparujących.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż dystalnych części klatki piersiowej nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Odsłoń mięsień przepony, chwytając wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy tkankowych. Odłącz membranę za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Utrzymując chwyt wyrostka mieczykowatego, pociągnij tkankę czaszkowo, aż bijące serce będzie dostępne.</li>
	<li>Chwyć serce u podstawy zakrzywionymi kleszczami i wypreparuj serce z jamy klatki piersiowej, przecinając aortę i żyłę główną górną nożyczkami do irydektomii.</li>
	<li>Gdy serce nadal bije, umieść je na szalce Petriego wypełnionej PBS, aby serce pompowało krew do środka, gdy nadal bije. Zawał mięśnia sercowego można potwierdzić poprzez sprawdzenie, czy szew jest umieszczony w odpowiedniej pozycji anatomicznej do podwiązania LAD.</li>
	<li>Delikatnie ściśnij serce kleszczami, aby serce mogło wydalić resztki krwi.</li>
	<li>Przenieś serce myszy do jednorazowej fiolki ze szklaną skorupką o pojemności 2,5 ml i 2 ml PBS. Zmyj resztki krwi, kilkakrotnie inkubując serce na wytrząsarce przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zmieniaj rozwiązanie PBS za każdym razem, aż PBS pozostanie czysty.</li>
	<li>Wyrzuć PBS i napełnij fiolkę 2 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Po inkubacji wyrzucić PFA i fiolkę z 2 ml PBS. Myj serce na shakerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap mycia dwukrotnie, za każdym razem opróżniając i napełniając fiolkę nowym PBS, aby całkowicie zmyć nadmiar PFA.</li>
	<li>Wyrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml 4% roztworu akrylamidu i 0,5% roztworu VA-044. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia należy przeprowadzić polimeryzację, przenosząc fiolkę do bloku grzewczego ustawionego na 37 °C na 3 godziny.</li>
	<li>Przenieść serce do nowej fiolki ze szklaną otoczką i powtórzyć krok 2.12 (cykl płukania PBS).</li>
	<li>Odrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml roztworu czyszczącego (Tabela 2). Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oczyszczenia serca. Zmieniaj roztwór i uzupełniaj go świeżym roztworem czyszczącym co 2-3 dni. Proces oczyszczania może potrwać do kilku tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B-C). 
	UWAGA: Serca P1 zwykle potrzebują około 3-5 dni, podczas gdy serca P21 mogą potrzebować prawie miesiąca, zanim inkubacja roztworu oczyszczającego zostanie zakończona.</li>
	<li>Odrzucić PBS i napełnić fiolkę 2 ml PBS i powtórzyć krok 2.12 (cykl płukania PBS). Ponownie napełnić fiolkę świeżym PBS i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Jeśli ma być wykonane barwienie immunologiczne, pomiń kroki 2.21–2.22 i przejdź do sekcji 3 dotyczącej barwienia immunologicznego. Jeśli polegasz wyłącznie na fluorescencji endogennej, wykonaj kroki 2.21–2.22 i pomiń sekcję 3.</li>
	<li>Odrzucić PBS i zmienić roztwór na roztwór do dopasowania współczynnika załamania światła (RIMS) (Tabela 3). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji, oczyszczona tkanka może być przechowywana w roztworze RIMS w temperaturze RT. Tkanka może wydawać się biała i nieprzezroczysta w środku, gdy po raz pierwszy przenosi się do RIMS; tkanka powinna stać się przezroczysta po inkubacji w RIMS w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
</ol>
3. Opcjonalnie: Barwienie immunohistochemiczne całego serca myszy
<ol>
	<li>Wyjąć oczyszczone serce z roztworu RIMS i umieścić w czystej szklanej fiolce o pojemności 2,5 ml z 2 ml PBST (PBS z 0,1% Triton-X 100)</li>
	<li>Umyj serce w PBST 3 razy na rotatorze orbitalnym z 30-minutową inkubacją w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał poprzez zanurzenie serca w 2 ml 20% buforu blokującego (rozcieńczonego w PBST) i inkubować z rotacją przez 3 godziny w temperaturze suchej masy. Przenieść do 4 °C w celu barwienia z rotacją przez noc. 
	UWAGA: Bufor blokujący jest wytwarzany z normalnej surowicy pasującej do gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe.</li>
	<li>Umyj serce w PBST 3 razy z rotacją przez 5 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurz serce w przeciwciałie pierwszorzędowym (rozcieńczonym w 2% buforze blokującym z PBST) i zapobiegaj ekspozycji na światło, owijając szklaną fiolkę folią aluminiową. Inkubować z rotacją przez noc w temperaturze RT. 
	UWAGA: Od tego momentu folia aluminiowa powinna być stale używana do ochrony wtórnika przed światłem otoczenia.</li>
	<li>Inkubować przez dodatkowe 24 godziny z rotacją w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po barwieniu pierwotnym powtórz krok 3.2 (długi cykl płukania PBST), aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe z tkanki. Przedłużyć pranie o inkubację przez noc z rotacją przy suchej smołce.</li>
	<li>Pracując w miejscu o ograniczonym oświetleniu, aby zapobiec wtórnej ekspozycji na światło przeciwciał, zanurzyć serce w przeciwciałie drugorzędowym (rozcieńczonym w 2% buforze blokującym z PBST) i inkubować z rotacją przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść do 4 °C w celu barwienia z rotacją przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia powtórz krok 3.2 (długi cykl płukania PBST), aby usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe.</li>
	<li>Zastąp roztwór 2% buforem blokującym (rozcieńczonym w PBST). Usunąć resztki niezwiązanego przeciwciała przez przemycie przez noc z rotacją w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnego dnia sprawdź, czy nadmiar przeciwciał drugorzędowych został usunięty za pomocą mikroskopii konfokalnej. W razie potrzeby przedłuż mycie, codziennie wymieniając 2% roztwór buforowy blokujący. Kontynuuj, gdy nie ma prawie żadnej niespecyficznej wtórnej.</li>
	<li>Przechowywać wybarwione immunologicznie serce w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bezpośrednio przed mikroskopią całego wierzchowania należy inkubować serce w roztworze RIMS przez noc w temperaturze 37 °C. Przedłużyć inkubację o dodatkowe 24 godziny, jeśli tkanka nadal nie jest w pełni oczyszczona.</li>
	<li>Przechowuj w pełni oczyszczone i wybarwione immunologicznie serce w RIMS w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Wizualizacja populacji nie-miocytów w 3D za pomocą jednofotonowej mikroskopii konfokalnej Obrazowanie oczyszczonego serca myszy
UWAGA: Jeśli serca myszy są zbierane embrionalnie, przejdź do sekcji 4.1. W przypadku serc myszy pobranych po urodzeniu, należy przejść do punktu 4.2.
<ol>
	<li>Obrazowanie oczyszczonego embrionalnego serca myszy
	<ol>
		<li>Napełnij szkiełko wgłębieniowe mikroskopu roztworem PBS.</li>
		<li>Ostrożnie podnieś oczyszczone serce za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść tkankę na szkiełku.</li>
		<li>Zamontuj szkiełko za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego. Tkankę można teraz obrazować pod mikroskopem konfokalnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie oczyszczonego serca myszy po urodzeniu
	<ol>
		<li>Napełnić połowę komory szkiełka wgłębieniowego roztworem PBS. W celu stworzenia komory wystarczająco dużej, aby zmieściło się w niej serce dorosłej myszy, wydrukowana w 3D polipropylenowa prowadnica depresyjna została wykonana na zamówienie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Ostrożnie podnieś oczyszczone serce za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść tkankę w komorze. Wypełnij pozostałą objętość komory PBS.</li>
		<li>Napełnij komorę PBS tak, aby powierzchnia cieczy utworzyła kopułę nad górną częścią komory. Zamontuj prowadnicę pokrywy. Tkankę można teraz obrazować pod pionowym mikroskopem konfokalnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li>
<li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+infarct+artery+location%2C+acute+total+coronary+occlusion%2C+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li>
<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li>
<li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li>
<li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553(2018).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomateria%22%5BJournal%5D)">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li>
<li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li>
<li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013(2016).</li>
<li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice%2C+A+Model+of+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).</li>
<li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754(2018).</li>
<li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li>
<li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li>
<li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Interakcje komórka-komórka między kardiomiocytami a populacjami nie-miocytami są czynnikiem decydującym o tym, czy serce ulegnie zwłóknieniu, czy naprawi się po urazie. Dokonano odkryć wykazujących, że różne typy komórek, w tym nerwy14, komórki nasierdzia24, makrofagi otrzewnej25, tętniczki12,13 i komórki śródbłonka limfatycznego26, odgrywają istotną rolę w pośrednicze...

Serce od dawna uważane jest za organ postmitotyczny, jednak ostatnie dowody pokazują, że odnowa kardiomiocytów zachodzi w sercu dorosłego człowieka w tempie około 1% rocznie1. Jednak te niskie wskaźniki obrotu kardiomiocytów są niewystarczające, aby uzupełnić masywną utratę tkanki, która następuje po urazie. Serce, które doznało zawału mięśnia sercowego, straci około miliarda kardiomiocytów, co często służy jako preludium do niewydolności serca i nagłej śmierci sercowej2,3. Biorąc pod uwagę, że na całym świecie niewydolność serca dotyka ponad 26 milionów osób, istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na terapie, które mogą odwrócić szkody wyrządzone przez choroby serca4.
Aby wypełnić tę lukę w lecznictwie, naukowcy rozpoczęli badania nad ewolucyjnie zachowanymi mechanizmami, które leżą u podstaw endogennej regeneracji po urazie. Jednym z modeli do badania regeneracji serca u ssaków jest mysz nowonarodzona. W ciągu tygodnia po urodzeniu u nowonarodzonych myszy występuje silna odpowiedź regeneracyjna po uszkodzeniu serca5. Wcześniej wykazaliśmy, że nowonarodzone myszy mogą regenerować swoje serce poprzez proliferację kardiomiocytów po resekcji wierzchołkowej5. Chociaż technika ta może wywołać regenerację serca u noworodków, operacja nie ma znaczenia klinicznego w przypadku urazów serca u ludzi. Aby naśladować uraz człowieka w modelu noworodka myszy, opracowaliśmy technikę wywoływania zawału mięśnia sercowego poprzez niedrożność tętnicy wieńcowej6. Technika ta wymaga chirurgicznego podwiązania lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD), która jest odpowiedzialna za dostarczanie 40%–50% krwi do mięśnia sercowego lewej komory6,7. W ten sposób operacja powoduje zawał, który wpływa na znaczną część ściany lewej komory. To uszkodzenie mięśnia sercowego będzie stymulować proliferację kardiomiocytów i regenerację serca u noworodków5.
Operacja niedrożności tętnic wieńcowych zapewnia wysoce powtarzalną i bezpośrednio translacyjną metodę odkrywania wewnętrznych mechanizmów regeneracji serca. Chirurgia noworodków przebiega równolegle do miażdżycy tętnic wieńcowych w ludzkim sercu, gdzie nagromadzenie blaszki miażdżycowej w wewnętrznych ścianach tętnic może spowodować niedrożność, a następnie zawał mięśnia sercowego8. Ze względu na brak metod leczenia pacjentów z niewydolnością serca, niedrożność w LAD wiąże się ze śmiertelnością sięgającą do 26% w ciągu roku po urazie9, i w związku z tym została nazwana "twórcą wdów". Postęp w terapii wymaga modelu, który dokładnie odzwierciedla złożone fizjologiczne i patologiczne skutki uszkodzenia serca. Nasz protokół chirurgiczny leczenia uszkodzeń serca u noworodków myszy stanowi platformę, która pozwala naukowcom badać sygnały molekularne i komórkowe, które sygnalizują regenerację serca ssaków po urazie.
Ostatnie badania podkreślają dynamiczny związek między środowiskiem zewnątrzkomórkowym a proliferacją kardiomiocytów. Na przykład poporodowe okno regeneracyjne można wydłużyć, zmniejszając sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej serce10. Biomateriały z macierzy zewnątrzkomórkowej noworodków mogą również wspomagać regenerację serca w sercach dorosłych ssaków po urazie serca11. Proliferacji kardiomiocytów towarzyszy również odpowiedź angiogenna12,13; Wykazano, że tworzenie się tętnicy pobocznej unikalne dla regenerującego się serca noworodka myszy jest niezbędne do stymulowania regeneracji serca12. Co więcej, nasze laboratorium wykazało, że sygnalizacja nerwowa reguluje proliferację kardiomiocytów i regenerację serca poprzez modulację poziomu czynnika wzrostu, a także reakcję zapalną po urazie14. Odkrycia te podkreślają potrzebę śledzenia populacji komórek niebędących miocytami w odpowiedzi na uszkodzenie serca. Aby osiągnąć ten cel, wykorzystaliśmy system rekombinacji Cre-lox w liniach myszy transgenicznych w celu włączenia konstytutywnej lub warunkowej ekspresji fluorescencyjnych białek reporterowych do śledzenia linii. Co więcej, możemy użyć zaawansowanych metod do określenia wzorca ekspansji klonalnej za pomocą linii myszy Rainbow, która opiera się na stochastycznej ekspresji zależnych, wielokolorowych reporterów fluorescencyjnych zależnych od Cre w celu określenia ekspansji klonalnej docelowych populacji komórek15. Wykorzystanie śledzenia linii z chirurgią niedrożności tętnic wieńcowych u noworodków jest potężnym narzędziem do analizowania skomplikowanych mechanizmów komórkowych regeneracji serca.
Śledzenie linii komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą trójwymiarowego (3D) obrazowania całego narządu jest trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnej techniki cięcia i rekonstrukcji - zwłaszcza gdy populacje komórek są delikatne, takie jak włókna nerwowe lub naczynia krwionośne. Podczas gdy bezpośrednie obrazowanie całego narządu za pomocą sekcji optycznej może uchwycić powierzchowne populacje komórek, struktury znajdujące się głęboko w tkance pozostają niedostępne. Aby obejść te bariery, opracowano techniki oczyszczania tkanek w celu zmniejszenia zmętnienia tkanek całego narządu. Ostatnio poczyniono znaczne postępy w zakresie metod opartych na przezroczystym morfologii sztywnego obrazowania zgodnego z polimerami lipidowymi i akrylamidem (CLARITY), które usuwają utrwaloną tkankę za pomocą ekstrakcji lipidów16. Podejmowane są również kroki w celu homogenizacji współczynnika załamania światła, a następnie zmniejszenia rozpraszania światła podczas obrazowania17. Jedną z takich metod jest aktywna CLARITY, która przyspiesza rozkład lipidów za pomocą elektroforezy do penetracji detergentu w całej tkance18. Chociaż skuteczna, ta metoda oczyszczania tkanek wymaga drogiego sprzętu i może powodować uszkodzenia tkanek, co sprawia, że podejście to jest niekompatybilne z delikatnymi populacjami komórek, takimi jak nerwy sercowe19. W związku z tym stosujemy pasywne podejście CLARITY, które opiera się na cieple, aby delikatnie ułatwić przenikanie detergentu, pomagając w ten sposób w zachowaniu skomplikowanych struktur komórkowych20,21.
Pasywna PRZEJRZYSTOŚĆ jest zazwyczaj uważana za mniej efektywną niż aktywna PRZEJRZYSTOŚĆ18, ponieważ technice tej często towarzyszą dwie główne przeszkody: niemożność oczyszczenia całego narządu i długi czas potrzebny na usunięcie tkanek dorosłych. Nasze pasywne podejście CLARITY pokonuje obie te bariery dzięki przyspieszonemu procesowi oczyszczania, który jest w stanie w pełni oczyścić tkankę serca noworodków i dorosłych. Nasza pasywna technika oczyszczania tkanek CLARITY osiągnęła skuteczność, która pozwala na wizualizację różnych populacji komórek serca, w tym rzadkich populacji rozmieszczonych w całym sercu dorosłego człowieka. Kiedy oczyszczone serce jest obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, można naświetlić architekturę specyficznych dla komórek wzorców podczas rozwoju, choroby i regeneracji.

<table><tbody><tr><td>1-tioglicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Szwy prolenowe</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Szwy polipropylenowe</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td><td></td>borowy</tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>Półzakrzywione, ząbkowane, 4</td></tr><tr><td>cale opatrunkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Rozwarstwianie, 4,5 cala</td></tr><tr><td>szklana fiolka</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 x 35 mm Fiolka z nakrętką</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Irydektomia Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2 mm Krawędź tnąca</td></tr><tr><td>Duże nożyczki preparacyjne</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Prosty, 6-calowy</td></tr><tr><td>uchwyt na igłę</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 cali</td></tr><tr>bufor <td></td><td></td><td></td><td>fosforanowy</td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostre kleszcze</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>Cienka końcówka, prosta, 4,25 cala</td></tr><tr><td>Małe nożyczki preparacyjne</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm Krawędź tnąca</td></tr><tr><td>Azydek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu Dodecyl sodu Siarczan (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki tkankowe</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>Średnia tkanka, 1X2 zęby</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals Rozpuszczalny</td><td></td><td>w wodzie inicjator azowy</td></tr></tbody></table>

uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Choroby układu krążenia przewyższają wszystkie inne przyczyny zgonów i są odpowiedzialne za oszałamiające 31% zgonów na całym świecie. Choroba ta objawia się uszkodzeniem serca, przede wszystkim w postaci ostrego zawału mięśnia sercowego. Przy niewielkiej odporności po urazie, niegdyś zdrowa tkanka serca zostanie zastąpiona włóknistą, niekurczliwą tkanką bliznowatą i często będzie to preludium do niewydolności serca. Aby zidentyfikować nowe opcje leczenia w medycynie regeneracyjnej, badania skupiły się na kręgowcach z wrodzonymi zdolnościami regeneracyjnymi. Jednym z takich organizmów modelowych jest mysz nowonarodzona, która reaguje na uraz serca solidną regeneracją mięśnia sercowego. W celu wywołania urazu u noworodka, który jest istotny klinicznie, opracowaliśmy operację zamknięcia lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD), odzwierciedlającej zawał mięśnia sercowego wywołany miażdżycą w ludzkim sercu. W połączeniu z technologią śledzenia zmian zarówno w populacjach kardiomiocytów, jak i nie-miocytów, model ten zapewnia nam platformę do identyfikacji mechanizmów, które kierują regeneracją serca. Uzyskanie wglądu w zmiany w populacjach komórek serca po urazie kiedyś w dużej mierze opierało się na metodach takich jak sekcja tkanek i badanie histologiczne, które ograniczają się do analizy dwuwymiarowej i często uszkadzają tkankę w tym procesie. Co więcej, metody te nie są w stanie śledzić zmian w liniach komórkowych, zamiast tego dostarczają jedynie migawki reakcji na uraz. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób zaawansowane technologicznie metody w modelach śledzenia linii, oczyszczaniu całego narządu i trójwymiarowej (3D) mikroskopii całościowej można wykorzystać do wyjaśnienia mechanizmów naprawy serca. Dzięki naszemu protokołowi operacji zawału mięśnia sercowego u noworodków myszy, oczyszczania tkanek i obrazowania 3D całych narządów, złożone szlaki, które indukują proliferację kardiomiocytów, mogą zostać odkryte, ujawniając nowe cele terapeutyczne dla regeneracji serca.

Często dwoma najtrudniejszymi etapami są wysunięcie serca z jamy klatki piersiowej oraz podwiązanie LAD. Aby rozwiązać problemy z tymi krokami, można wprowadzić korekty w rozmieszczeniu początkowego nakłucia między czwartymi mięśniami międzyżebrowymi; jeśli nakłucie i tępa dyssekcja znajdują się zbyt blisko mostka, serce może nie być w stanie opuścić jamy klatki piersiowej (Rysunek 1A).
Dodatkowo, aby ułatwić ten proces, może być konieczny zwiększ...

Proliferacja kardiomiocytów po urazie jest dynamicznym procesem, który wymaga symfonii sygnałów zewnątrzkomórkowych z populacji komórek niebędących miocytami. Wykorzystując śledzenie linii, pasywną CLARITY i techniki trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej z pełnym mocowaniem, możemy analizować wpływ różnych typów komórek na naprawę i regenerację serca.

Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Endogenna regeneracja serca to dynamiczny proces, w którym wiele typów komórek współpracuje ze sobą w celu wytworzenia silnej odpowiedzi regeneracyjnej. Zaglądanie w regenerującą się tkankę za pomocą obrazowania 3D oczyszczonego serca w odpowiedzi na uraz może pomóc w odbudowie dynamiki komórkowej, która kieruje tą reakcją regeneracyjną serca. Nasz protokół został specjalnie zaprojektowany do śledzenia komórek podczas rozwoju i regeneracji.Nie przewidujemy żadnych ograniczeń w szerokim zastosowaniu naszych technik oczyszczania, barwienia i obrazowania do innych typów narządów. W przypadku niedrożności tętnic wieńcowych wywołanej przez LAD, najpierw wysterylizuj obszar chirurgiczny znieczulonego jednodniowego noworodka roztworem antyseptycznym. Wykonaj poprzeczne nacięcie skóry w okolicy klatki piersiowej.Aby oddzielić skórę od mięśnia, użyj kleszczy opatrunkowych, aby ostrożnie podnieść skórę, delikatnie dociskając nożyczki do mięśni międzyżebrowych w pozycji zamkniętej. Zlokalizuj czwartą przestrzeń międzyżebrową i użyj małych kleszczy, aby wykonać małe powierzchowne nakłucie, uważając, aby uniknąć narządów wewnętrznych. Za pomocą sekcji i kleszczy opatrunkowych poszerz obszar między mięśniami międzyżebrowymi, aż palec będzie mógł zostać przyłożony do lewej strony brzucha, jednocześnie przytrzymując otwartą przestrzeń międzyżebrową kleszczami opatrunkowymi, aby delikatnie wyprowadzić serce z jamy klatki piersiowej.Po ekstrakcji serca pozwól sercu spocząć na mięśniach międzyżebrowych i zlokalizuj LAD jako obszar serca z mniejszą ilością krwi. Aby wywołać zawał mięśnia sercowego, użyj szwu 6-0, aby dwa razy ciasno zawiązać kwadratowy węzeł wokół naczynia bez przecinania tętnicy. Blanszowanie na wierzchołku należy zaobserwować natychmiast.Ważne jest, aby zachować spójność w umieszczaniu szwów wzdłuż LAD dla podobnego rozmiaru zawału. Najlepiej osiągnąć to poprzez szybki dostęp do serca, gdy krew nadal przepływa przez tętnice. Po założeniu szwu pozwól, aby serce wsunęło się z powrotem do jamy klatki piersiowej.Zszyj żebra razem z jednym chirurgiem i jednym kwadratowym węzłem za pomocą kleszczy, aby podnieść górny zestaw żeber, jednocześnie przepuszczając szew 6-0 przez górny i dolny zestaw żeber. Nałóż niewielką ilość kleju do skóry na górną część brzucha i za pomocą cienkich kleszczy ułóż skórę dolnej części brzucha nad odsłoniętym obszarem klatki piersiowej. Następnie umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i wykonaj podwiązanie na następnym zwierzęciu.Po wykonaniu wszystkich operacji należy zwrócić ciepłe i ruchliwe szczenięta do domowej klatki matki. Aby uzyskać bierną przejrzystość pobranej tkanki serca, 21 dni po operacji po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u nogi, umieść mysz na czystym obszarze operacyjnym w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny taśmą. Za pomocą kleszczy tkankowych chwyć futro tuż poniżej wyrostka mieczykowatego i wykonaj nacięcie na szerokość klatki piersiowej.Przeciąć wzdłuż dystalnych części klatki piersiowej i użyj kleszczy, aby podnieść wyrostek mieczykowaty, aby odsłonić przeponę. Odłącz przeponę za pomocą zakrzywionych kleszczyków i pociągnij tkankę czaszkowo, aż bijące serce będzie dostępne. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić serce u podstawy i użyj nożyczek do irydektomii, aby przeciąć aortę i żyłę główną górną.Umieść bijące serce na szalce Petriego PBS, tak aby serce wypompowało zatrzymaną krew. Zawał mięśnia sercowego można potwierdzić poprzez prawidłowe anatomiczne założenie podwiązania LAD. Gdy serce przestanie bić, delikatnie ściśnij narząd kleszczami, aby wydalić resztki krwi i przenieś próbkę do jednorazowej fiolki ze szklaną skorupką o pojemności 2,5 mililitra zawierającej dwa mililitry PBS.Umieścić fiolkę na shakerze na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej, zmieniając roztwór PBS co 10 minut, aż roztwór pozostanie wolny od krwi. Gdy PBS jest czysty, zastąp PBS dwoma mililitrami zimnego 4% paraformaldehydu na czterogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie trzy 10-minutowe płukanie na wytrząsarce z dwoma mililitrami świeżego PBS na pranie. Po ostatnim myciu napełnij fiolkę dwoma mililitrami 4% akrylamidu uzupełnionego 0,5% roztworem VA-044 do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umieść fiolkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Pod koniec polimeryzacji przenieś serce do nowej fiolki ze szklaną skorupką i umyj tkankę serca w dwóch mililitrach świeżego PBS po 10 minut, odświeżając PBS pod koniec każdej inkubacji. Gdy PBS jest czysty, zastąp bufor płuczący dwoma mililitrami roztworu czyszczącego.Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kilka tygodni, aż serce będzie czyste, odświeżając roztwór oczyszczający co dwa do trzech dni. Gdy narząd jest czysty, przemyć próbkę PBS na wytrząsarce, jak pokazano, przed ponownym napełnieniem fiolki świeżym PBS na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp PBS RIMS na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji tkanka jest w pełni oczyszczona. Tkanka powinna stać się przezroczysta po kilku tygodniach. W celu zobrazowania oczyszczonego serca myszy po urodzeniu po indukcji zawału mięśnia sercowego, wypełnij połowę komory specjalnie wykonanego szkiełka depresyjnego PBS i użyj zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie przenieść oczyszczone serce do komory.Wypełnij pozostałą objętość komory PBS. Następnie napełnij komorę PBS, aż powierzchnia cieczy utworzy kopułę nad górną częścią komory i zamontuj szkiełko przykrywkowe przed obrazowaniem tkanki za pomocą mikroskopii konfokalnej zgodnie ze standardowymi protokołami obrazowania. Jeśli nakłucie i rozwarstwienie znajdują się zbyt blisko mostka, serce może nie być w stanie opuścić jamy klatki piersiowej.Jeśli serce nie opuszcza łatwo jamy ustnej, należy uciskać lewą część brzucha, aby ułatwić ten proces. Powikłania mogą wystąpić w wyniku oparcia serca na mięśniach międzyżebrowych. Dlatego ważne jest, aby ograniczyć rozwarstwienie do minimalnego rozmiaru w orientacji poziomej, aby umożliwić wyraźną wizualizację i dostępność LAD.Należy pamiętać, że podwiązanie powierzchowne będzie miało mniej miejsca na regulację w końcowym umieszczeniu szwu i że wiązanie szwów wokół LAD powinno być wykonywane kontrolowanymi, jednostajnymi ruchami. Pod koniec etapu oczyszczania całe serce powinno być konsekwentnie nieprzezroczyste, bez przebarwień pośrodku. Po kilku dniach w roztworze RIMS w temperaturze pokojowej serce powinno zostać całkowicie oczyszczone i można zaobserwować pewne rozszerzenie tkanki.Jak zaobserwowano w ekspresji białka reporterowego tdTomato, nerwy sercowe są głównie powierzchowne, a niektóre populacje znajdują się w warstwie nasierdziowej. Co ważne, potwierdzenie ekspresji białka reporterowego jest zachowane po poddaniu się protokołowi klarowności, jak wykazano. Oczyszczanie i obrazowanie serca 3D zapewnia perspektywę lokalizacji i morfologii populacji komórek serca.To pozwala nam zidentyfikować nowe aspekty we wzorcach komórkowych i interakcjach komórka-komórka.

capturing-cardiac-injury-response-targeted-cell-populations-via

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

Obecny test chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC) wprowadza udoskonalony protokół barwienia TTC, który umożliwia analizę uszkodzeń mięśnia sercowego w mikroskopijnej rozdzielczości, tworząc wysokiej jakości obrazy pozwalające na dokładną i wiarygodną ocenę wielkości zawału oraz żywotności kardiomiocytów na poziomie komórkowym.

Mikroskopowy test chlorku 2,3,5-trifenyltetrazolu do dokładnej i wiarygodnej analizy uszkodzeń mięśnia sercowego

Poznaj metodę trójwymiarowego obrazowania serca do badania proliferacji kardiomiocytów i dynamiki komórkowej po urazie. Technika ta umożliwia śledzenie populacji komórek w procesie regeneracji mięśnia sercowego.

Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Przeglądaj więcej filmów