Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici

Konwencjonalne RT-PCR nie pozwalają na rozróżnienie między sekwencjami sensownymi i antysensownymi, gdy są używane do wykrywania RNA kodowanych przez nakładające się geny. Protokół ten umożliwia wykrywanie specyficznie antysensownych RNA. Zastosowanie biotynylowanych starterów wraz z wysokimi temperaturami denaturacji RNA pozwala na amplifikację antysensownych cDNA, zapobiegając powstawaniu niespecyficznych produktów RT.

Użyliśmy tej metody, aby wykazać, że ASP, zarówno jako antysens RNA, jak i prekursor białka, jest nowym antygenem HIV, czy potencjalnie jest nowym celem terapii HIV. Metodę tę można zastosować do dowolnego układu, w którym można wykryć antysensowne RNA z nakładających się genów. Zacznij od zaprojektowania starterów specyficznych dla pacjenta przy użyciu prowirusowej sekwencji DNA wewnętrznej dla starterów PanASP.

Następnie określ ilościowo RNA i wyeliminuj zanieczyszczenie DNA, traktując próbki DNazą. Przenieść od 0,1 do jednego mikrograma całkowitego RNA do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce PCR. Następnie ustaw odwrotną transkrypcję lub reakcję RT, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Przygotuj endogenne kontrole RT, dodając pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz zamiast odwróconego startera ASP. Włóż płytkę do termocyklera i podgrzewaj RNA do 94 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie natychmiast schłodzić go w lodowatej wodzie przez co najmniej minutę.

Przygotuj mieszaninę reakcyjną w probówce o pojemności 1,5 mililitra, jak opisano w rękopisie tekstowym, a następnie przenieś 17,5 mikrolitra do każdej z studzienek zawierających RNA. Denaturacja RNA musi być przeprowadzona w temperaturze 94 stopni Celsjusza. Bez całkowitej denaturacji mogą wystąpić syntezy niespecyficznych produktów z sensacyjnego RNA, co prowadzi do amplifikacji niespecyficznych cDNA.

Delikatnie wymieszaj zawartość studzienek i inkubuj płytkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie dezaktywuj reakcje, podgrzewając płytkę do 70 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przygotować jeden litr buforu do płukania i wiązania 2X zgodnie z instrukcją rękopisu i przefiltrować roztwór.

Następnie przygotuj 50 mililitrów buforu myjącego i wiążącego 1X przy użyciu wody klasy PCR. Przenieś odpowiednią liczbę kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do 1,5 mililitrowej probówki, a następnie umyj je, dodając równą objętość 2X buforu myjącego i wiążącego i wirując probówkę przez 15 sekund. Umieść probówkę w magnetycznym stojaku separacyjnym i inkubuj ją przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie usuń supernatant bez naruszania kulek i dodaj taką samą objętość buforu do mycia i wiązania 2X, jak początkowa objętość kulek. Wiruj kulki przez 30 sekund i przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny do odpowiedniej liczby rurek o pojemności 1,5 mililitra. Umieść probówki w stojaku do separacji magnetycznej i inkubuj je przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie wyrzuć supernatant i dodaj 50 mikrolitrów 2X buforu do mycia i wiązania. Dodaj 50 mikrolitrów biotynylowanego cDNA do odpowiednich probówek z kulkami i inkubuj je przez 30 minut, delikatnie obracając. Po inkubacji umieść probówki na stojaku do separacji magnetycznej na trzy minuty, a następnie umyj kulki 200 mikrolitrami buforu do mycia i wiązania 1X, a następnie wykonaj trzyminutową inkubację na stojaku do separacji.

Wyrzuć supernatant i powtórz pranie dwukrotnie. Następnie ponownie zawieś kulki w 10 mikrolitrach wody klasy PCR. Przygotuj odpowiednią objętość PCR Master Mix zgodnie ze wskazówkami rękopisu.

Dobrze wymieszaj i szybko odwiruj, a następnie przenieś 49 mikrolitrów na dołek na 96-dołkową płytkę PCR. Ostrożnie wirować probówki z oczyszczonym cDNA przez 15 sekund i dodać jeden mikrolitr zawiesiny do odpowiednich studzienek. Uruchom PCR i oddziel produkty na 1% żelu agarozowym.

Wytnij pasma z żelu i sklonuj amplifikowane produkty do plazmidu PCR 2.1. Następnie sekwencjonuj klony i analizuj każdą sekwencję. Początkowe reakcje RT przeprowadzono z użyciem zwykłego, niebiotynylowanego startera antysensownego i zakończyły się udaną amplifikacją ASP.

Jednak amplifikowano również pasmo o tej samej masie cząsteczkowej i kontrolach startera minus starter. Aby ominąć ten problem, specyficzny starter antysensowny został oznaczony biotynem, a powstałe antysensowne cDNA oczyszczono przed PCR. Umożliwiło to amplifikację sekwencji ASP przy znacznie zmniejszonym zanieczyszczeniu niespecyficznym cDNA w próbach starterowych minus

Dalsza optymalizacja tej metody została osiągnięta poprzez całkowitą denaturację RNA w temperaturze 94 stopni Celsjusza przed RT, a następnie natychmiastowe schłodzenie na lodowatej wodzie, co zaowocowało efektywną amplifikacją pasma ASP i brakiem produktów niespecyficznych. Zmierzono kinetykę RNA ASP i wyizolowano komórki CD4 od trzech osób zakażonych wirusem HIV z wykrywalną wiremią i brakiem terapii po stymulacji anty-CD3/CD28. Kwantyfikacja RNA ASP była również możliwa u pacjentów poddawanych ART, z niewykrywalną wiremią.

U dwóch z trzech pacjentów RNA ASP wykryto w niskich stężeniach w ciągu trzech do pięciu dni po stymulacji. Dwóch pacjentów analizowano pod kątem RNA ASP i env, jednego nieleczonego i jednego leczonego. U nieleczonego pacjenta można było wykryć oba RNA.

U leczonego pacjenta ASP i env były ledwo wykrywalne po kilku dniach stymulacji. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że denaturacja linearyzuje RNA, dzięki czemu struktury drugorzędowe zdolne do przygotowania RT są niszczone. Natomiast mycie kulek wypłukuje niebiotynylowane cDNA.

Po oczyszczeniu cDNA z prawidłową polarnością można przeprowadzić qPCR w celu analizy ekspresji genów. Co więcej, cDNA można również klonować i wykorzystywać do analizy sekwencji. Metoda ta pozwala na badanie genów nakładających się na siebie w przeciwnej orientacji i może być przydatna w wyjaśnianiu regulacji i patogenezy chorób bakterii i wirusów, w tym niektórych rodzajów nowotworów.