Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wykrywać i funkcjonalnie charakteryzować aktywność enzymatyczną ligazów ubikwityny typu E3 typu RING, zarówno in vitro, jak i in planta, za pomocą podejścia mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Wprowadzając mutację w domenie RING poprzez mutagenezę ukierunkowaną, powstały mutant z niedoborem E3 może być testowany równolegle z białkiem typu dzikiego, aby powiązać aktywność enzymatyczną z funkcjonalnością. Wyjaśnienie biochemicznych i mechanicznych podstaw ligaz ubikwityny typu E3 typu RING może znacznie przyczynić się do zrozumienia ich biologicznego znaczenia w rozwoju, sygnalizacji stresu i utrzymaniu homeostazy.

Przy niewielkiej modyfikacji systemu ekspresji in vivo, protokół ten może być stosowany do analizy dowolnej ligazy E3 typu RING, niezależnie od jej pochodzenia. Zacznij od zidentyfikowania konserwatywnych aminokwasów Cys i His w domenie RING i zaprojektowania starterów, które przenoszą interesujący nas kodon podstawienia, otoczony 15 parami zasad po obu stronach miejsca mutacji. Bardzo ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie domeny RING, a w szczególności jej konserwatywnych reszt cysteiny i histydyny.

W tym celu można skorzystać z narzędzi online, takich jak PROSITE. Użyj starterów mutagennych w amplifikacji PCR, aby wprowadzić pożądaną mutację do plazmidu zawierającego interesujący gen, upewniając się, że używasz polimerazy DNA o wysokiej wierności, takiej jak Pfu. Po PCR strawić rodzicielskie metylowane i częściowo zmetylowane DNA pochodzące z E. coli, dodając trzy mikrolitry enzymu restrykcyjnego Dpnl bezpośrednio do reakcji PCR i inkubując go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Oczyść zmutagizowane plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA i wymyj DNA w 50 mikrolitrach wody. Następnie przekształć kompetentne chemicznie komórki DH5-alfa E.coli za pomocą 0,5 mikrolitra odzyskanego mutagenizowanego plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Sklonuj interesujące nas geny RING typu dzikiego i zmutowane RING do wektora pMAL-c2, aby połączyć te geny ze znacznikiem epitopu MBP.

Następnie należy przeprowadzić reakcję ubikwitynacji in vitro o łącznej objętości 30 mikrolitrów, zgodnie z opisem w manuskrypcie, i inkubować mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Zakończ reakcję, mieszając próbkę z 7,5 mikrolitrami buforu ładującego 5x SDS-PAGE i gotując ją przez pięć minut, a następnie oddziel białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 7,5% SDS. Przenieś na membranę PVDF i wykryj ubikwitynację za pomocą western blotting i anty-FLAG.

Wybarwić błonę kolorem Coomassie na niebiesko, aby sprawdzić równe obciążenie badanego białka typu MBP-RING. Szczepy Agrobacterium tumefaciens przenoszące gen znakowany epitopem należy umieścić na pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki selekcyjne. Po dwóch dniach wzrostu w temperaturze 28 stopni Celsjusza wybierz pojedyncze kolonie i hoduj je w płynnym podłożu LB z antybiotykami w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez kolejne 24 godziny.

Przenieś 100 mikrolitrów kultury agrobakteryjnej do trzech mililitrów świeżego LB z antybiotykami i inkubuj kulturę przez dodatkowe cztery do sześciu godzin. Wirować komórki z prędkością 1 800 razy g przez sześć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki trzema mililitrami buforu do płukania. Powtórz płukanie dwa razy, a następnie ponownie zawieś komórki w buforze indukcyjnym i inkubuj je przez dodatkowe 10 do 12 godzin w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 1 800 g przez sześć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą dwóch mililitrów buforu infiltracyjnego i określić stężenie bakterii za pomocą wartości OD600. Agroinfiltruj czterotygodniowe liście Nicotiana benthamiana, delikatnie nakłuwając je igłą, a następnie ręcznie wstrzyknij Agrobacterium za pomocą strzykawki, a następnie okrąż infiltrowany obszar markerem.

Po 36 godzinach zbierz naciekaną tkankę liścia i zmiel ją na drobny proszek z ciekłym azotem. Ponownie zawiesić proszek tkankowy z 300 mikrolitrami buforu do ekstrakcji białek i odwirować go w temperaturze 15 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do świeżej probówki, dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE do końcowego stężenia 1x i gotować próbkę przez pięć minut.

Następnie wykonaj analizę western blot, aby wykryć ubikwitynację planta. Umieść odpowiednie szczepy Agrobacterium tumefaciens zawierające oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania lub pusty wektor i wstrzyknij Agrobacterium na liście Nicotiana benthamiana, jak opisano wcześniej. W przypadku zależnej od E3 degradacji białka substratowego należy postępować zgodnie z opisanym wcześniej protokołem i wykonać western blot z odpowiednimi przeciwciałami w celu wykrycia akumulacji białka w komórkach roślinnych.

W przypadku zahamowania śmierci komórki za pośrednictwem nadwrażliwości zależnej od E3, monitoruj agroinfiltrowane liście pod kątem objawów śmierci komórki dwa do czterech dni po infiltracji. Typowy wynik testu ubikwitynacji in vitro obejmuje rozmaz wielopasmowy rozpoczynający się od masy cząsteczkowej badanego białka i postępujący w górę. Zgodnie z oczekiwaniami, w kontrolach ujemnych, w których brakowało poszczególnych składników lub stosowano MBP, nie wykazano rozmazanego sygnału.

Co więcej, niebieskie zabarwienie membrany PVDF Coomassie wykazało równe obciążenie MBP-RHA1B lub MBP we wszystkich kontrolach. Przetestowano 11 różnych E2 w celu zbadania, jak ubikwitynacja in vitro różni się w zależności od konkretnej kombinacji E2 do E3. Wykryta aktywność ubikwitynacji wahała się od braku sygnału do wielopasmowego rozmazu zaczynającego się od różnych mas cząsteczkowych, co wskazuje na różne wzorce ubikwitynacji.

Wersje RHA1B z mutacją RING i K przetestowano pod kątem ubikwitynacji in vitro i in planta. Brak aktywności enzymatycznej wersji zmutowanej RING jest wspierany przez jej niezdolność do generowania wielopasmowego rozmazu in vitro lub promowania sygnału poliubikwitynacji u planty. Chociaż marginalny sygnał samoubikwitynacji wykryto in vitro dla mutanta K, w planta wykryto tylko ubikwitynację tła, co sugeruje, że reszta K146 jest również niezbędna dla aktywności E3.

W przeciwieństwie do RHA1B typu dzikiego, mutant RING pozbawiony aktywności ligazy E3 nie zakłócał nadwrażliwej odpowiedzi na śmierć komórki. Western blot potwierdził, że Gpa2 nie gromadzi się w obecności RHA1B typu dzikiego, ale mutant RING nie ma wpływu na stabilność białka. Biorąc pod uwagę, że właściwa kombinacja E2-E3 jest niezbędna do reakcji ubikwitynacji, testy ubikwitynacji in vitro powinny być przeprowadzane równolegle z wieloma enzymami E2 reprezentującymi różne klasy E2, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych.

Mutant z niedoborem ligazy E3 ułatwia testowanie interakcji enzym-substrat in vivo. Co więcej, mutant ten często nadaje dominujący negatywny fenotyp, który może być wykorzystany w badaniach nad funkcjonalnym nokautem jako alternatywne podejście do RNAi. Korzystając z tego protokołu, stwierdzono niedawno, że efektor nicieni RHA1B zakłóca sygnalizację immunologiczną roślin w sposób zależny od E3, kierując immunoreceptor roślinny Gpa2 do ubikwitynacji i degradacji.