Name: Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji funkcjonalnej ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta przy użyciu mutagenezy z ukierunkowaniem na konkretne miejsca. Protokół umożliwia badanie aktywności enzymatycznej i jej znaczenia biologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasza praca była możliwa dzięki wsparciu finansowemu z konkurencyjnego grantu Inicjatywy Badań nad Rolnictwem i Żywnością (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Consortium i ISDA Specialty Crop.

1. Mutageneza kierowana na stronę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Zidentyfikuj konserwatywne aminokwasy Cys i His w domenie RING (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) i zaprojektuj startery niosące interesujący nas kodon podstawienia otoczony 15 parami zasad po obu stronach miejsca mutacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Wprowadzić pożądaną mutację poprzez amplifikację plazmidu zawierającego gen będący przedmiotem zainteresowania metodą PCR, przy użyciu starterów mutagennych i polimerazy DNA o wysokiej wierności zawierającej Pfu w 50 μl całkowitej objętości reakcji PCR, jak pokazano w Tabeli 1 i Tabeli 2, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Trawić rodzicielskie metylowane i częściowo zmetylowane DNA pochodzące z Escherichia coli, dodając 3 μl enzymu restrykcyjnego DpnI bezpośrednio do reakcji PCR (etap 1.2) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 h. 
	UWAGA: Metylacja to potranskrypcyjna modyfikacja białka, która jest dodawana do plazmidu wytworzonego i wyizolowanego z bakterii. Nowe kopie plazmidu generowanego przez PCR nie mają metylacji, dlatego nowe kopie pozostaną nienaruszone podczas leczenia DpnI.</li>
	<li>Oczyść zmutagizowane plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA opartego na technologii kolumny wirowej i wymyj DNA za pomocą 50 μl wody.</li>
	<li>Przekształć chemicznie kompetentne komórki DH5α E. coli za pomocą 0,5 μl odzyskanego mutagenizowanego plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, inkubuj kompetentne komórki z DNA na lodzie przez 30 minut, a następnie poddawaj je szokowi cieplnemu przez 20 s w temperaturze 42 °C i ponownie umieść probówki na lodzie na 2 minuty. Inkubować komórki z 500 μl pożywki LB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 250 obr./min, a następnie rozprowadzać je na selektywnych pasztetach.</li>
	<li>Sprawdź pożądaną mutację przez sekwencjonowanie Sanger plazmidów DNA wyizolowanych z E. coli.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie białek rekombinowanych i test ubikwitynacji in vitro
<ol>
	<li>Sklonuj dzikie geny RING i zmutowane geny RING będące przedmiotem zainteresowania do wektora pMAL-c2 (postępuj zgodnie z protokołem producenta; Tabela 3) w celu połączenia tych genów ze znacznikiem epitopu MBP, który umożliwia jednoetapowe oczyszczanie przy użyciu żywicy amylozy. Powstałe konstrukty wprowadzić do szczepu E. coli BL21 zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Hoduj szczep E. coli BL21 zawierający pożądany konstrukt w 50 ml płynnego podłoża LB w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny, aż osiągnie fazę logarytmiczną (OD600 0,4-0,6).</li>
	<li>Dodać IPTG do końcowego stężenia 0,1–1 mM w celu wywołania ekspresji interesującego nas białka rekombinowanego znakowanego MBP i inkubować kulturę E. coli przez 2–3 godziny w temperaturze 28 °C. Po inkubacji umieścić kulturę na lodzie. 
	UWAGA: Wykonaj kroki 2.4–2.13 na lodzie, aby chronić białka przed degradacją.</li>
	<li>Aby sprawdzić skuteczność indukcji, zbierz 1,5 ml indukowanych komórek, odwiruj je w temperaturze 13 000 x g przez 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w 20 μl bufora ładującego 2x SDS-PAGE (24 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glicerol, 4 mM DTT, 0,04% (w/v) błękit bromofenolowy).</li>
	<li>Gotuj próbki przez 5 minut i umieść je na 10% żelu SDS-PAGE. Aby wizualnie ocenić akumulację białka fuzyjnego MBP (masa cząsteczkowa białka będącego przedmiotem zainteresowania + 42,5 kDa MBP), należy wybarwić żel przez 20 minut, mieszając buforem barwiącym Coomassie (50% metanolu, 10% kwasu octowego, 0,1% błękitu Coomassie) i odbarwiając przez noc buforem odbarwiającym (20% metanolu, 10% kwasu octowego).</li>
	<li>Pozostałe komórki E. coli zebrać przez odwirowanie przy 1,350 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 5 ml buforu kolumnowego (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inhibitor proteazy bakteryjnej). 
	UWAGA: Jest to dobre miejsce na zatrzymanie protokołu na noc. Zamrożone komórki można przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozbij komórki E. coli, umieszczając probówkę zawierającą bakterie w łaźni lodowo-wodnej i stosując 10 cykli sonikacji: 10-sekundowa sonikacja przy 30% amperze, a następnie 20-sekundowe przerwy.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zachować supernatant (ekstrakt surowy).</li>
	<li>Przygotuj 500 μl żywicy amylozowej w probówce o pojemności 15 ml. Przemyć żywicę, dodając 10 ml buforu do zimnej kolumny i odwirowując w temperaturze 1 800 x g, 4 °C przez 5 minut. Zrób to 2x.</li>
	<li>Dodać 5 ml surowego ekstraktu do probówki z żywicą amylozową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 10 ml buforu kolumnowego do osadu żywicy i inkubować przez 20 minut. Następnie odwirować przy 1 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Białko fuzyjne należy wypłukać 0,5 ml buforu kolumnowego zawierającego 10 mM maltozy, inkubując próbkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 1,800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zebrać eluowane białko. Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Dializuj 1 ml frakcji białkowej w stosunku do zimnego PBS. Porcję białka przelać do jednorazowych probówek (10–20 μl), aby uniknąć zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda9.</li>
	<li>Ustawić reakcję ubikwitynacji in vitro w całkowitej objętości 30 μl, mieszając 40 ng E1 (np. AtUBA1), 100 ng E2 (np. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg białka typu MBP-RING i 2 μg FLAG-Ub (lub HA-Ub) w buforze ubikwitynacyjnym (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 30 mM fosforan kreatyny, 50 μg/ml fosfokinaza kreatynowa). Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 2 godz 
	UWAGA: Przygotuj 20x bufor ubikwitynacyjny i przechowuj go do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C w małych porcjach do jednorazowego użytku. Fosfokinaza kreatynowa łatwo traci swoją aktywność enzymatyczną, gdy bufor jest wielokrotnie rozmrażany i zamrażany.</li>
	<li>Zakończyć reakcję, mieszając 30 μl próbek z 7,5 μl 5x buforu ładującego SDS-PAGE (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glicerol, 10 mM DTT, 0,1% (w/v) błękit bromofenolowy) i gotując przez 5 min.</li>
	<li>Oddziel białka za pomocą 7,5% elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (SDS-PAGE), a następnie przenieś na błonę PDVF i wykryj ubikwitynację przez Western blot za pomocą anty-FLAG (lub anty-HA).</li>
	<li>Wybarwić membranę PVDF kolorem Coomassie na niebiesko, aby sprawdzić równe obciążenie badanego białka typu MBP-RING.</li>
</ol>
3. Przejściowa ekspresja białka za pośrednictwem Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana i w teście ubikwitynacji planta
<ol>
	<li>Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w odpowiednich smugach przenoszących gen znakowany epitopem (np. HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S, HA-RHA1BK146R, HA-Ub) i pusty wektor jako kontrolę na pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki selekcyjne.</li>
	<li>Po 2 dniach wzrostu w temperaturze 28 °C należy zebrać pojedyncze kolonie i hodować je w płynnym podłożu LB z odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 28 °C/250 obr./min przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Przenieść 100 μl kultury agrobakteryjnej do 3 ml świeżego LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować kulturę przez dodatkowe 4–6 godzin w temperaturze 28 °C z rotacją (250 obr./min) do późnej fazy wzrostu wykładniczego.</li>
	<li>Odwirować komórki agrobakteryjne przy 1,800 x g przez 6 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml buforu do płukania (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH2PO4). Powtórz ten krok 2 razy.</li>
	<li>Po drugim płukaniu ponownie zawiesić komórki w buforze indukcyjnym (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glukozy, 2 mM NaH2PO4, 200 μM acetosyringonu, 37 mM NH4Cl, 5 mM MgSO4,7H 2O, 4 mM KCl, 18 μM FeSO4,7H 2O, 2 mM CaCl2). Inkubować komórki z buforem indukcyjnym przez dodatkowe 10–12 godzin w temperaturze 28 °C. 
	UWAGA: Acetosyringon indukuje transfer T-DNA.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 800 x g przez 6 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml buforu infiltracyjnego (10 mM MES pH 5,5, 200 μM acetosyringonu). 
	UWAGA: Jeśli agrobakterie agregują się po inkubacji z buforem indukcyjnym, pozwól zagregowanym komórkom opaść na dno probówki, pozostawiając ją na stole na kilka minut, a następnie przenieś klarowną zawiesinę Agrobacterium do nowej probówki przed przystąpieniem do kroku 3.6.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie bakterii przy użyciu wartości OD600 (gęstość optyczna przy absorbancji 600 nm). Dostosuj wartości OD600 do żądanych. 
	UWAGA: Zwykle wartość OD600 między 0,2 a 0,4 najlepiej sprawdza się w przypadku pojedynczego odcisku plamy agrobakteryjnej. W przypadku zastosowania kombinacji różnych szczepów agrobakteryjnych, całkowite wartości OD600 szczepów agrobakteryjnych nie powinny przekraczać 1.</li>
	<li>Agroinfiltrować 4-tygodniowe liście N. bethamiana, delikatnie nakłuwając je igłą, a następnie ręcznie wstrzykując Agrobacterium za pomocą strzykawki bez igły. Zakreśl markerem obszar naciekanego liścia (zwykle o średnicy 1–2 cm).</li>
	<li>Zbierz naciekane tkanki liścia 36 godzin po infiltracji. Zmiel tkankę na drobny proszek z ciekłym azotem.</li>
	<li>Zawieszony proszek tkankowy z 300 μl buforu do ekstrakcji białek (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glicerolu, 1% poliwinylopolipirolidonu, 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteazy roślinnej) i odwirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE do końcowego stężenia 1x i gotować przez 5 min.</li>
	<li>Oddziel surowe białka od 10% żeli SDS-PAGE, przenieś na membrany PVDF i sonduj anty-HA w celu wykrycia ubikwitynacji roślin.</li>
</ol>
4. Ustalenie związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją planty
UWAGA: Na przykład, RHA1B wspomaga degradację opornego białka Gpa2 w celu zahamowania śmierci komórek HR. Ten krok pokazuje, jak sprawdzić, czy te zjadliwe działania RHA1B są zależne od E3.
<ol>
	<li>Szczepy Agrobacterium tumefaciens należy umieścić w smugach przenoszących oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania (w tym przykładzie HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S, HA-RHA1BK146R, myc-Gpa2, RBP1) i pusty wektor jako kontrolę. Postępuj zgodnie z krokami 3.1–3.8 dla przygotowania Agrobacterium i wstrzyknięcia na liście N. bethamiana.</li>
	<li>W przypadku zależnej od E3 degradacji białka substratowego należy postępować zgodnie z krokami 3.9–3.12 i przeprowadzić Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał w celu wykrycia akumulacji białka w komórkach roślinnych (np. anty-HA i anty-MYC).</li>
	<li>W przypadku zahamowania śmierci komórki za pośrednictwem odpowiedzi nadwrażliwości zależnej od E3 (HR), należy monitorować liście agroinfiltrowane pod kątem objawów śmierci komórek HR 2-4 dni po infiltracji.</li>
</ol>

<ol><li>Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gysteine-rich+sequence+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gysteine-rich sequence motif.</a> Cell. 64, 483-484 (1991).</li>
<li>Borden, K. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+fingers+and+B-boxes%3A+Zinc-binding+protein-protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains.</a> Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).</li>
<li>Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+C3HC4+Domain+by+1H-nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%3A+A+New+Structural+Class+of+Zinc-finger%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger.</a> Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).</li>
<li>Borden, K. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solution+structure+of+the+RING+finger+domain+from+the+acute+promyelocytic+leukaemia+proto-oncoprotein+PML%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML.</a> The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).</li>
<li>Lorick, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+fingers+mediate+ubiquitin-conjugating+enzyme+%28E2%29-dependent+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).</li>
<li>Jiménez-López, D., Muñóz-Belman, F., González-Prieto, J. M., Aguilar-Hernández, V., Guzmán, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+plant+RING+E3+ubiquitin+ligases+revisited%3A+New+groups+counting+gene+families+and+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes.</a> PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).</li>
<li>Sacco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cyst+Nematode+SPRYSEC+Protein+RBP-1+Elicits+Gpa2-+and+RanGAP2-Dependent+Plant+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2- and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death.</a> PLoS Pathogens. 5, 1-14 (2009).</li>
<li>Kud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potato+cyst+nematode+effector+RHA1B+is+a+ubiquitin+ligase+and+uses+two+distinct+mechanisms+to+suppress+plant+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling.</a> PLoS Pathogens. 15, 1007720(2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Sigrist, C. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+continuing+developments+at+PROSITE%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">New and continuing developments at PROSITE.</a> Nucleic Acids Research. 41, 344-347 (2013).</li>
<li>Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+RBR+E3+ligase+ubiquitin+transfer+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms.</a> EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).</li>
<li>Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING-type+E3+ligases%3A+Master+manipulators+of+E2+ubiquitin-conjugating+enzymes+and+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).</li>
<li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SINAT5+promotes+ubiquitin-related+degradation+of+NAC1+to+attenuate+auxin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals.</a> Nature. 419, 167-170 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyjaśnienie biochemicznych i mechanistycznych podstaw ligaz ubikwityny typu E3 RING może znacznie przyczynić się do naszego zrozumienia ich biologicznego znaczenia w rozwoju, sygnalizacji stresu i utrzymaniu homeostazy. Opisany tutaj protokół łączy podejście mutagenezie z badaniami funkcjonalnymi in vitro i in planta. Wprowadzając substytucję pojedynczego aminokwasu w konserwatywnych resztach domeny RING poprzez mutagenezę bezpośrednią, powstały mutant z niedoborem E3 można testować równolegle z białkiem typu dzikiego, aby powiązać aktywność enzymatyczną z funkcjonalnością.
Bardzo ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie domeny RING, a w szczególności jej konserwatywnych pozostałości Cys i His His. W tym celu można skorzystać z narzędzi internetowych, takich jak PROSITE10. Aby zdestabilizować domenę RING odpowiedzialną za rekrutację enzymu E2, Cys jest zwykle podstawiany przez Ser, który jest jego najbliższym strukturalnym zamiennikiem pozbawionym zdolności do tworzenia wiązania dwusiarczkowego używanego do koordynacji. Lorick i in. wykazali, że mutacja w którejkolwiek z tych krytycznych reszt Cys zniosłaby aktywność ubikwitynacyjną pojedynczej podjednostki RING ligazE3 5. Chociaż niektóre reszty Cys są również ważne dla wielojednostkowych kompleksów ligazy E3 zawierających białka typu RING, ze względu na wieloaspektową i dynamiczną trójwymiarową strukturę tych kompleksów ubikwitynacji i różną rolę białek typu RING, pojedyncze substytucje konserwatywnych reszt w domenie RING w wielojednostkowej ligazie E3 nie odniosły sukcesu w generowaniu fenotypu11 z niedoborem ligazy.
W przypadku mutagenezy ukierunkowanej na miejsce stwierdziliśmy, że użycie mniejszych wektorów plazmidowych i niższych cykli amplifikacji zwykle dawało wyższą skuteczność mutagenezy. Enzym Pfu można zastąpić dowolną inną polimerazą DNA o wysokiej wierności i procesowości. Ponadto, jeśli interesujący nas gen zawiera rzadkie kodony, inne barwienie E. coli , Rosetta, może być użyte do osiągnięcia wyższej wydajności rekombinowanego białka. Dodatkowo, zarówno czas inkubacji, jak i temperatura do indukcji IPTG mogą być jeszcze bardziej zoptymalizowane. Niższe temperatury zmniejszają tempo podziału E. coli , co może być korzystne dla ekspresji niektórych białek. Chociaż wyższe stężenie IPTG może poprawić ekspresję białka, hamuje również procesy podziału E. coli i nie jest zalecane.
Ligazy E3 z pojedynczą podjednostką RING nie tylko działają jako rusztowanie molekularne, które umieszcza produkt pośredni E2-Ub w bliskiej odległości od substratu, ale także stymulują aktywność przenoszenia ubikwityny przez pokrewne im E2. Ponadto, biorąc pod uwagę, że kombinacja E2/E3 jest ważna dla długości i wiązań łańcucha poliubikwityny, który decyduje o losie zmodyfikowanego substratu, wszelkie rozważania dotyczące E3 typu RING muszą obejmować ich partnerów enzymatycznych, E2s12. Jak pokazano na rysunku 3B, nie wszystkie badane E2 są kompatybilne z ligazą RHA1B. W związku z tym testy ubikwitynacji in vitro powinny być przeprowadzane równolegle z wieloma enzymami E2 reprezentującymi różne klasy E2, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych.
Przedstawiono test enzymatyczny in vitro, który wykrywa zdolność badanych białek typu RING do samoubikwitynacji. Jednak przy niewielkich modyfikacjach protokół ten można łatwo dostosować do wykrywania ubikwitynacji substratów in vitro. W tym celu mieszaninę ubikwitynacji in vitro z kroku 2.15 należy uzupełnić białkiem rekombinowanym potencjalnego substratu ligazy E3 (500 ng). Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 30 °C, ubikwitynowane białko powinno być wychwycone przy użyciu 15 μl matrycy powinowactwa anty-HA (jeśli stosuje się HA-Ub lub matrycy powinowactwa anty-FLAG, jeśli stosuje się FLAG-Ub) przez mieszanie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Po 4-krotnym umyciu kulek zimnym buforem do płukania Ub (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), wyrzuć wszystko oprócz 40 μL buforu i przejdź do kroku 2.16. Sygnał ubikwitynacji, wykrywany przez przeciwciała specyficzne odpowiednio dla Ub znakowanego epitopem i substratu, wyłaniający się z masy cząsteczkowej białka substratu, potwierdza specyficzność substratu/enzymu.
Ponadto identyfikacja substratów ligazy E3 in vivo zwykle wiąże się z wieloma wyzwaniami wynikającymi z przejściowej interakcji enzym-substrat i szybkiej degradacji ubikwitynowanego białka docelowego. Użycie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim celem, ale już go nie ubikwitynuje13, jest bardzo przydatną alternatywą dla dodania inhibitora proteasomalnego MG132, który nie zawsze wystarczająco zakłóca funkcję proteasomu 26S.
Wspólną cechą ligaz E3 typu RING jest tendencja do tworzenia i funkcjonowania jako homo- i/lub heterodimery. Co ciekawe, substytucja w konserwatywnych resztach domeny RING jest zwykle związana z dominującym ujemnym fenotypem, w którym zmutowana ligaza E3 typu RING blokuje aktywność enzymatyczną natywnego białka typu dzikiego13. Tak więc nadekspresja mutantów RING w planta może być alternatywnym podejściem do wyeliminowania genu ligazy E3.

Zdecydowana większość ligaz ubikwityny E3 należy do białek typu RING (Really Interesting New Gene). Domena palca serdecznego została pierwotnie zidentyfikowana przez Freemonta i wsp. 1 i funkcjonalnie opisany jako domena pośrednicząca w interakcji białko-białko2. Kanoniczny palec serdeczny jest specjalnym rodzajem domeny koordynującej zdefiniowanej jako konsensusowa sekwencja ośmiu konserwatywnych Cys (C) i His (H) specyficznie rozmieszczonych przez inne reszty aminokwasowe (X), C-X 2-C-X9-39-C-X 1-3-H-X 2-3-C/H-X 2-C-X 4-48-C-X 2-C. Dwa jony Zn2+ są stabilizowane przez reszty rdzenia C i H poprzez unikalną topologię "krzyżowego klamrowania", przy czym C1/C2 i C/H5/C6 koordynują pierwszy jon Zn2+, podczas gdy C3/H4 i C7/C8 wiążą drugi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)3,4. W zależności od obecności C lub H w piątym miejscu koordynacyjnym Zn2+ zdefiniowano dwie podklasy kanoniczne białek palca serdecznego: C3HC4 i C3H2C3 (odpowiednio RING-HC i RING-H2). Ponieważ domena RING ligazy ubikwityny E3 pośredniczy w interakcji między enzymami sprzęgającymi E2 a substratami, wykazano, że mutacja tych niezbędnych reszt C i H zakłóca aktywność ligazy5. Opisano dodatkowe pięć mniej powszechnych podklas ligaz RING E3 (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T i RING-G)6. Ligazy ubikwityny E3 typu RING można dalej podzielić na proste i złożone enzymy E3. Proste ligazy RING E3 z pojedynczą podjednostką zawierają zarówno miejsce rozpoznawania substratu, jak i domenę RING wiążącą E2. W przeciwieństwie do tego, wielopodjednostkowy kompleks E3 typu RING albo rekrutuje substrat lub pośredniczy w wiązaniu pośredniego E2-ubikwityny z kompleksem E3. Pozostałości Lys w domenie RING, które służą jako główne miejsce przyłączenia ubikwityny do samoubikwitynacji, mogą być również ważne dla aktywności ligazy E3.
Nie wszystkie białka zawierające RING funkcjonują jako ligazy E3. W związku z tym przewidywania bioinformatyczne dotyczące domeny palca serdecznego i zdolności do ubikwitynacji białek zależnych od E2 muszą zostać zweryfikowane biochemicznie i powiązane z biologiczną rolą badanego białka. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół określający, w jaki sposób wykrywać i funkcjonalnie charakteryzować aktywność enzymatyczną ligaz ubikwityny RING typu E3, zarówno in vitro, jak i in planta, za pomocą podejścia mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Reprezentatywne wyniki z tego rurociągu przedstawiono dla ligazy E3 RHA1B typu RING. RHA1B jest białkiem efektorowym wytwarzanym przez pasożytniczego nicienia cystowego Globodera pallida w celu tłumienia odporności roślin i manipulowania morfologią komórek korzeniowych roślin. Aby chronić się przed inwazją patogenów/pasożytów, rośliny wyewoluowały domenę wiążącą nukleotydy i receptory immunologiczne bogate w powtórzenia leucyny (NB-LRR), które wykrywają obecność patogenu lub pasożyta iw konsekwencji rozwijają reakcję nadwrażliwości (HR), która jest formą szybkiej i zlokalizowanej śmierci komórki występującej w miejscu infekcji w celu zatrzymania kolonizacji patogenów. Jednym z takich receptorów immunologicznych jest białko Gpa2 ziemniaka, które nadaje odporność na niektóre izolaty G. pallida (populacje polowe D383 i D372)7.
Korzystając z przedstawionych protokołów, ostatnio odkryto, że RHA1B zakłóca sygnalizację immunologiczną roślin w sposób zależny od E3, kierując immunoreceptor roślinny Gpa2 do ubikwitynacji i degradacji8.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>żywica amylozowa</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy bakteryjnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromfenolowy</td><td>VWR</td><td>97061-690</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>model: Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue</td><td>VWR</td><td>97061-738</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA</td><td>ZYMO BADANIA</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; kompetentne komórki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324504</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7002</td><td></td></tr><tr><td>FLAG-UB</td><td>BostonBiochem</td><td>U-120</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>VWR</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HA-UB</td><td>BostonBiochem</td><td>U-110</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>VWR</td><td>Model: 10153-318</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>model: 1525 Cyfrowy inkubator</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubatora</td><td>Thermo Fisher Model naukowy</td><td>: MaxQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Roche</td><td>10724815001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Liquide</td><td>azot uniwersytecki chemia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maltoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63418</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Model Eppendorf</td>: <td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw</td> <td>do oczyszczania plazmidu MiniprepZYMO RESEARCH</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>monoklonalne anty-MYC</td><td></td> Zaprawa WH0004609M2 <td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89038-144</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Model naukowy</td><td>: 2000 Igła spektrofotometru</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-5C</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>Model: C1000</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek</td><td>VWR</td><td>89038-160</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitora proteazy roślinnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>pMAL-c2</td><td>NEB</td><td>N8076S</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopolipirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>1614363</tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica Sonicators</td><td>model: Q125</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaza</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny ring-type e3 in vitro i in planta

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubikwitynacja, jako posttranslacyjna modyfikacja białek, odgrywa ważną rolę regulacyjną w homeostazie komórek eukariotycznych. Kowalencyjne przyłączenie 76 aminokwasowych modyfikatorów ubikwityny do białka docelowego, w zależności od długości i topologii łańcucha poliubikwityny, może skutkować różnymi wynikami, od degradacji białka po zmiany w lokalizacji i / lub aktywności zmodyfikowanego białka. Trzy enzymy sekwencyjnie katalizują proces ubikwitynacji: enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym sprzęgający ubikwitynę E2 i ligaza ubikwityny E3. Ligaza ubikwityny E3 określa specyficzność substratową i dlatego stanowi bardzo interesujący temat badań. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowe podejście do badania związku między aktywnością enzymatyczną a funkcją ligazy ubikwityny typu E3 typu RING. Ten czteroetapowy protokół opisuje: 1) jak wygenerować mutanta z niedoborem ligazy E3 poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce ukierunkowaną na konserwatywną domenę RING; 2–3) jak badać aktywność ubikwitynacji zarówno in vitro, jak i in planta; 4) jak powiązać te analizy biochemiczne z biologicznym znaczeniem badanego białka. Wytwarzanie mutanta z niedoborem ligazy E3, który nadal oddziałuje ze swoim substratem, ale już go nie ubikwitynuje w celu degradacji, ułatwia testowanie interakcji enzym-substrat in vivo. Co więcej, mutacja w konserwatywnej domenie RING często nadaje dominujący negatywny fenotyp, który może być wykorzystany w badaniach funkcjonalnego nokautu jako alternatywne podejście do podejścia opartego na interferencji RNA. Nasze metody zostały zoptymalizowane pod kątem biologicznej roli efektora RHA1B pasożytniczego nicieni pasożytniczych roślin, który przejmuje kontrolę nad systemem ubikwitynacji gospodarza w komórkach roślinnych w celu promowania pasożytnictwa. Przy niewielkiej modyfikacji systemu ekspresji in vivo, protokół ten można zastosować do analizy dowolnej ligazy E3 typu RING, niezależnie od jej pochodzenia.

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki dla protokołu wykorzystanego do badania jednowarstwowej ligazy ubikwitynowej E3 RHA1B, która posiada domenę typu RING-H2 przewidywaną przez PROSITE (aminokwasy 132–176)10. Jak pokazano na Rysunku 1, aby uzyskać białko mutanta z deficytem E3, należy poddać mutagenezie co najmniej jedną z ośmiu konserwatywnych reszt C lub H w domenie RING (Rysunek 1A) (Rysunek 1B). W związku z tym, w pierwszym kroku wygenerowano dwie wersje mutanta RHA1B: RHA1BC135S (podstawienie Cys przez Ser w konserwatywnej reszcie C3 domeny RING) oraz RHA1BK146R (podstawienie Lys przez Arg w jedynej reszcie Lys obecnej w RHA1B). Chociaż jednowarstwowe ligazy E3 pośredniczą w przenoszeniu ubikwityny z przenoszącego ją E2 na substrat, zamiast bezpośrednio oddziaływać z ubikwityną, autoubikwitynacja E3 w miejscu Lys może być wymagana dla jej maksymalnej aktywności enzymatycznej.
Wyniki analizy Western blot przedstawione na Rysunku 2A ukazują typowy pozytywny wynik testu ubikwitynacji in vitro, z charakterystycznym rozmazaniem (smear) z wieloma prążkami, rozpoczynającym się od masy cząsteczkowej badanego białka (np. RHA1B połączone z MBP ~100 kDa) i rozszerzającym się w górę. Przeciwciało anty-HA rozpoznało Ub z tagiem HA wbudowane w łańcuchy poliubikwitynacji o różnych długościach, co stworzyło typowy dla ubikwitynacji obraz rozmazania przypominający drabinę. Aby potwierdzić pozytywne wyniki, na Rysunku 2A przedstawiono również wszystkie istotne kontrole negatywne, w których brakowało poszczególnych składników (E1, E2, Ub lub MBP-RHA1B) lub w których zastosowano MBP jako kontrolę; w tych przypadkach sygnał rozmazania ubikwitynacji nie wystąpił. Ponadto barwienie błony PVDF błękitem Coomassie wykazało równą ilość naniesionego MBP-RHA1B lub MBP we wszystkich kontrolach.
Rycina 2B przedstawia, jak wyniki ubikwitynacji in vitro różniły się w zależności od konkretnej kombinacji E2/E3. W tym przykładzie przetestowano 11 różnych enzymów E2 reprezentujących 10 różnych rodzin E2. Wykryta aktywność ubikwitynacji wahała się od braku sygnału (brak rozmycia) do wielopasmowego rozmycia rozpoczynającego się od różnych mas cząsteczkowych, co wskazuje na różne wzorce ubikwitynacji.
Rysunek 3 przedstawia wyniki testu ubikwitynacji dla wersji z mutacjami w domenach RING i K badanego białka. Brak aktywności enzymatycznej RHA1BC135S potwierdza jego niezdolność do generowania wielopasmowego rozmazania in vitro (Rysunek 3A) oraz do promowania sygnału polibikwitynacji in planta (Rysunek 3B). Warto zauważyć, że sama nadekspresja Ub z tagiem HA in planta spowodowała ubikwitynację na poziomie podstawowym we wszystkich badanych próbkach, w tym w kontroli wektorowej, w przeciwieństwie do silnego sygnału ubikwitynacji wynikającego z aktywności enzymatycznej RHA1B typu dzikiego. Co więcej, analiza mutanta RHA1BK146R sugeruje, że reszta K146 jest również niezbędna dla aktywności E3 białka RHA1B. Chociaż in vitro wykryto marginalny sygnał autoubikwitynacji (Rysunek 3A), test in planta wykazał, że mutant wykazuje deficyt aktywności E3 (Rysunek 3B, wykryto jedynie sygnał ubikwitynacji tła).
Po wygenerowaniu i biochemicznej walidacji mutanta z niedoborem E3 można zaplanować badania funkcjonalne w celu określenia biologicznej roli związanej z E3 badanej ligazy ubikwityny RING E3. W przypadku RHA1B efektor ten u nicieni tłumi sygnalizację odpornościową roślin, co objawia się hamowaniem śmierci komórkowej HR wywołanej przez Gpa2. Jak przedstawiono na Rysunku 4A, w przeciwieństwie do typu dzikiego RHA1B, mutant RHA1BC135S pozbawiony aktywności ligazy E3 nie zakłócał śmierci komórkowej HR. Biorąc pod uwagę, że najczęstszym wynikiem ubikwitynacji białka jest jego degradacja zapśredniczona przez proteasom, mutacje znajdujące się w domenie RING mogą być również wykorzystane do weryfikacji zależnej od E3 zdolności do wywoływania degradacji ich bezpośrednich i/lub pośrednich substratów. Zatem, co istotne, wyniki Western blotting na Rysunku 4B potwierdzają, że Gpa2 nie ulegał akumulacji w obecności typu dzikiego RHA1B, natomiast RHA1BC135S nie miał wpływu na stabilność białka Gpa2.
<img alt="Schemat mutagenezy celowanej; etapy z użyciem starterów, PCR, metylacji, oczyszczania plazmidów, E. coli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie zasady i etapów mutagenezy celowanej. (A) Domena RING-CH/H2 z zaznaczonymi konserwatywnymi aminokwasami Cys i His. (B) Przykład projektu starterów mutagennych. (C) Etapy mutagenezy celowanej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test ubikwitynacji białek; western blot i barwienie Coomassie; detekcja MBP-RHA1B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywny test ubikwitynacji in vitro. (A) Górny żel przedstawia test ubikwitynacji obejmujący wszystkie kontrole negatywne, a dolny żel pokazuje równą ilość naniesionego materiału. (B) Zakres oczekiwanych wyników w zależności od enzymów E2. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kud i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza Western blot wykazująca ubikwitynację MBP-RHA1B; wyniki eksperymentu dotyczącego oddziaływań białkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki testu ubikwitynacji dla mutantów RING i K (RHA1BC135S oraz RHA1BK146R). (A) Wyniki ubikwitynacji in vitro dla RHA1BC135S oraz RHA1BK146R. (BWyniki analizy ubikwitynacji in planta dla RHA1BC135S oraz RHA1BK146RRycina została zmodyfikowana na podstawie opracowania Kud i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Test odporności roślin na choroby (A) oraz analiza Western blot (B) w celu oceny ekspresji białek; biologia molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne badanie funkcjonalne funkcji biologicznych zależnych od E3. Przykład badań funkcjonalnych wykazujących funkcję biologiczną zależną od E3. (A) zależna od E3 supresja śmierci komórkowej typu HR oraz (B) degradacja roślinnego immunoreceptora Gpa2. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kud et al8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Przygotowanie reakcji PCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>1 µL</td>
			<td>plazmid (~100 ng)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>1,5 µL</td>
			<td>forwardowy starter mutagenny (10 µM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>1,5 µL</td>
			<td>reverse'owy starter mutagenny (10 µM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>1 µL</td>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>5 µL</td>
			<td>bufor (10x)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>1 µL</td>
			<td>polimeraza Ultra Pfu (2,5 U/µl)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>39 µL</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td>50 µL</td>
			<td>OBJĘTOŚĆ CAŁKOWITA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Konfiguracja reakcji PCR
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">program termocyklera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>95 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>95 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>60 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>72 ˚C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>powtórz kroki 2-4 30 razy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>72 ˚C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Program termocyklera PCR
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">przygotowanie reakcji ligacji dla przykładu RHA1B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 µL</td>
			<td colspan="2">zlinearyzowany wektor pMAL-c2::MBP otrzymany poprzez trawienie enzymami BamHI i SalI (60 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 µL</td>
			<td colspan="2">Wstawka RHA1B/RHA1BC135S lub RHA1BK146R poddana trawieniu BamHI i SalI (25 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µL</td>
			<td colspan="2">Bufor do ligazy T4 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 µL</td>
			<td colspan="2">ligaza T4 (400 J/µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µL</td>
			<td colspan="2">OBJEKTOŚĆ CAŁKOWITA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Konfiguracja reakcji ligacji dla przykładu RHA1B.

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wykrywać i funkcjonalnie charakteryzować aktywność enzymatyczną ligazów ubikwityny typu E3 typu RING, zarówno in vitro, jak i in planta, za pomocą podejścia mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Wprowadzając mutację w domenie RING poprzez mutagenezę ukierunkowaną, powstały mutant z niedoborem E3 może być testowany równolegle z białkiem typu dzikiego, aby powiązać aktywność enzymatyczną z funkcjonalnością. Wyjaśnienie biochemicznych i mechanicznych podstaw ligaz ubikwityny typu E3 typu RING może znacznie przyczynić się do zrozumienia ich biologicznego znaczenia w rozwoju, sygnalizacji stresu i utrzymaniu homeostazy.Przy niewielkiej modyfikacji systemu ekspresji in vivo, protokół ten może być stosowany do analizy dowolnej ligazy E3 typu RING, niezależnie od jej pochodzenia. Zacznij od zidentyfikowania konserwatywnych aminokwasów Cys i His w domenie RING i zaprojektowania starterów, które przenoszą interesujący nas kodon podstawienia, otoczony 15 parami zasad po obu stronach miejsca mutacji. Bardzo ważne jest prawidłowe zidentyfikowanie domeny RING, a w szczególności jej konserwatywnych reszt cysteiny i histydyny.W tym celu można skorzystać z narzędzi online, takich jak PROSITE. Użyj starterów mutagennych w amplifikacji PCR, aby wprowadzić pożądaną mutację do plazmidu zawierającego interesujący gen, upewniając się, że używasz polimerazy DNA o wysokiej wierności, takiej jak Pfu. Po PCR strawić rodzicielskie metylowane i częściowo zmetylowane DNA pochodzące z E. coli, dodając trzy mikrolitry enzymu restrykcyjnego Dpnl bezpośrednio do reakcji PCR i inkubując go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Oczyść zmutagizowane plazmidy za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA i wymyj DNA w 50 mikrolitrach wody. Następnie przekształć kompetentne chemicznie komórki DH5-alfa E.coli za pomocą 0,5 mikrolitra odzyskanego mutagenizowanego plazmidowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Sklonuj interesujące nas geny RING typu dzikiego i zmutowane RING do wektora pMAL-c2, aby połączyć te geny ze znacznikiem epitopu MBP.Następnie należy przeprowadzić reakcję ubikwitynacji in vitro o łącznej objętości 30 mikrolitrów, zgodnie z opisem w manuskrypcie, i inkubować mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Zakończ reakcję, mieszając próbkę z 7,5 mikrolitrami buforu ładującego 5x SDS-PAGE i gotując ją przez pięć minut, a następnie oddziel białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym 7,5% SDS. Przenieś na membranę PVDF i wykryj ubikwitynację za pomocą western blotting i anty-FLAG.Wybarwić błonę kolorem Coomassie na niebiesko, aby sprawdzić równe obciążenie badanego białka typu MBP-RING. Szczepy Agrobacterium tumefaciens przenoszące gen znakowany epitopem należy umieścić na pożywce LB zawierającej odpowiednie antybiotyki selekcyjne. Po dwóch dniach wzrostu w temperaturze 28 stopni Celsjusza wybierz pojedyncze kolonie i hoduj je w płynnym podłożu LB z antybiotykami w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 250 obr./min przez kolejne 24 godziny.Przenieś 100 mikrolitrów kultury agrobakteryjnej do trzech mililitrów świeżego LB z antybiotykami i inkubuj kulturę przez dodatkowe cztery do sześciu godzin. Wirować komórki z prędkością 1 800 razy g przez sześć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki trzema mililitrami buforu do płukania. Powtórz płukanie dwa razy, a następnie ponownie zawieś komórki w buforze indukcyjnym i inkubuj je przez dodatkowe 10 do 12 godzin w temperaturze 28 stopni Celsjusza.Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 1 800 g przez sześć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą dwóch mililitrów buforu infiltracyjnego i określić stężenie bakterii za pomocą wartości OD600. Agroinfiltruj czterotygodniowe liście Nicotiana benthamiana, delikatnie nakłuwając je igłą, a następnie ręcznie wstrzyknij Agrobacterium za pomocą strzykawki, a następnie okrąż infiltrowany obszar markerem.Po 36 godzinach zbierz naciekaną tkankę liścia i zmiel ją na drobny proszek z ciekłym azotem. Ponownie zawiesić proszek tkankowy z 300 mikrolitrami buforu do ekstrakcji białek i odwirować go w temperaturze 15 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do świeżej probówki, dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE do końcowego stężenia 1x i gotować próbkę przez pięć minut.Następnie wykonaj analizę western blot, aby wykryć ubikwitynację planta. Umieść odpowiednie szczepy Agrobacterium tumefaciens zawierające oznaczone geny będące przedmiotem zainteresowania lub pusty wektor i wstrzyknij Agrobacterium na liście Nicotiana benthamiana, jak opisano wcześniej. W przypadku zależnej od E3 degradacji białka substratowego należy postępować zgodnie z opisanym wcześniej protokołem i wykonać western blot z odpowiednimi przeciwciałami w celu wykrycia akumulacji białka w komórkach roślinnych.W przypadku zahamowania śmierci komórki za pośrednictwem nadwrażliwości zależnej od E3, monitoruj agroinfiltrowane liście pod kątem objawów śmierci komórki dwa do czterech dni po infiltracji. Typowy wynik testu ubikwitynacji in vitro obejmuje rozmaz wielopasmowy rozpoczynający się od masy cząsteczkowej badanego białka i postępujący w górę. Zgodnie z oczekiwaniami, w kontrolach ujemnych, w których brakowało poszczególnych składników lub stosowano MBP, nie wykazano rozmazanego sygnału.Co więcej, niebieskie zabarwienie membrany PVDF Coomassie wykazało równe obciążenie MBP-RHA1B lub MBP we wszystkich kontrolach. Przetestowano 11 różnych E2 w celu zbadania, jak ubikwitynacja in vitro różni się w zależności od konkretnej kombinacji E2 do E3. Wykryta aktywność ubikwitynacji wahała się od braku sygnału do wielopasmowego rozmazu zaczynającego się od różnych mas cząsteczkowych, co wskazuje na różne wzorce ubikwitynacji.Wersje RHA1B z mutacją RING i K przetestowano pod kątem ubikwitynacji in vitro i in planta. Brak aktywności enzymatycznej wersji zmutowanej RING jest wspierany przez jej niezdolność do generowania wielopasmowego rozmazu in vitro lub promowania sygnału poliubikwitynacji u planty. Chociaż marginalny sygnał samoubikwitynacji wykryto in vitro dla mutanta K, w planta wykryto tylko ubikwitynację tła, co sugeruje, że reszta K146 jest również niezbędna dla aktywności E3.W przeciwieństwie do RHA1B typu dzikiego, mutant RING pozbawiony aktywności ligazy E3 nie zakłócał nadwrażliwej odpowiedzi na śmierć komórki. Western blot potwierdził, że Gpa2 nie gromadzi się w obecności RHA1B typu dzikiego, ale mutant RING nie ma wpływu na stabilność białka. Biorąc pod uwagę, że właściwa kombinacja E2-E3 jest niezbędna do reakcji ubikwitynacji, testy ubikwitynacji in vitro powinny być przeprowadzane równolegle z wieloma enzymami E2 reprezentującymi różne klasy E2, aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych.Mutant z niedoborem ligazy E3 ułatwia testowanie interakcji enzym-substrat in vivo. Co więcej, mutant ten często nadaje dominujący negatywny fenotyp, który może być wykorzystany w badaniach nad funkcjonalnym nokautem jako alternatywne podejście do RNAi. Korzystając z tego protokołu, stwierdzono niedawno, że efektor nicieni RHA1B zakłóca sygnalizację immunologiczną roślin w sposób zależny od E3, kierując immunoreceptor roślinny Gpa2 do ubikwitynacji i degradacji.

functional-characterization-ring-type-e3-ubiquitin-ligases-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Opisujemy metodę generowania indukowalnych stabilnych linii komórkowych oznaczonych znacznikami lokalizacji i powinowactwa (LAP) do badania funkcji białek, czasoprzestrzennej lokalizacji subkomórkowej i sieci interakcji białko-białko.

Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Poznaj metodę charakteryzacji funkcjonalnej ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta przy użyciu mutagenezy z ukierunkowaniem na konkretne miejsca. Protokół umożliwia badanie aktywności enzymatycznej i jej znaczenia biologicznego.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Przeglądaj więcej filmów