Ocena autoregulacji przepływu krwi w mózgu u szczura za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego

Protokół ten idealnie nadaje się do oceny zdolności mikrokrążenia mózgowego do regulowania własnego przepływu krwi podczas zmian ciśnienia krwi w normalnych i patologicznych warunkach. LDF zapewnia stosunkowo nieinwazyjną metodę ciągłego monitorowania przepływu krwi w mózgu w różnych warunkach, co nie jest możliwe przy użyciu innych metod. Laserowa przepływomierz dopplerowska może być stosowana do nieinwazyjnej oceny przepływu krwi.

Na przykład, aby ocenić wpływ diety bogatej w sól na upośledzoną regulację przepływu krwi u zdrowych młodych kobiet. LDF umożliwia łatwe monitorowanie przepływu krwi w wielu różnych łożyskach naczyniowych ludzi i zwierząt i może być stosowany w wielu różnych badaniach. Procedurę wraz z Adrienne Allen zademonstruje Megan Stumpf, moja technolog badawcza i kierowniczka laboratorium.

Przed rozpoczęciem zabiegu umieść szczura na krążącym kocu wodnym utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania u znieczulonego szczura eksperymentalnego. Nałóż maść na oczy zwierzęcia i ogol górną część czaszki, brzuszną część szyi i trójkąty udowe. Usuń wszelkie wypadające włosy z odsłoniętej skóry.

I zdezynfekuj skórę alkoholem. Przenieś szczura na poduszkę grzewczą z pompą cyrkulacyjną ciepłej wody. I użyj taśmy medycznej, aby tymczasowo zabezpieczyć szczura w pozycji leżącej.

Napełnij dwie kaniule PE 50 jedną jednostką na ml heparyny w izotonicznym roztworze chlorku sodu. I skośnie otwarty koniec cewników nożyczkami chirurgicznymi, aby ułatwić wprowadzenie do tętnic. Po dokładnym oddzieleniu tętnic udowych od otaczającej tkanki pod mikroskopem preparacyjnym, należy podwiązać dystalny koniec izolowanego odcinka tętnicy udowej i założyć dwa dodatkowe szwy wokół środkowego i bliższego końca tętnicy bez zaciskania węzłów.

Włóż drut w kształcie litery V wykonany ze spinacza do papieru pod tętnicę, aby zatkać naczynie, aż kaniula zostanie zabezpieczona. Następnie za pomocą nożyczek vannas wykonaj małe nacięcie w tętnicy udowej w pobliżu dystalnego podwiązania. Włóż skośny koniec kaniuli do nacięcia i wsuń kaniulę do tętnicy udowej.

Wyjmij spinacz do papieru. Zaciśnij węzeł w środkowej ligaturze nad kaniulą, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu. Zwolnij napięcie na ligaturze podnoszącej, a następnie napnij bliższą ligaturę i zamknij nacięcie.

Natychmiast po założeniu kaniul należy umieścić zwierzę w pozycji mostkowej. I zabezpiecz głowę w urządzeniu stereotaktycznym, uważając, aby nie przesunąć cewników. Wykonaj eliptyczne nacięcie w skórze pokrywającej czaszkę.

I użyj bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę łączną, upewniając się, że czaszka jest czysta i sucha. Umieść mały, zwinięty wydłużony kawałek bibuły wokół nacięcia na skórze głowy, aby zatrzymać krwawienie i pod mikroskopem preparacyjnym użyj wiertła o odpowiedniej wielkości z wiertłem 2,15 mm, aby rozrzedzić obszar kości o grubości od 0,5 do 1 cm w okolicy ciemieniowej nad lewą lub prawą korą somatosensoryczną, w zależności od wielkości szczura. Rozrzedzaj kość powoli i ostrożnie, aby uniknąć penetracji czaszki.

Podczas wykonywania tego kroku roztwór soli należy nakładać obficie, aby zapobiec przegrzaniu obszaru. Gdy obszar ma różowy wygląd i/lub można uwidocznić naczynia krwionośne, przykryj przerzedzoną kość olejem mineralnym. I użyj mikromanipulatora, aby ustawić laserową sondę dopplerowską nad odsłoniętym mikrokrążeniem mózgowym tak, aby końcówka sondy dotykała tylko górnej części basenu oleju mineralnego.

Aby wstępnie umieścić sondę, najlepiej zacząć od sygnału około 150 jednostek, aby upewnić się, że sonda jest umieszczona nad mikrocyrkulacją. Gdy laserowa sonda dopplerowska przepływowa jest na miejscu, pozwól zwierzęciu odpocząć przez 30 do 45 minut w okresie równowagi przed pobraniem 1,5 ml krwi z odpowiedniej kaniuli tętnicy udowej w ciągu 30 sekund. Aby zachować patent na cewnik, po każdym pobraniu krwi należy wstrzyknąć 100 jednostek na ml heparyny w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej do kaniuli.

Pozwól szczurowi dojść do siebie przez dwie minuty, a następnie mierz LDF i ciśnienie krwi co 30 sekund przez dwie minuty. Po pomiarach ciśnienia krwi i LDF powtarzaj pobieranie objętości krwi co dwie minuty, aż zwierzę osiągnie średnie ciśnienie tętnicze około 20 mmHg. W tych reprezentatywnych eksperymentach średni laserowy przepływ krwi w mózgu u 10 szczurów Sprague-Dawley karmionych standardową karmą laboratoryjną utrzymywał się w granicach 20% wartości sprzed krwotoku po pierwszych trzech pobraniach objętości krwi, aż średnie ciśnienie tętnicze osiągnęło dolną granicę autoregulacji.

Późniejsze zmniejszenie objętości krwi przy ciśnieniu poniżej dolnej granicy autoregulacji powodowało postępujące zmniejszanie laserowego przepływu krwi w mózgu, co pokazuje, że krążenie mózgowe nie było już w stanie wytworzyć wystarczającego poziomu rozszerzenia naczyń krwionośnych, aby utrzymać stały przepływ krwi w mózgu przy niższych ciśnieniach profuzji. Przy ciśnieniach na poziomie lub powyżej dolnej granicy autoregulacji nie stwierdzono istotnej korelacji między laserowym przepływem krwi w mózgu a ciśnieniem tętniczym, co wskazuje, że laserowy przepływ krwi w mózgu był niezależny od ciśnienia tętniczego w zakresie plateau krzywej autoregulacyjnej. Poniżej dolnej granicy autoregulacji, zależność między laserowym przepływem krwi a ciśnieniem tętniczym w mózgu miała ujemne nachylenie.

A laserowy przepływ krwi w mózgu był istotnie skorelowany z ciśnieniem tętniczym. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to bardzo ostrożne przerzedzenie czaszki i upewnienie się, że sonda LDF pozostaje mocno zakotwiczona na tym samym obszarze tkanki. Procedura ta może być stosowana do badania reaktywności mikrokrążenia różnych środków po infuzji wstecznej przez tętnicę szyjną lub do oceny przekrwienia czynnościowego i sprzężenia nerwowo-naczyniowego w krążeniu mózgowym.

Technika ta umożliwiła zbadanie wpływu różnych leków i środków znieczulających na krążenie mózgowe oraz zmiany w autoregulacji mózgu w modelach chorobowych, takich jak nadciśnienie.