Name: Ocena autoregulacji przepływu krwi w mózgu u szczura za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę laserowej przepływomierza dopplerowskiego do oceny autoregulacji krążenia mózgowego u szczura. Technika ta umożliwia nieinwazyjny, ciągły monitoring przepływu krwi w mikrokrążeniu mózgowym podczas zmian ciśnienia tętniczego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają szczere podziękowania dla Kaleigh Kozak, Megan Stumpf i Jacka Bullisa za ich wyjątkową pomoc w ukończeniu tego badania i przygotowaniu rękopisu. Wsparcie finansowe: NIH #R01-HL128242, #R21-OD018309 i #R21-OD024781.

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Medical College of Wisconsin zatwierdził wszystkie protokoły opisane w tym artykule, a wszystkie procedury są zgodne z przepisami Biura ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych (OLAW) National Institutes of Health (NIH).
1. Zwierzęta doświadczalne i przygotowanie do zapisu
<ol>
	<li>Użyj 8–12-tygodniowych samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 250–300 g. W tych eksperymentach karmić szczury standardową dietą składającą się z 0,4% NaCl, 200 g/kg kazeiny, 3 g/kg DL-metioniny, 497,77 g/kg sacharozy, 150 g/kg skrobi kukurydzianej, 50 g/kg oleju kukurydzianego, 50 g/kg celulozy, 2 g/kg dwuwinianu choliny, 35 g/kg mieszanki mineralnej i 10 g/kg mieszanki witaminowej.</li>
	<li>Rejestruj odczyty ciśnienia tętniczego krwi i LDF za pomocą oprogramowania do akwizycji danych lub dowolnej porównywalnej metody rejestrowania.</li>
	<li>Podłącz przetwornik ciśnienia tętniczego do jednego kanału systemu nagrywania, a sondę LDF do drugiego kanału systemu nagrywającego.</li>
	<li>Przed pomiarem skalibruj laserową sondę dopplerowską, aby ustawić wzorzec ruchliwości i upewnić się, że laserowy przepływomierz dopplerowski zapewnia stałą moc wyjściową.</li>
	<li>Przygotuj dodatkowy sprzęt potrzebny do operacji przygotowawczej i do eksperymentu: mikroskop preparacyjny, respirator gryzoni, monitor CO2 w końcowym oddechu, przyrząd stereotaktyczny do unieruchomienia głowy szczura w odpowiedniej pozycji oraz mikromanipulator do umieszczenia sondy LDF nad mikrokrążeniem lipidowym i utrzymania jej w stabilnej pozycji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Zważ szczura i znieczul zwierzę w komorze indukcyjnej z 3,5% izofluranem i 30% suplementemO2.</li>
	<li>Wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i zastąpić maskę znieczulającą dostarczającą 1,5–3% izofluranu suplementem 30%O2.</li>
	<li>Umieść szczura na kocu z krążącą wodą utrzymywaną w temperaturze 37 °C i sprawdź odruchy za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, aby upewnić się, że występuje odruch wycofania. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Ogol górną część czaszki, brzuszną część szyi i trójkąty udowe. Usuń luźne włosy z tych obszarów i wyczyść je alkoholem.</li>
	<li>Umieść szczura w pozycji leżącej na poduszce grzewczej z pompą ciepłej wody, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C i tymczasowo przymocuj go do podkładki za pomocą taśmy medycznej.</li>
	<li>Zainstaluj kaniulę tchawicy (rurka polietylenowa PE240) przez brzuszne nacięcie w szyi, jak opisano w innym miejscu26.</li>
	<li>Podłącz kaniulę tchawicy do końcowego monitora oddechowego CO2 i respiratora dostarczającego 2,5–3,0% izofluranu (w zależności od wielkości zwierzęcia) i 30% suplementu do inhalacjiO2. Upewnij się, że częstość oddechów, czas wdechu i minutowa objętość wentylacji są ustawione i monitorowane, aby zapewnić wygasły końcowy oddechowy CO2 wynoszący około 35 mmHg przez cały czas trwania eksperymentu. 
	UWAGA: Zwykle osiąga się to przy częstości oddechów około 48-60 oddechów/min, objętości oddechowej 1,70-2,30 ml i czasie wdechu 0,50-0,60 s dla szczura o wadze 250-300 g.</li>
	<li>Napełnij dwie kaniule polietylenowe PE50 1 μ/ml heparyny w izotonicznym roztworze NaCl, aby zapobiec krzepnięciu i utrzymać drożność cewników. Po wypełnieniu skośuj otwarty koniec każdej kaniuli nożyczkami chirurgicznymi, aby ułatwić wprowadzenie do tętnicy.</li>
	<li>Kanulacja prawej i lewej tętnicy udowej zgodnie z opisem w innym miejscu27, aby umożliwić ciągłe monitorowanie ciśnienia tętniczego w jednym cewniku i pobieranie krwi z drugiego cewnika.
	<ol>
		<li>Po dokładnym oddzieleniu tętnic od otaczającej tkanki pod mikroskopem preparacyjnym, należy podwiązać dystalny koniec tętnicy i założyć dwa dodatkowe szwy wokół środkowego i bliższego końca tętnicy bez zaciskania węzłów.</li>
		<li>Użyj szwu proksymalnego jako ligatury podnoszącej, aby zapobiec krwawieniu z tętnicy po nacięciu w celu wprowadzenia kaniuli (krok 2.11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż drut w kształcie litery V wykonany ze spinacza do papieru pod tętnicę, aby zatkać naczynie, aż kaniula zostanie zabezpieczona.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie w tętnicy udowej w pobliżu dystalnego podwiązania za pomocą nożyczek Vannas. Włóż ścięty koniec kaniuli do nacięcia i wsuń go do tętnicy udowej. Zaciśnij węzeł na środkowej ligaturze, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu, aby nie została usunięta przez ciśnienie tętnicze po usunięciu ligatury podnoszącej lub spinacza do papieru.</li>
	<li>Po zaciśnięciu środkowej ligatury zwolnij napięcie ligatury podnoszącej i/lub wyjmij spinacz do papieru i dokręć bliższą ligaturę.</li>
	<li>Zamknij nacięcie cienkimi szwami (jedwab 3-0) lub zszywką chirurgiczną. Alternatywnie umieść wilgotną gazę na miejscu nacięcia, w zależności od wielkości nacięcia.</li>
</ol>
3. Przerzedzenie czaszki do pomiarów LDF
<ol>
	<li>Natychmiast po założeniu kaniul należy ułożyć zwierzę w pozycji mostkowej i zabezpieczyć głowę w urządzeniu stereotaktycznym, uważając, aby nie przesunąć cewników ani rurki dotchawiczej.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać eliptyczne nacięcie w skórze pokrywającej czaszkę. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę łączną, upewniając się, że czaszka jest czysta i sucha. Umieść mały, wydłużony i zwinięty kawałek bibuły wokół nacięcia na skórze głowy, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj narzędzia Dremel lub wiertła dentystycznego z wiertłem 2,15 mm, aby rozrzedzić niewielki obszar kości (około 0,5–1 cm w zależności od wielkości szczura) w okolicy ciemieniowej nad lewą lub prawą korą somatosensoryczną. 
	UWAGA: Rozrzedzać kość powoli i ostrożnie, aby uniknąć penetracji czaszki. Podczas wykonywania tego kroku roztwór soli należy obficie nakładać, aby zapobiec przegrzaniu obszaru.</li>
	<li>Gdy czaszka zostanie przerzedzona, a obszar będzie miał różowy wygląd i/lub naczynia krwionośne zostaną uwidocznione, pokryj obszar olejem mineralnym i użyj mikromanipulatora, aby ustawić laserową sondę dopplerowską nad odsłoniętym mikrokrążeniem mózgowym tak, aby końcówka sondy dotykała tylko górnej części basenu oleju mineralnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
UWAGA: Konieczne jest wykonywanie pomiarów LDF w obszarze, w którym nie ma zewnętrznych wibracji, które zakłócałyby odczyty laserowego Dopplera i aby sonda była bezpiecznie zamocowana na tym samym obszarze docelowym przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
4. Ocena autoregulacji naczyń mózgowych
<ol>
	<li>Po ustaleniu sondy LDF na miejscu, przed rozpoczęciem eksperymentu odczekaj 30–45 minut okresu równowagi. Po okresie równowagi mierz średnie ciśnienie tętnicze (MAP) i laserowy przepływ krwi w mózgu (LCBF) co 30 s przez 2 minuty i uśredniaj wartości, aby uzyskać wartości wyjściowe dla ciśnienia krwi przed krwotokiem i LCBF.</li>
	<li>Aby ocenić autoregulację naczyń mózgowych w odpowiedzi na obniżenie ciśnienia tętniczego, zmierz LCBF i MAP po kolejnych pobraniach 1,5 ml krwi z tętnicy udowej11. Aby zachować patent na cewnik, należy upewnić się, że objętość roztworu heparyny (100 j./ml w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej) w przybliżeniu równa objętości cewnika jest podawana po każdym pobraniu krwi. 
	UWAGA: Podczas podawania roztworu heparyny w celu utrzymania drożności cewnika, ważne jest, aby jak najdokładniej dopasować objętość roztworu heparyny do objętości cewnika, aby zapobiec otrzymywaniu przez zwierzę zbyt dużej ilości heparyny, co mogłoby spowodować niepożądane krwawienie.</li>
	<li>Po każdym pobraniu objętości krwi pozwól szczurowi na równowagę przez 2 minuty, po czym MAP i LCBF są rejestrowane co 30 s przez 2 minuty. Powtarzaj pobieranie objętości krwi, aż zwierzę osiągnie MAP około 20 mmHg.</li>
	<li>Określ efektywny zakres autoregulacji, identyfikując zakres ciśnienia krwi od MAP krwotoku przedkrwotocznego do LLA (kroki 4.5 i 5.3 poniżej).</li>
	<li>Określ LLA, identyfikując najniższe ciśnienie, przy którym LCBF nadal powraca do wartości kontrolnej przed krwotokiem z dokładnością do 20% po pobraniu objętości krwi, jak opisano wcześniej11,28 lub identyfikując punkt przecięcia linii regresji wyznaczony podczas fazy plateau autoregulacji i poniżej LLA, gdzie LCBF zmniejsza się z każdym kolejnym pobraniem krwi (krok 5.3, poniżej). 
	UWAGA: Kryteria definiowania LLA i plateau autoregulacyjnego mogą się różnić w zależności od laboratoriów (np. Takada i wsp.28 vs. Jones et al.29), a także procedury obniżania ciśnienia tętniczego krwi (np. pobranie określonej objętości krwi vs. kontrolowany krwotok w celu osiągnięcia określonego poziomu ciśnienia tętniczego)11.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu poddaj zwierzę eutanazji poprzez wytworzenie obustronnej odmy opłucnowej w znieczuleniu chirurgicznym, zgodnie z aprobatą IACUC.</li>
	<li>Wartości LDF uzyskane w tkance po uśmierceniu zwierzęcia zapewnią zerową wartość przepływu na linii bazowej dla układu doświadczalnego.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonaj analizę regresji liniowej, aby ocenić korelację między wartościami LDF a odpowiadającym im ciśnieniem tętniczym. Użyj podstawowych odczytów LDF uzyskanych po uśpieniu zwierzęcia, aby upewnić się, że nie było niespecyficznego sygnału LDF wpływającego na mierzone natężenia przepływu.</li>
	<li>Oblicz LLA, korzystając z przecięcia między liniami regresji powyżej i poniżej plateau autoregulacyjnego. Aby obliczyć LLA przy użyciu tej metody, połącz dwa równania regresji i rozwiąż wynikowe równanie ciśnienia tętniczego.</li>
	<li>Porównując różne grupy doświadczalne, użyj analizy regresji liniowej, aby obliczyć nachylenia zależności LDF w stosunku do ciśnienia tętniczego powyżej i poniżej LLA dla każdego zwierzęcia i podsumować je jako średnią ± SEM dla zwierząt w tej grupie doświadczalnej.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ocena reakcji przepływu krwi w tkankach za pomocą laserowej przepływomierzy dopplerowskiej (LDF). Jak wspomniano powyżej, sygnał LDF jest proporcjonalny do liczby i prędkości poruszających się cząstek, w tym przypadku RBC, w mikrokrążeniu. Odczyty LDF w różnych narządach są dobrze skorelowane z przepływem krwi w całym narządzie ocenianym za pomocą uznanych metod, takich jak przepływomierze elektromagnetyczne i mikrosfery promieniotwórcze30 i są ogólnie zgodne z badaniami oceniając...

Mechanizmy autoregulacyjne w krążeniu mózgowym odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy i prawidłowego funkcjonowania mózgu. Na autoregulację przepływu krwi w mózgu wpływa wiele czynników, w tym tętno, prędkość krwi, ciśnienie perfuzji, średnica tętnic oporowych mózgu i opór mikrokrążenia, z których wszystkie odgrywają rolę w utrzymaniu całkowitego przepływu krwi w mózgu na stałym poziomie w mózgu w fizjologicznym zakresie ogólnoustrojowego ciśnienia krwi. Kiedy ciśnienie tętnicze wzrasta, mechanizmy te zwężają tętniczki i tętnice oporowe, aby zapobiec niebezpiecznemu wzrostowi ciśnienia śródczaszkowego. Kiedy ciśnienie tętnicze krwi spada, miejscowe mechanizmy kontrolne rozszerzają tętniczki, aby utrzymać perfuzję tkanek i dostarczanieO2. Różne stany patologiczne, takie jak hiperkapnia, urazowe lub globalne niedotlenienie mózgu oraz mikroangiopatia cukrzycowa1,2,3,4,5,6 mogą zakłócać zdolność mózgu do autoregulacji przepływu krwi. Na przykład przewlekłe nadciśnienie tętnicze przesuwa efektywny zakres autoregulacji w kierunku wyższych ciśnień7,8,9, a dieta o wysokiej zawartości soli (HS) nie tylko zakłóca normalne, zależne od śródbłonka rozszerzenie mikrokrążenia mózgowego10, ale także upośledza zdolność mechanizmów autoregulacyjnych w krążeniu mózgowym do rozszerzania i utrzymywania perfuzji tkanek, gdy ciśnienie tętnicze jest reduction11. Autoregulacja mózgu jest również upośledzona u szczurów wrażliwych na sól Dahla, gdy są one karmione dietą HS12.
Podczas obniżania ciśnienia tętniczego, rozszerzenie tętnic i tętniczek oporowych mózgu początkowo przywraca przepływ krwi w mózgu do wartości kontrolnych, pomimo zmniejszonego ciśnienia perfuzji. W miarę dalszego obniżania się ciśnienia tętniczego, przepływ krwi w mózgu pozostaje stały przy niższym ciśnieniu (faza plateau odpowiedzi autoregulacyjnej), dopóki układ krwionośny nie może się już rozszerzyć, aby utrzymać przepływ krwi przy niższym ciśnieniu. Najniższe ciśnienie, przy którym narząd może utrzymać prawidłowy przepływ krwi, określa się mianem dolnej granicy autoregulacji (LLA). Przy ciśnieniu poniżej LLA przepływ krwi w mózgu znacznie się zmniejsza w stosunku do wartości spoczynkowych i zmniejsza się w sposób liniowy wraz ze spadkiem ciśnienia perfuzji tętniczej13,14. Przesunięcie LLA w górę, obserwowane w nadciśnieniu tętniczym7,8,9, może zwiększać ryzyko i nasilenie urazu niedokrwiennego w stanach, w których ciśnienie perfuzji tętniczej jest obniżone (np. zawał mięśnia sercowego, udar niedokrwienny lub wstrząs krążeniowy).
LDF okazał się niezwykle wartościowym podejściem do oceny przepływu krwi w mikrokrążeniu w różnych okolicznościach, w tym autoregulacji przepływu krwi w krążeniu mózgowym11,14,15. Oprócz oceny reakcji autoregulacyjnych, LDF może być używany do monitorowania przepływu krwi w korze mózgowej podczas badania mechanizmów metabolicznych, miogenicznych, śródbłonkowych, humoralnych lub neuronalnych, które regulują przepływ krwi w mózgu oraz wpływu różnych interwencji eksperymentalnych i stanów patologicznych na przepływ krwi w mózgu10,16,17,18,19,20,21.
LDF mierzy przesunięcie odbitego światła laserowego w odpowiedzi na liczbę i prędkość poruszających się cząstek - w tym przypadku czerwonych krwinek (RBC). W przypadku badań nad autoregulacją naczyń mózgowych, ciśnienie tętnicze krwi jest zmieniane albo przez infuzję agonisty alfa-adrenergicznego w celu zwiększenia ciśnienia tętniczego (ponieważ samo krążenie mózgowe jest niewrażliwe na agonistów alfa-adrenergicznych zwężających naczynia)12,15 lub poprzez kontrolowane pobranie objętości krwi w celu obniżenia ciśnienia tętniczego11,14. W niniejszym badaniu LDF jest wykorzystywany do wykazania wpływu stopniowanego obniżenia ciśnienia krwi na autoregulację mózgu u zdrowego szczura. Chociaż metody czaszki otwartej i zamkniętej zostały opisane w literaturze22,23,24,25, niniejsza praca przedstawia preparację zamkniętej czaszki, pozwalającą na ocenę przepływu krwi w mózgu bez penetracji czaszki lub instalowania komory lub okna mózgowego.

<table><tbody><tr><td>3-0 pleciony jedwabny szew</td><td>Midwest Vet</td><td>193.73000.2</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia tętniczego</td><td>Merit Medical</td><td>041516504A Zautomatyzowane</td><td></td></tr><tr><td>systemy akwizycji danych (WINDAQ & System BIOPAC)</td><td>DATAQ Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyświetlacz ciśnienia krwi</td><td>Stoelting</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>Pompa cyrkulacyjna ciepłej wody</td><td>Gaymar Industries</td><td>T-pump</td><td></td></tr><tr><td>Monitor CO2 końca pływu</td><td>Stoelting</td><td>Capstar-100</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sód Midwest</td><td>Vet</td><td>191.46720.3</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A Laserowy</td> przepływomierz dopplerowski <td></td></tr><tr><td></td><td>Perimed</td><td>PeriFlux 5000 LDPM</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy wkład dopplerowski Standardowa ruchliwość</td><td>Perimed</td><td>PF1001</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa (PE240) (do kaniuli tchawicy)</td><td>VWR</td><td>63018-828</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa (PE50) (do cewników udowych)</td><td>VWR</td><td>63019-048</td><td></td></tr><tr><td>Respirator gryzoni</td><td>Cwe/ Stoelting</td><td>SAR-830/P</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Midwest Vet</td><td>193.74504.3</td><td></td></tr><tr><td>Szczury niebredne Sprague-Dawley</td><td>Zmienne</td><td>szczury N/A</td><td>zostały zamówione w różnych firmach</td></tr><tr><td>Standard Rat Chow</td><td>Dyets, Inc.</td><td></td><td></td>113755</tr><tr><td>Stereotaktyczny instrument</td><td>Cwe/Stoelting</td><td>Clasic Lab Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena autoregulacji przepływu krwi w mózgu u szczura za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Podczas badania mechanizmów regulacji przepływu krwi w mózgu, względny pomiar przepływu krwi w mikrokrążeniu można uzyskać za pomocą laserowej przepływomierzy dopplerowskiej (LDF). W artykule przedstawiono preparat do zamkniętej czaszki, który umożliwia ocenę przepływu krwi w mózgu bez penetracji czaszki lub instalowania komory lub okna mózgowego. Aby ocenić mechanizmy autoregulacyjne, można wykorzystać model kontrolowanego obniżania ciśnienia krwi za pomocą stopniowanego krwotoku przy jednoczesnym zastosowaniu LDF. Umożliwia to śledzenie w czasie rzeczywistym względnych zmian w przepływie krwi w odpowiedzi na spadki ciśnienia tętniczego krwi spowodowane wycofaniem objętości krwi krążącej. Paradygmat ten jest cennym podejściem do badania autoregulacji przepływu krwi w mózgu podczas obniżenia ciśnienia tętniczego krwi i, z niewielkimi modyfikacjami w protokole, jest również cenny jako eksperymentalny model wstrząsu krwotocznego. Oprócz oceny reakcji autoregulacyjnych, LDF może być stosowany do monitorowania przepływu krwi w korze mózgowej podczas badania mechanizmów metabolicznych, miogenicznych, śródbłonkowych, humoralnych lub neuronalnych, które regulują przepływ krwi w mózgu oraz wpływu różnych interwencji eksperymentalnych i stanów patologicznych na przepływ krwi w mózgu.

Rysunek 2 podsumowuje wyniki eksperymentów przeprowadzonych na 10 samcach szczurów Sprague-Dawley karmionych standardową karmą laboratoryjną. W tych eksperymentach średni LCBF utrzymywał się w granicach 20% wartości sprzed krwawienia po pierwszych trzech odbarczeniach objętości krwi, aż do momentu, gdy średnie ciśnienie tętnicze osiągnęło LLA. Kolejne odbarczenia objętości krwi przy ciśnieniach poniżej LLA spowodowały progresywny spadek LCBF, co wykazało, że krążenie mózgowe nie było już w s...

Ten artykuł demonstruje użycie laserowej przepływomierza dopplerowskiego do oceny zdolności krążenia mózgowego do autoregulacji przepływu krwi podczas obniżenia ciśnienia tętniczego krwi.

Ocena autoregulacji przepływu krwi w mózgu u szczura za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Protokół ten idealnie nadaje się do oceny zdolności mikrokrążenia mózgowego do regulowania własnego przepływu krwi podczas zmian ciśnienia krwi w normalnych i patologicznych warunkach. LDF zapewnia stosunkowo nieinwazyjną metodę ciągłego monitorowania przepływu krwi w mózgu w różnych warunkach, co nie jest możliwe przy użyciu innych metod. Laserowa przepływomierz dopplerowska może być stosowana do nieinwazyjnej oceny przepływu krwi.Na przykład, aby ocenić wpływ diety bogatej w sól na upośledzoną regulację przepływu krwi u zdrowych młodych kobiet. LDF umożliwia łatwe monitorowanie przepływu krwi w wielu różnych łożyskach naczyniowych ludzi i zwierząt i może być stosowany w wielu różnych badaniach. Procedurę wraz z Adrienne Allen zademonstruje Megan Stumpf, moja technolog badawcza i kierowniczka laboratorium.Przed rozpoczęciem zabiegu umieść szczura na krążącym kocu wodnym utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania u znieczulonego szczura eksperymentalnego. Nałóż maść na oczy zwierzęcia i ogol górną część czaszki, brzuszną część szyi i trójkąty udowe. Usuń wszelkie wypadające włosy z odsłoniętej skóry.I zdezynfekuj skórę alkoholem. Przenieś szczura na poduszkę grzewczą z pompą cyrkulacyjną ciepłej wody. I użyj taśmy medycznej, aby tymczasowo zabezpieczyć szczura w pozycji leżącej.Napełnij dwie kaniule PE 50 jedną jednostką na ml heparyny w izotonicznym roztworze chlorku sodu. I skośnie otwarty koniec cewników nożyczkami chirurgicznymi, aby ułatwić wprowadzenie do tętnic. Po dokładnym oddzieleniu tętnic udowych od otaczającej tkanki pod mikroskopem preparacyjnym, należy podwiązać dystalny koniec izolowanego odcinka tętnicy udowej i założyć dwa dodatkowe szwy wokół środkowego i bliższego końca tętnicy bez zaciskania węzłów.Włóż drut w kształcie litery V wykonany ze spinacza do papieru pod tętnicę, aby zatkać naczynie, aż kaniula zostanie zabezpieczona. Następnie za pomocą nożyczek vannas wykonaj małe nacięcie w tętnicy udowej w pobliżu dystalnego podwiązania. Włóż skośny koniec kaniuli do nacięcia i wsuń kaniulę do tętnicy udowej.Wyjmij spinacz do papieru. Zaciśnij węzeł w środkowej ligaturze nad kaniulą, aby zabezpieczyć kaniulę na miejscu. Zwolnij napięcie na ligaturze podnoszącej, a następnie napnij bliższą ligaturę i zamknij nacięcie.Natychmiast po założeniu kaniul należy umieścić zwierzę w pozycji mostkowej. I zabezpiecz głowę w urządzeniu stereotaktycznym, uważając, aby nie przesunąć cewników. Wykonaj eliptyczne nacięcie w skórze pokrywającej czaszkę.I użyj bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę łączną, upewniając się, że czaszka jest czysta i sucha. Umieść mały, zwinięty wydłużony kawałek bibuły wokół nacięcia na skórze głowy, aby zatrzymać krwawienie i pod mikroskopem preparacyjnym użyj wiertła o odpowiedniej wielkości z wiertłem 2,15 mm, aby rozrzedzić obszar kości o grubości od 0,5 do 1 cm w okolicy ciemieniowej nad lewą lub prawą korą somatosensoryczną, w zależności od wielkości szczura. Rozrzedzaj kość powoli i ostrożnie, aby uniknąć penetracji czaszki.Podczas wykonywania tego kroku roztwór soli należy nakładać obficie, aby zapobiec przegrzaniu obszaru. Gdy obszar ma różowy wygląd i/lub można uwidocznić naczynia krwionośne, przykryj przerzedzoną kość olejem mineralnym. I użyj mikromanipulatora, aby ustawić laserową sondę dopplerowską nad odsłoniętym mikrokrążeniem mózgowym tak, aby końcówka sondy dotykała tylko górnej części basenu oleju mineralnego.Aby wstępnie umieścić sondę, najlepiej zacząć od sygnału około 150 jednostek, aby upewnić się, że sonda jest umieszczona nad mikrocyrkulacją. Gdy laserowa sonda dopplerowska przepływowa jest na miejscu, pozwól zwierzęciu odpocząć przez 30 do 45 minut w okresie równowagi przed pobraniem 1,5 ml krwi z odpowiedniej kaniuli tętnicy udowej w ciągu 30 sekund. Aby zachować patent na cewnik, po każdym pobraniu krwi należy wstrzyknąć 100 jednostek na ml heparyny w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej do kaniuli.Pozwól szczurowi dojść do siebie przez dwie minuty, a następnie mierz LDF i ciśnienie krwi co 30 sekund przez dwie minuty. Po pomiarach ciśnienia krwi i LDF powtarzaj pobieranie objętości krwi co dwie minuty, aż zwierzę osiągnie średnie ciśnienie tętnicze około 20 mmHg. W tych reprezentatywnych eksperymentach średni laserowy przepływ krwi w mózgu u 10 szczurów Sprague-Dawley karmionych standardową karmą laboratoryjną utrzymywał się w granicach 20% wartości sprzed krwotoku po pierwszych trzech pobraniach objętości krwi, aż średnie ciśnienie tętnicze osiągnęło dolną granicę autoregulacji.Późniejsze zmniejszenie objętości krwi przy ciśnieniu poniżej dolnej granicy autoregulacji powodowało postępujące zmniejszanie laserowego przepływu krwi w mózgu, co pokazuje, że krążenie mózgowe nie było już w stanie wytworzyć wystarczającego poziomu rozszerzenia naczyń krwionośnych, aby utrzymać stały przepływ krwi w mózgu przy niższych ciśnieniach profuzji. Przy ciśnieniach na poziomie lub powyżej dolnej granicy autoregulacji nie stwierdzono istotnej korelacji między laserowym przepływem krwi w mózgu a ciśnieniem tętniczym, co wskazuje, że laserowy przepływ krwi w mózgu był niezależny od ciśnienia tętniczego w zakresie plateau krzywej autoregulacyjnej. Poniżej dolnej granicy autoregulacji, zależność między laserowym przepływem krwi a ciśnieniem tętniczym w mózgu miała ujemne nachylenie.A laserowy przepływ krwi w mózgu był istotnie skorelowany z ciśnieniem tętniczym. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to bardzo ostrożne przerzedzenie czaszki i upewnienie się, że sonda LDF pozostaje mocno zakotwiczona na tym samym obszarze tkanki. Procedura ta może być stosowana do badania reaktywności mikrokrążenia różnych środków po infuzji wstecznej przez tętnicę szyjną lub do oceny przekrwienia czynnościowego i sprzężenia nerwowo-naczyniowego w krążeniu mózgowym.Technika ta umożliwiła zbadanie wpływu różnych leków i środków znieczulających na krążenie mózgowe oraz zmiany w autoregulacji mózgu w modelach chorobowych, takich jak nadciśnienie.

evaluation-cerebral-blood-flow-autoregulation-rat-using-laser-doppler

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kilka zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu zostało opracowanych w celu symulacji ludzkiego stanu udaru. Protokół ten opisuje model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej indukowanej endoteliną-1 (ET-1) (MCAO) dla udaru niedokrwiennego u szczurów.  Ponadto omówiono ważne względy, zalety i wady tego modelu.

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Perfuzja mózgowa jest utrzymywana w różnych ciśnieniach poprzez autoregulację mózgu. Jednak scharakteryzowanie autoregulacji wymaga znacznych wahań ciśnienia przy regulowanych częstotliwościach. Opisany protokół pokaże, w jaki sposób oscylacyjne podciśnienie dolnej części ciała może generować wahania ciśnienia, aby dostarczyć danych do regresji dążenia do projekcji w celu ilościowego określenia krzywej autoregulacyjnej.

Ocena autoregulacji mózgu poprzez oscylacyjne podciśnienie dolnej części ciała i regresję pogoni za projekcją

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Tutaj prezentujemy kombinację laserowego obrazowania perfuzji dopplerowskiej (LDPI) i laserowego monitorowania perfuzji dopplerowskiej (LDPM) do pomiaru lokalnych przepływów krwi w rdzeniu kręgowym i nasycenia tlenem (SO2), a także ustandaryzowaną procedurę wprowadzania urazu rdzenia kręgowego u szczura.

Wykorzystanie laserowego obrazowania dopplerowskiego i monitorowania do analizy mikrokrążenia rdzenia kręgowego u szczurów

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Pokazano tutaj minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną, która polega na umieszczeniu laserowej sondy dopplerowskiej na czaszce nad dystalnym obszarem środkowej tętnicy mózgowej (MCA), miejscem okołooczodołowym odpowiednim dla szczurów i myszy, w celu oceny przepływu krwi podczas przejściowej okluzji MCA.

Okołooczodołowe umieszczenie laserowej sondy dopplerowskiej do monitorowania przepływu krwi w mózgu przed niedrożnością tętnicy środkowej mózgu w modelach gryzoni

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Poznaj metodę laserowej przepływomierza dopplerowskiego do oceny autoregulacji krążenia mózgowego u szczura. Technika ta umożliwia nieinwazyjny, ciągły monitoring przepływu krwi w mikrokrążeniu mózgowym podczas zmian ciśnienia tętniczego.

Ocena autoregulacji przepływu krwi w mózgu u szczura za pomocą laserowej przepływomierza dopplerowskiego

Przeglądaj więcej filmów