Name: Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę pomiaru integralności bariery jelitowej w trójwymiarowych organoidach myszy przy użyciu testu przepuszczalności z Lucifer yellow. Technika ta pozwala identyfikować induktory i inhibitory bariery jelitowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) [KFO257, projekt 4 dla M.S. i projekt 1 dla C.B.; FOR2438, projekt 2 na rzecz M.S. i E.N. oraz projekt 5 na rzecz C.B.; SFB1181 projekt C05 do C.B.; TRR241, projekt A06 do N.B.L. i M.S., projekt A03 do C.B., BR5196/2-1 do N.B.L. i BE3686/2 do C.B.]; Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Centrum Klinicznego w Erlangen (do M.S., E.N. i M.B.), W. Lutz Stiftung (do M.S.) oraz Forschungsstiftung Medizin Centrum Klinicznego Erlangen (do M.S.). Niniejsza praca została wykonana w ramach (częściowego) spełnienia wymagań wymaganych do uzyskania stopnia doktora medycyny Marco Bardenbachera.

Wszystkie kroki zostały wykonane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Poszycie organoidów
<ol>
	<li>Wyizoluj organoidy zgodnie z wcześniejszym opisem3. Procedura została pokrótce opisana poniżej.
	<ol>
		<li>Zbierz jelito cienkie od myszy.</li>
		<li>Otwórz jelito cienkie wzdłużnie i usuń końcówki kosmków, zeskrobując wewnętrzną tkankę jelitową szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Pokrój tkankę jelitową na małe kawałki za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Umyj kawałki 5x w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pipetując kawałki 10x w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Inkubować kawałki tkanek w zimnym roztworze EDTA o stężeniu 2 mM na lodzie przez 30 minut na poziomej platformie wstrząsającej. Pozwól, aby kawałki tkanki opadły.</li>
		<li>Zastąp roztwór EDTA buforem PBS, gdy kawałki tkanki osiądą na dnie. Odrzucić sklarowany osad i dodać 20 ml PBS.</li>
		<li>Uwolnij krypty jelitowe z tkanki, energicznie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Zebrać supernatant w probówkach wirówkowych i sprawdzić go za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Aby to zrobić, dodaj kroplę supernatantu do 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Trzymaj probówki wirówkowe na lodzie.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 1.1.6–1.1.8, aż liczba krypt jelitowych w pobranym supernatancie zmniejszy się.</li>
		<li>Przepuść frakcje zawierające najwięcej krypt przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę krypty w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS w celu umycia krypt. Następnie powtórzyć etap wirowania zgodnie z opisem w ppkt 1.1.11.</li>
		<li>Zawiesić osad w sumie 25 μl na studzienkę mieszaniny roztworu macierzy komórkowej i mysiej pożywki do hodowli organoidów w stosunku 1:1 i umieścić organoidy na 48-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 minut, aby umożliwić zestalenie się roztworu macierzy komórkowej.</li>
		<li>Przykryj organoidy 300 μl mysiego podłoża organoidowego na studzienkę.</li>
		<li>Hodować organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 2–3 dni.</li>
		<li>Użyj organoidów do eksperymentów po 7 dniach hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować organoidy do pomiaru integralności bariery.
	<ol>
		<li>Wszystkie probówki wirówkowe, które będą używane do przechowywania organoidów podczas procesu posiewu, należy wstępnie pokryć albuminą surowicy bydlęcej (BSA), dodając wystarczającą ilość 0,1% roztworu BSA do PBS, aby pokryć wszystkie powierzchnie z tworzywa sztucznego. Następnie ponownie usuń roztwór BSA i przechowuj probówki wirówkowe na lodzie.</li>
		<li>Rozmrozić roztwór macierzy komórkowej i pożywkę do hodowli organoidów na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby oddzielić organoidy, ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną i ponownie zawieś organoidy z jednego dołka 48-dołkowej płytki w 1 ml zimnego PBS. Rozpuść macierz komórkową przez energiczne pipetowanie. Zawiesinę organoidów należy zawsze przechowywać w probówkach wirówkowych wstępnie pokrytych BSA i zawsze przechowywać na lodzie. 
	nuta: Na gęstość, rozmiar i położenie organoidów w komorowym szkiełku nakrywkowym ma wpływ współczynnik podziału, stężenie roztworu matrycy komórkowej i obchodzenie się z zawiesiną matrycy organoid-komórka. Zaleca się wcześniejsze przećwiczenie obchodzenia się z roztworem macierzy komórkowej. Zwykle do testu nadaje się osiem szklanych szkiełek nakrywkowych z dobrze komorą. Organoidy pochodzące z jednego dołka z 48-dołkowej płytki konfluentnej można podzielić na dwie studzienki z ośmiokomorowym szkiełkiem nakrywkowym (40 μl osadu matrycy organoidowo-komórkowej na studzienkę).</li>
	<li>Odwirować zawiesinę organoidów o sile 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad z 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę organoidów w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić organoidy pochodzące z jednego dołka z płytki 48-dołkowej w 40 μl zimnego podłoża. Rozdrobnić duże struktury organoidowe, pipetując zawiesinę organoidu 5x przez końcówkę pipety o pojemności 10 μl, aby zebrać struktury o wielkości 40–60 μm do wysiewu. 
	nuta: Użyj końcówki 10 μl na końcówce do pipety o pojemności 100 μl do fragmentacji struktur organoidowych i przećwicz wcześniej krok 1.7, aby zapewnić spójne wyniki. Kontrolować wielkość organoidów za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w probówce wirówkowej. Upewnij się, że nie ma już wielogałęziowych organoidów i że fragmenty organoidów mają około 40–60 μm długości.</li>
	<li>Gdy organoidy osiągną pożądaną wielkość, wymieszaj je z 40 μl roztworu macierzy komórkowej (podłoże: roztwór matrycy komórkowej = 1:1). 
	nuta: Stosunek roztworu pożywki do roztworu macierzy komórkowej musi być utrzymywany na stałym poziomie, aby osiągnąć spójne wyniki. Rozcieńczenie roztworu macierzy komórkowej zmniejsza sztywność plamy organoidowej i wpływa na jej właściwości dyfuzyjne. Użyć wstępnie schłodzonych końcówek pipet (-20 °C) do wszystkich zawiesin zawierających roztwór matrycy komórkowej.</li>
	<li>Umieścić 40 μl zawiesiny roztworu matrycy komórek organoidowych na środku każdego dołka szkiełka nakrywkowego z 8 doładowaniami.</li>
	<li>Trzymaj szkiełko na woreczku z lodu przez 5 minut. Pozwala to zachować płynną zawiesinę organoidów macierzy komórkowej i grawitacyjnie zwiększa stężenie organoidów na powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu umożliwienia polimeryzacji pęcherzyka macierzy organoidowo-komórkowej.</li>
	<li>Dodać 150 μl pożywki do hodowli organoidów na basenik i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed przystąpieniem do poddania działaniu substancji eksperymentalnej.
	<ol>
		<li>Wykorzystaj ten okres do traktowania organoidów i modulowania ich integralności bariery zgodnie z odpowiednią hipotezą naukową. W celu kontroli pozytywnej należy traktować organoidy przez 48 godzin IFN-γ w celu zbadania związanej z IFN-γ degradacji złączy ścisłych i wzrostu przepuszczalności. Stymulować kontrolę pozytywną za pomocą 10 U/ml (10 ng/ml) rekombinowanego mysiego IFN-γ. Pozostawić organoidy jednego z nich dobrze nieleczone.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla organoidów w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 przez okres do 48 godzin.</li>
</ol>
2. Test przepuszczalności organoidu
<ol>
	<li>Doprowadzić komorę inkubacyjną mikroskopu do temperatury 37 °C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu w celu zmniejszenia dryftu termicznego podczas obrazowania organoidów.</li>
	<li>Przygotować 100 mM roztwór LY w PBS. Przechowywać na lodzie chronionym przed światłem.</li>
	<li>Przygotować 200 mM roztwór EGTA w PBS. Przechowuj go na lodzie.</li>
	<li>Przenieść szkiełko nakrywkowe z komorą wraz z organoidami do komory inkubacyjnej odwróconego mikroskopu konfokalnego i włączyć inkubację CO2 (5%). Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe z komorą jest szczelnie zablokowane w stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Używając organoidów w jednym dołku jako odniesienia, dostosuj ustawienia obrazowania mikroskopu. Dodać LY (3 μL ze 100 mM LY w 150 μL pożywki), aby uzyskać końcową objętość 1 mM LY w 300 μL pożywki. Inkubować pod mikroskopem przez 1 godzinę i dostosować ostrość do obrazowania światła organoidów. Określ wymaganą energię lasera dla wzbudzenia LY (488 nm) i odpowiednią czułość wykrywania instrumentu i spróbuj zobrazować fluorescencję LY przy 30–40% dostępnego zakresu dynamiki używanego instrumentu. 
	nuta: Dostosuj energię wzbudzenia lasera i skuteczność wykrywania na organoidach niepoddanych działaniu substancji 70 minut po dodaniu LY. Upewnij się, że energia wzbudzenia jest wystarczająco wysoka, aby uzyskać dobrze naświetlony obraz. Aby uniknąć nasycenia fluorescencji LY w obrazach mikroskopowych, zaleca się dostosowanie tych ustawień po osiągnięciu stanu ustalonego przez dyfuzję LY.</li>
	<li>Określ położenie organoidów za pomocą obrazowania na żywo z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC). Spróbuj zobrazować organoidy o porównywalnych średnicach (80 ± 30 μm) i skup się na centralnym wycinku organoidów, aby zobrazować ich światło. Zdefiniuj około 10 organoidów na studzienkę i spróbuj zobrazować tylko organoidy znajdujące się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego o kulistej strukturze. 
	nuta: Liczba organoidów, które można zobrazować w jednym przebiegu, zależy od prędkości mikroskopu. Zaleca się obrazowanie organoidów w odstępie 5 minut. W zwykłym laserowym mikroskopie skaningowym 40 pozycji to rozsądny punkt wyjścia.</li>
	<li>Zapisać DIC i fluorescencję LY w każdej pozycji, aby udokumentować kształt organoidu i autofluorescencję przed dodaniem LY do studzienek, wykorzystywanych do oznaczania integralności bariery.</li>
	<li>Nie należy obrazować organoidów, które wykazują wysoką autofluorescencję. Wynika to z nagromadzenia martwych komórek w świetle organoidu, a wyniki organoidów autofluorescencyjnych są trudne do późniejszej analizy.</li>
	<li>Rozcieńczyć 3 μl przygotowanego roztworu LY (100 mM LY w 150 μl pożywki) i dodać go ostrożnie do każdej studzienki, nie dotykając szkiełka nakrywkowego z komorą. Zalecane stężenie LY na studzienkę wynosi 1 mM. Ostateczna objętość na studzienkę powinna wynosić 300 μl.</li>
	<li>Szybko sprawdź ostrość zdefiniowanych pozycji i skoryguj w razie potrzeby. 
	nuta: LY szybko dyfunduje przez macierz komórkową. Dlatego obrazowanie konfokalne należy rozpocząć w ciągu 3 minut po dodaniu fluoroforu.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie poklatkowe pod mikroskopem. Wykonuj obraz fluorescencyjny każdej pozycji co 5 minut, co daje łącznie 70 minut. 
	nuta: Organoidy obrazowano w odstępach 5-minutowych, aby zobrazować wychwyt LY w czasie. Aby zmierzyć przerwanie bariery jelitowej, wystarczy zarejestrować fluorescencję przed i 60 minut po dodaniu LY oraz ponownie 10 minut po dodaniu EGTA.</li>
	<li>Dodać 3 μl przygotowanego roztworu EGTA do studzienki, nie dotykając szkiełka nakrywkowego z komorą. Zalecane stężenie w komorowym szkiełku nakrywkowym EGTA wynosi 2 mM. Całkowita objętość na studzienkę powinna wynosić 300 μl.</li>
	<li>Rozpocznij drugi film poklatkowy. Ponownie zarejestrować fluorescencję określonych organoidów w odstępie 5 minut, co daje łącznie 30 minut.</li>
	<li>Wyrzuć wszystko zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj tylko wyniki organoidów, które przyjęły LY po dodaniu EGTA.</li>
	<li>Wyniki można określić ilościowo za pomocą Fiji ImageJ.</li>
	<li>Otwórz zestaw danych w ImageJ, klikając Plik |Otwórz i wybierz dane obrazu. W następującym oknie dialogowym Opcje importu formatów biologicznych wybierz pozycję Wyświetl stos z: Hyperstack.</li>
	<li>Otwórz menedżera obszaru zainteresowania (ROI), klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.</li>
	<li>Narysuj owalny zwrot akcji, klikając przycisk Owalny wybór na pasku menu ImageJ. Narysuj zaznaczenie zawierające wewnętrzne światło organoidu. Następnie naciśnij Dodaj w Menedżerze ROI.</li>
	<li>Powtórz kroki dla trzech reprezentatywnych obszarów poza organoidem.</li>
	<li>Kliknij Analizuj na pasku menu i wybierz Ustaw pomiary. Włącz tylko średnią wartość szarości i wyłącz wszelkie inne pomiary. Następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie ROI są zaznaczone w Menedżerze ROI. W Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij Więcej | Wiele miar. W oknie dialogowym opcji wybierz opcję Zmierz wszystkie wycinki [...] i Po jednym wierszu na wycinek. Następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Zaznacz wszystkie wartości w oknie Wyniki i skopiuj je do aplikacji arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy. 
	nuta: Jeśli pozycja organoidu przesunęła się podczas obrazowania poklatkowego, zwrot z inwestycji musi być odpowiednio dostosowany. W tym celu należy wybrać właściwy zwrot z inwestycji w menedżerze zwrotu z inwestycji i przenieść go na nową pozycję. Następnie kliknij przycisk Aktualizuj w menedżerze zwrotu z inwestycji. Wykonaj pomiar dla każdego punktu czasowego indywidualnie, klikając opcję Zmierz w menedżerze zwrotu z inwestycji, a następnie przełącz się na następny punkt czasowy w oknie obrazu, korzystając z paska na dole. Zbierz wszystkie pomiary w arkuszu kalkulacyjnym. Indywidualny kształt i ruch organoidów w okresie obrazowania wymaga ręcznej analizy danych.</li>
	<li>Obliczyć średnią wartość intensywności trzech ROI poza organoidem dla każdego punktu czasowego.</li>
	<li>Podziel intensywność ROI wewnątrz światła organoidu przez średnią intensywność ROI na zewnątrz i średnią intensywność wewnątrz organoidu.</li>
	<li>Aby obliczyć względny wzrost fluorescencji organoidów świetlnych, podziel względną fluorescencję (patrz krok 3.11) w każdym obrazowanym punkcie czasowym przez minimalną fluorescencję względną. 
	nuta: Użyj minimalnej fluorescencji względnej, ponieważ czasami dyfuzja fluoroforu może być powolna na początku eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+GTPases+and+Cytoskeleton+in+Cellular+Barrier+Defects+during+Gut+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1240(2017).</li>
<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li>
<li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport%2C+sensing+and+incretin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 16831(2015).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Measurement+of+Epithelial+Barrier+Permeability+in+Human+Intestinal+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).</li>
<li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383(2019).</li>
<li>Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+transport+was+observed+not+in+hydrophilic+compounds+but+in+dextran+in+Caco-2+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test ten oferuje technikę badania integralności bariery jelitowej w żywych organoidach. Cały test opiera się na organoidach myszy w jelicie cienkim i konfokalnej mikroskopii żywych komórek. Dlatego konieczne jest wcześniejsze przećwiczenie właściwego obchodzenia się z organoidami. Po wyizolowaniu organoidy mogą być rutynowo dzielone i przechowywane przez kriozamrażanie 3,9. W tym teście zalecamy rozszczepienie organoidów na 48 godzin przed rozpoczęciem leczenia. Okres ten daje organoidom szansę na całkowite zamknięcie i utworzenie kulistych struktur. Wysiewanie organoidów do eksperymentu jest krytycznym krokiem w ramach testu. Aby zmniejszyć indywidualne różnice w obchodzeniu się z odpadami, zalecamy rutynową procedurę w procesie wysiewu. Ten krok ma kluczowe znaczenie, a rutynowy protokół postępowania wyraźnie zmniejsza różnice eksperymentalne.
Podczas procedury wysiewu (krok 1.7) organoidy ulegają rozdrobnieniu w wyniku powtarzającego się przechodzenia przez standardową końcówkę pipety o pojemności 10 μl. Wielkość porów tego produktu różni się w zależności od firmy. Procedurę tę należy przećwiczyć z wyprzedzeniem, a wynik należy zawsze sprawdzić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Gdy uzyskane organoidy osiągną pożądany rozmiar, nie należy zmieniać procedury.
Wysiew organoidów musi być zoptymalizowany i dostosowany do dostępnej konfiguracji mikroskopowej. Aby móc hodować i obrazować organoidy przez co najmniej 48 godzin, absolutnie wymagana jest inkubowana komora mikroskopowa. Wybierz szkiełko nakrywkowe komorowe, które odpowiada Twoim wymaganiom. Podczas wysiewu organoidów należy upewnić się, że organoidy koncentrują się na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Jest to możliwe dzięki przechowywaniu szkiełka nakrywkowego w komorze na opakowaniu z lodu przez 5 minut po umieszczeniu zawiesiny organoidowej macierzy komórkowej. Ten krok jest ważny dla poprawy jakości obrazowania konfokalnych żywych komórek. Rozdzielczość osiowa i odległość robocza soczewek mikroskopu konfokalnego są szczególnie ograniczone. Im bardziej zbliżysz próbkę do soczewki, tym lepiej możesz ją zobrazować i tym mniej energii lasera jest potrzebne do wzbudzenia fluorescencji LY.
Fototaksja jest ważną kwestią, jeśli chodzi o mikroskopię żywych komórek. W ramach tego testu wykluczamy tę opcję. Funkcjonalny AJC jest widoczny przez wykluczenie LY ze światła organoidu (ryc. 1, PBS). Dodanie EGTA na końcu eksperymentu powoduje sekwestrację jonów dwuwartościowych, które są kofaktorami białek AJC. LY jest wykluczony ze światła organoidu tylko w ważnych organoidach z funkcjonalnym kompleksem AJC. Ogólnie rzecz biorąc, cząsteczki fluorescencyjne mogą być używane do pomiaru integralności bariery jelitowej. Wybraliśmy LY zamiast innych powszechnie stosowanych fluoroforów, takich jak dekstran znakowany fluoresceiną, ponieważ są one transportowane transkomórkowo w komórkach jelitowych z przedziału podstawnego do wierzchołkowego9. Wybraliśmy LY również ze względu na jego niewielkie rozmiary. LY ma masę cząsteczkową 457 Da, dzięki czemu ułatwia badanie przepuszczalności bariery dla małych cząsteczek. Cząsteczka fluorescencyjna musi być wybrana w zależności od badanego zagadnienia naukowego. Ze względu na obecność fototoksycznych defektów AJC, energia wzbudzenia lasera musi zostać zmniejszona lub wydłużony odstęp między obrazowaniami. Optymalną techniką obrazowania konfokalnego dla tego testu jest mikroskopia wirującego dysku. Odpowiednie instrumenty umożliwiają obrazowanie konfokalne z krótkim czasem naświetlania przy niskiej mocy lasera.
Opracowano już różne modele do badania integralności bariery jelitowej in vitro. Podczas gdy stosowanie testów opartych na monowarstwach linii komórkowych lub eksperymentach in vivo maleje, metody oparte na organoidach stają się coraz częstsze. W przeciwieństwie do metod opisanychwcześniej 4,5,6,7, nasza metoda pozwala na ilościowe określenie funkcji bariery w czasie. Pozwala to na wystawienie organoidów na dodatkowe bodźce w trakcie eksperymentu. W tym przypadku stosujemy EGTA jako drugi bodziec na końcu eksperymentu jako kontrolę pozytywną.
W przeciwieństwie do sytuacji in vivo, w naszym teście LY jest dodawany do pożywki i przenika do organoidu od zewnętrznej strony nabłonka podstawno-bocznego w kierunku wewnętrznego światła wierzchołkowego. LY jest mały i służy tylko do wizualizacji szczelności bariery jelitowej. Cząsteczki i bodźce, które modulują warstwę nabłonkową na powierzchni wierzchołkowej, muszą zostać wstrzyknięte do światła organoidu7. Aby zmniejszyć wysiłek eksperymentalny i móc zmierzyć integralność bariery wielu organoidów w tym samym czasie, zdecydowaliśmy się na zastosowanie barwnika fluorescencyjnego od zewnątrz.
Wykorzystaliśmy test do zbadania funkcji IFN-γ na ścisłym połączeniu organoidów myszy w jelicie cienkim. Fakt, że byliśmy w stanie przeanalizować integralność bariery w żywych organoidach, daje przyszłe możliwości zastosowania tej techniki do opisania inhibitorów wywołanego stanem zapalnym uszkodzenia bariery jelitowej. Substancje, które przeciwdziałają upośledzonej funkcji bariery spowodowanej przez IFN-γ mogą być kandydatami do leczenia chorób zapalnych jelit, w których upośledzona funkcja bariery jest jednym z czynników chorobotwórczych10.

Integralność bariery nabłonkowej jest utrzymywana przez kompleks połączeń wierzchołkowych (AJC), który składa się z białek złącza ścisłego (TJ) i połączenia adherencji (AJ)1. Spolaryzowana struktura AJC ma kluczowe znaczenie dla jego funkcji in vivo. Rozregulowanie AJC występuje w różnych chorobach i podejrzewa się, że jest ważnym czynnikiem wyzwalającym patogenezę nieswoistych zapaleń jelit. Utrata funkcji bariery jelitowej stanowi zdarzenie inicjujące chorobę. Następujące translokacje bakterii komensalnych i reakcje zapalne są bolesnymi konsekwencjami2.
Różne modele in vitro i in vivo zostały opracowane w celu zbadania regulacji AJC. Test Transwell opiera się na dwuwymiarowych (2D) monowarstwach komórek, które pochodzą z linii komórek nowotworowych. Systemy te są dobre do oceny metodami optycznymi i biochemicznymi i umożliwiają analizę wielu próbek w tym samym czasie, ale brakuje im wielu cech komórek pierwotnych i procesów różnicowania zachodzących in vivo. Badanie integralności bariery jest również możliwe w modelach zwierzęcych. W eksperymentach terminalnych można określić ilościowo wpływ określonych zabiegów in vivo na przepuszczalność całego jelita. Modele te wymagają jednak dużej liczby zwierząt i nie pozwalają na szczegółową wizualizację leżących u ich podstaw procesów molekularnych. Obecnie dostępne są ulepszone modele 3D in vitro, które dokładnie podsumowują procesy różnicowania komórek, polaryzację komórek i reprezentują strukturę krypty i kosmków jelita3. Zastosowanie organoidów jelitowych 3D do analiz funkcjonalnych wymaga adaptacji dostępnych metod z modeli 2D. W tym miejscu opisujemy model do badania integralności bariery jelitowej w żywych organoidach myszy z jelita cienkiego. Test został opracowany w celu zbadania wpływu IFN-γ na integralność bariery i odpowiednie białka połączeń ścisłych8.
W przeciwieństwie do techniki stosowanej przez Leslie4, Zietek5, lub Pearce6, która mierzy fluorescencję po usunięciu żółcieni lucyferowej (LY) z podłoża, nasze podejście pozwala na ilościowe określenie absorpcji światła przez fluorofor w czasie. W związku z tym wynik reprezentuje kinetykę wychwytu dynamicznego, a nasz test umożliwia zastosowanie dodatkowych bodźców lub inhibitorów w trakcie trwania eksperymentu. Fakt, że oba testy mierzą wychwyt od zewnętrznej strony podstawno-bocznej do wewnętrznej powierzchni wierzchołkowej, wyraźnie kontrastuje z sytuacją in vivo. W modelu opisanym przez Hilla i wsp.7, temat ten został zgłębiony. Po mikrowstrzyknięciu fluoroforu do światła organoidu, fluorescencję określono ilościowo. Kierunek dyfuzji reprezentuje kierunek obecny in vivo. Wysiłek techniczny związany z mikroiniekcją wyraźnie zmniejsza przepustowość tej metody. W przeciwieństwie do opisywanego tu modelu, metoda mikroiniekcji umożliwia pomiar efektów wymagających aktywacji biologicznej na powierzchni nabłonka wierzchołkowego.
Prezentowany tutaj model integralności bariery organoidowej opiera się na mikroskopii żywych komórek i umożliwia analizę dynamicznych zmian w regulacji AJC w czasie. Zestaw może być stosowany do badania farmakologicznego wpływu substancji indukujących i hamujących integralność bariery jelitowej. Co więcej, modele oparte na organoidach pomagają zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych do badań farmakologicznych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka 8-dołkowe 48-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#150687</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ibidi</td><td>#80826</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#655101</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 - wirujący dysk</td> Laser wzbudzający <td>Zeiss</td><td></td><td>488 nm / filtr emisyjny 525/25</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788-25g</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Lucyfer Żółta sól dilitowa CH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, zredukowany czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowej</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Roztwór macierzy komórkowej</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>M. musculus C57/Bl6</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td></td> nakrywkowe <td>mikroskopu 24 mm x 60 mm</td><td></td></tr><tr><td>Organoid Growth Medium mysie</td><td>technologie</td> <td>komórek macierzystych#06005</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanem</td><td>Biochrom</td><td>L182-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IFN-&gamma;</td><td>Kot Biolegend</td><td>#575304</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoidy i trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe pozwalają na badanie złożonych mechanizmów biologicznych i regulacji in vitro, co wcześniej nie było możliwe w klasycznych monowarstwach hodowli komórkowych. Co więcej, jednowarstwowe hodowle komórkowe są dobrymi systemami modelowymi in vitro, ale nie reprezentują złożonych procesów i funkcji różnicowania komórkowego, które opierają się na strukturze 3D. Do tej pory było to możliwe tylko w eksperymentach na zwierzętach, które są pracochłonne, czasochłonne i trudne do oceny za pomocą technik optycznych. W tym miejscu opisujemy test do ilościowego określenia integralności bariery w czasie w żywych organoidach myszy z jelita cienkiego. Aby zweryfikować nasz model, zastosowaliśmy interferon gamma (IFN-γ) jako pozytywną kontrolę niszczenia bariery i organoidy pochodzące z receptora IFN-γ 2 nokautującego myszy jako kontrolę negatywną. Test pozwolił nam określić wpływ IFN-γ na integralność bariery jelitowej i indukowaną przez IFN-γ degradację białek połączeń ścisłych klaudyny-2, -7 i -15. Test ten może być również wykorzystany do zbadania wpływu związków chemicznych, białek, toksyn, bakterii lub sond pochodzących od pacjentów na integralność bariery jelitowej.

Aby zwalidować zastosowanie 3D organoidów jelita cienkiego myszy jako modelu do ilościowego określenia wpływu związków regulujących integralność bariery jelitowej, zastosowano IFN-γ. W tym celu wyizolowano i hodowano organoidy pochodzące od myszy typu dzikiego, reagujących na IFN-γ, oraz myszy z knockoutem receptora-2 IFN-γ, które nie reagują na IFN-γ8. Po 48 h inkubacji z IFN-γ lub PBS (kontrola), wszystkie organoidy poddano działaniu LY i obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej żywych komórek w odstępach 5 min przez okres 70 min. Funkcjonalna integralność bariery jelitowej w tym modelu objawiała się wykluczeniem LY z światła organoidu, natomiast wewnątrzświetlna akumulacja LY oznaczała zniszczenie TJ. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe fluorescencyjne po 70 min inkubacji z LY wyraźnie pokazują, że fluorescencja LY wewnątrz światła była widoczna wyłącznie w organoidach od zwierząt typu dzikiego traktowanych IFN-γ. Ani w kontrolach niestymulowanych (PBS), ani w organoidach pochodzących od zwierząt z knockoutem (IFN-γR2ΔIEC, Rysunek 1), po 70 min nie stwierdzono fluorescencji LY wewnątrz światła.
Dodatek EGTA powoduje niespecyficzne naruszenie integralności bariery jelitowej poprzez sekwestrację kofaktorów TJ. Kontrola ta była zawsze stosowana na końcu eksperymentu, aby wykazać zdolność danego organoidu do pobierania LY (Rysunek 1). Jeśli po zastosowaniu EGTA nie wykryto fluorescencji LY wewnątrz światła jelita, organoid był wykluczany z eksperymentu.
W celu ilościowej oceny wyników mikroskopowych zmierzono fluorescencję LY wewnątrz światła organoidu oraz poza organoidem. Obliczono wartości intensywności względnej (fluorescencja wewnątrz / fluorescencja poza + wewnątrz), które przedstawiono dla każdego z obrazowanych punktów czasowych. Zaleca się unikanie obrazowania organoidów o zróżnicowanych rozmiarach. Skupiono się na organoidach o średnicy 80 ± 30 µm (Rycina 2). Schemat protokołu wraz z reprezentatywnymi obrazami przedstawiono na Rycynie 3. Główne problemy oraz techniki rozwiązywania problemów przedstawiono i omówiono na Rycynie 4.
<img alt="Komórki pod mikroskopem w PBS i IFN-γ, obrazowanie fluorescencyjne time-lapse, badanie odpowiedzi komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Integralność bariery jelitowej może być analizowana w organoidach mysich. Organoidy jelita z IFN-γR2WT oraz IFN-γR2ΔIEC hodowano w obecności IFN-γ przez 48 h lub pozostawiono bez obróbki. Aby zbadać szczelność bariery jelitowej, dodano LY (457 Da) i wykonano obrazy fluorescencyjne za pomocą konfokalnego mikroskopu w odstępach 5 min przez łącznie 70 min. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z punktów czasowych 0 min, 70 min oraz po dodaniu EGTA (kolor zielony = Lucifer yellow; pasek skali = 20 µm). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Bardenbachera i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza przepuszczalności organoidów; mikroskopia fluorescencyjna i dane wykresowe dotyczące wpływu IFN-γ, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Model integralności bariery organoidów jelita cienkiego dostarcza wyników ilościowych. (AFluorescencję LY określono wewnątrz i na zewnątrz organoidu. Obliczono wartości intensywności względnej (wewnątrz / fluorescencja na zewnątrz + wewnątrz) w stosunku do początkowej intensywności względnej + SEM; wartości te przedstawiono dla każdego punktu czasowego.B) Rozkład wielkości analizowanych organoidów. Aby zredukować odchylenie standardowe oraz błędy wynikające ze zmian stosunku powierzchni do objętości, analizowano wyłącznie organoidy o średnicy 80 ± 30 µmWartości średnie średnic poszczególnych organoidów przedstawiono wraz z odchyleniem standardowym (SD) (IFN-γR2WT (typ dziki), n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). Średnie wartości średnicy nie różniły się istotnie pomiędzy poszczególnymi grupami (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA). (CPrzepuszczalność organoidów określono 70 minut po dodaniu LY. Zdefiniowano ją poprzez podzielenie intensywności fluorescencji wewnątrzświatowej po 70 minutach przez minimalną względną intensywność fluorescencji zmierzoną w okresie obserwacji. Każdy słupek reprezentuje wartości średnie + SD, zmierzone w 10 organoidach pochodzących z dwóch niezależnych eksperymentów (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ znacząco zwiększyło pobieranie LY tylko w IFN-γR2WT organoidy. ***wartość p &lt;0,01 w teście t Studenta. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Bardenbacher i wsp.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat workflow badania organoidów z obrazowaniem mikroskopowym; diagram i wyniki mikroskopowe z zastosowaniem LY oraz EGTA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat protokołu z reprezentatywnymi obrazami. (A) Schematyczny opis głównych etapów protokołu. (B) Reprezentatywne zdjęcia głównych etapów protokołu. (B1) Obraz z mikroskopii DIC centralnego przekroju odpowiedniego organoidu, który został wybrany do analizy przepuszczalności. Linia przerywana oznacza szerokość wynoszącą 89 µm. (B2) Zdjęcie z mikroskopii fluorescencyjnej tego samego organoidu w (B1) przed dodaniem LY. Obraz przedstawia autofluorescencję organoidu. (B3) Organoid 70 min po dodaniu LY. Przedstawiony organoid nie wykazuje poboru LY, co świadczy o zachowaniu funkcji barierowej. Linie przerywane wyznaczają obszary zainteresowania (ROI) do dalszej analizy. Oznaczono wewnętrzne światło organoidu oraz trzy reprezentatywne obszary wokół organoidu. (B4) Organoid po dodaniu EGTA. Organoid nadaje się do dalszych analiz, ponieważ wykazuje pobieranie LY po zastosowaniu EGTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat autofluorescencji organoidów; wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i obrazy fluorescencyjne dla analizy poboru LY." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Rozwiązywanie typowych problemów. (A) Tabela z typowymi problemami i rozwiązaniami. (B) Przykładowe obrazy. (B1) obraz DIC dużego, wielogałęziastego organoidu, który nie nadaje się do tego testu. (B2). Obraz konfokalny organoidu wykazujący wysoką autofluorescencję przed dodaniem LY do medium. Organoid ten został wykluczony z analizy ilościowej. (B3) Obraz konfokalny organoidu wykazujący niską autofluorescencję przed dodaniem LY do pożywki. W tym przypadku zmierzono natężenie fluorescencji. (B4) Organoid niewykazujący poboru LY z pożywki 30 min po dodaniu EGTA, a zatem wykluczony z analizy ilościowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

W celu zbadania integralności bariery jelitowej opracowaliśmy metodę pomiaru integralności bariery jelitowej w organoidach jelita cienkiego myszy. W przeciwieństwie do tego, odnosimy się do używanej jednowarstwowej hodowli komórkowej, nasz test opiera się na trójwymiarowych organoidach jelita cienkiego. Dostosowanie dwuwymiarowego testu do naszego modelu było niezbędne ze względu na jego praktyczność.Test opiera się na organoidach hodowanych in vitro, a jego zastosowanie pomoże w określeniu induktorów i inhibitorów integralności bariery jelitowej. Regulacja białek połączeń ścisłych jest ważną cechą wszystkich komórek nabłonkowych. Nasz test umożliwia funkcjonowanie i analizę integralności bariery nabłonkowej.Aby zmierzyć integralność bariery organoidów wyizolowanych z tkanki jelitowej myszy, należy najpierw wstępnie pokryć wszystkie probówki wirówkowe, które będą używane do przechowywania organoidów podczas procesu posiewu, ilością 0,1% BSA w PBS, aby pokryć wszystkie plastikowe powierzchnie. Natychmiast usuń roztwór BSA i umieść probówki na lodzie. Następnie rozmrozić roztwór macierzy komórkowej i pożywkę do hodowli organoidów na lodzie i ostrożnie wyjąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki 48-dołkowej płytki do hodowli organoidów.Umyj każdą studzienkę jednym mililitrem zimnego PBS przed energicznym pipetowaniem w celu rozpuszczenia matryc komórkowych. Po uzyskaniu względnie jednorodnych zawiesin komórkowych należy dwukrotnie przemyć organoidy świeżym PBS przez odwirowanie i ponownie zawiesić każdą kulturę organoidów w 40 mikrolitrach zimnej pożywki. Oddziel duże struktury organoidowe za pomocą pięciokrotnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zebrać struktury o wielkości od 40 do 60 mikrometrów i wymieszaj każdą zawiesinę organoidu z 40 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu macierzy komórkowej.Dodaj zawiesinę roztworu matrycy komórek organoidowych do środka poszczególnych studzienek szkiełka nakrywkowego z ośmioma dokładami i umieść szkiełko na okładzie lodowym na pięć minut. Pod koniec inkubacji umieścić szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 minut, aby umożliwić polimeryzację struktury macierzy komórkowej organoidów przed dodaniem 150 mikrolitrów pożywki do hodowli organoidów do każdej studzienki na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji należy poddawać badzienki kontroli dodatniej działaniu 10 nanogramów na mililitr rekombinowanego mysiego interferonu gamma przez 48 godzin.Aby wykonać test przepuszczalności, przenieś szkiełko nakrywkowe z komorą do komory inkubacyjnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w odwróconym mikroskopie konfokalnym i ustaw dwutlenek węgla w komorze na 5%Zablokuj mocno szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i dostosuj ustawienia obrazowania mikroskopu, aby uwidocznić organoidy w jednej studzience komory. Następnie dodaj trzy mikrolitry świeżo przygotowanego 100-milimolowego żółtego Lucyfera w 150 mikrolitrach pożywki do jednego dołka na godzinną inkubację w komorze mikroskopu. Pod koniec inkubacji dostosuj ostrość, aby uwidocznić światło organoidu referencyjnego i określ wymaganą energię lasera dla wzbudzenia żółtego Lucyfera oraz odpowiednią czułość wykrywania instrumentu, aby zobrazować żółty sygnał Lucyfera przy 30 do 40% dostępnego zakresu dynamiki instrumentu.Alternatywnie intensywność sygnału można zmodyfikować, zmieniając czas ekspozycji. Aby znaleźć pozycje około 10 organoidów o sferycznej strukturze blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego na studzienkę za pomocą interferencji różnicowej, kontrastuj obrazowanie na żywo, rejestrując organoidy o porównywalnych średnicach i skupiając się na centralnym wycinku organoidów w celu zobrazowania lumenów. Zapisz różnicowy kontrast interferencyjny i żółtą fluorescencję Lucyfera w każdej pozycji, aby udokumentować kształt i autofluorescencję każdego organoidu.Kiedy wszystkie organoidy zostaną zobrazowane, dodaj 150 mikrolitrów pożywki, w tym żółtej Lucyfera, do studzienek zabiegowych Lucyfera i obrazuj wszystkie dołki co pięć minut przez 70 minut. Pod koniec sesji obrazowania dodać cztery mikrolitry świeżo przygotowanej EGTA do 100 mikrolitrów pożywki. Dodaj rozcieńczoną EGTA do odpowiednich studzienek.Następnie rejestruj fluorescencję organoidów w każdym studzience co pięć minut przez 30 minut. Należy wcześniej przećwiczyć obchodzenie się z organoidami i hodowlę lub organoidy, ponieważ żywotność i integralność komórek są warunkiem wstępnym powodzenia testu. W tym reprezentatywnym eksperymencie, po 70 minutach leczenia żółtym śródświetlnym Lucyferem, żółta fluorescencja Lucyfera była widoczna tylko w organoidach od zwierząt typu dzikiego leczonych interferonem gamma.Ani niestymulowane grupy kontrolne, ani organoidy pochodzące od zwierząt z nokautem receptora interferonu gamma-2 nie wykazywały wewnątrzświetlnej żółtej fluorescencji Lucyfera pod koniec okresu leczenia. Dodanie EGTA spowodowało niespecyficzne załamanie integralności bariery jelitowej poprzez sekwestrację kofaktorów połączeń ścisłych, co spowodowało wychwyt i ekspresję żółtego Lucyfera we wszystkich organoidach, niezależnie od pochodzenia i warunków leczenia. Można również określić ilościowo względne wartości intensywności poziomu żółtej fluorescencji Lucyfera w świetle organoidu i na zewnątrz każdego organoidu.Pamiętaj, aby wybrać organoidy o porównywalnej wielkości wokół konfiguracji i wybrać ustawioną oś tak, aby można było wyobrazić sobie centralne światło organoidu. Oprócz stosowania substancji indukujących rozpad bariery jelitowej, możemy również badać strategie hamowania niszczenia bariery jelitowej. Ponieważ metodologia ta opiera się na pierwotnych komórkach pochodzących od jednego zwierzęcia, może być stosowana w wielu testach, zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do każdego eksperymentu.

investigating-intestinal-barrier-breakdown-in-living-organoids

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Hodowle organoidów jelitowych są tworzone z całych krypt i nie pozwalają na analizę samoodnowy i różnicowania w sposób specyficzny dla komórki. Protokół ten opisuje rekonstrukcję posortowanych komórek macierzystych (Lgr5+) i niszowych (Paneth), które dają początek organoidom, umożliwiając jednocześnie ich wcześniejszą modyfikację biochemiczną i genetyczną oraz analizę funkcjonalną.

Test rekonstytucji organoidów (ORA) do analizy funkcjonalnej jelitowych komórek macierzystych i niszowych

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Ten protokół opisuje, jak infekować ludzkie organoidy jelitowe od ich wierzchołkowej lub podstawno-bocznej strony, aby scharakteryzować interakcje gospodarz/patogen na poziomie pojedynczej komórki za pomocą technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq).

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

Poznaj metodę pomiaru integralności bariery jelitowej w trójwymiarowych organoidach myszy przy użyciu testu przepuszczalności z Lucifer yellow. Technika ta pozwala identyfikować induktory i inhibitory bariery jelitowej.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Przeglądaj więcej filmów