Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

W celu zbadania integralności bariery jelitowej opracowaliśmy metodę pomiaru integralności bariery jelitowej w organoidach jelita cienkiego myszy. W przeciwieństwie do tego, odnosimy się do używanej jednowarstwowej hodowli komórkowej, nasz test opiera się na trójwymiarowych organoidach jelita cienkiego. Dostosowanie dwuwymiarowego testu do naszego modelu było niezbędne ze względu na jego praktyczność.

Test opiera się na organoidach hodowanych in vitro, a jego zastosowanie pomoże w określeniu induktorów i inhibitorów integralności bariery jelitowej. Regulacja białek połączeń ścisłych jest ważną cechą wszystkich komórek nabłonkowych. Nasz test umożliwia funkcjonowanie i analizę integralności bariery nabłonkowej.

Aby zmierzyć integralność bariery organoidów wyizolowanych z tkanki jelitowej myszy, należy najpierw wstępnie pokryć wszystkie probówki wirówkowe, które będą używane do przechowywania organoidów podczas procesu posiewu, ilością 0,1% BSA w PBS, aby pokryć wszystkie plastikowe powierzchnie. Natychmiast usuń roztwór BSA i umieść probówki na lodzie. Następnie rozmrozić roztwór macierzy komórkowej i pożywkę do hodowli organoidów na lodzie i ostrożnie wyjąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki 48-dołkowej płytki do hodowli organoidów.

Umyj każdą studzienkę jednym mililitrem zimnego PBS przed energicznym pipetowaniem w celu rozpuszczenia matryc komórkowych. Po uzyskaniu względnie jednorodnych zawiesin komórkowych należy dwukrotnie przemyć organoidy świeżym PBS przez odwirowanie i ponownie zawiesić każdą kulturę organoidów w 40 mikrolitrach zimnej pożywki. Oddziel duże struktury organoidowe za pomocą pięciokrotnej końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zebrać struktury o wielkości od 40 do 60 mikrometrów i wymieszaj każdą zawiesinę organoidu z 40 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu macierzy komórkowej.

Dodaj zawiesinę roztworu matrycy komórek organoidowych do środka poszczególnych studzienek szkiełka nakrywkowego z ośmioma dokładami i umieść szkiełko na okładzie lodowym na pięć minut. Pod koniec inkubacji umieścić szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 minut, aby umożliwić polimeryzację struktury macierzy komórkowej organoidów przed dodaniem 150 mikrolitrów pożywki do hodowli organoidów do każdej studzienki na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji należy poddawać badzienki kontroli dodatniej działaniu 10 nanogramów na mililitr rekombinowanego mysiego interferonu gamma przez 48 godzin.

Aby wykonać test przepuszczalności, przenieś szkiełko nakrywkowe z komorą do komory inkubacyjnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w odwróconym mikroskopie konfokalnym i ustaw dwutlenek węgla w komorze na 5%Zablokuj mocno szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i dostosuj ustawienia obrazowania mikroskopu, aby uwidocznić organoidy w jednej studzience komory. Następnie dodaj trzy mikrolitry świeżo przygotowanego 100-milimolowego żółtego Lucyfera w 150 mikrolitrach pożywki do jednego dołka na godzinną inkubację w komorze mikroskopu. Pod koniec inkubacji dostosuj ostrość, aby uwidocznić światło organoidu referencyjnego i określ wymaganą energię lasera dla wzbudzenia żółtego Lucyfera oraz odpowiednią czułość wykrywania instrumentu, aby zobrazować żółty sygnał Lucyfera przy 30 do 40% dostępnego zakresu dynamiki instrumentu.

Alternatywnie intensywność sygnału można zmodyfikować, zmieniając czas ekspozycji. Aby znaleźć pozycje około 10 organoidów o sferycznej strukturze blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego na studzienkę za pomocą interferencji różnicowej, kontrastuj obrazowanie na żywo, rejestrując organoidy o porównywalnych średnicach i skupiając się na centralnym wycinku organoidów w celu zobrazowania lumenów. Zapisz różnicowy kontrast interferencyjny i żółtą fluorescencję Lucyfera w każdej pozycji, aby udokumentować kształt i autofluorescencję każdego organoidu.

Kiedy wszystkie organoidy zostaną zobrazowane, dodaj 150 mikrolitrów pożywki, w tym żółtej Lucyfera, do studzienek zabiegowych Lucyfera i obrazuj wszystkie dołki co pięć minut przez 70 minut. Pod koniec sesji obrazowania dodać cztery mikrolitry świeżo przygotowanej EGTA do 100 mikrolitrów pożywki. Dodaj rozcieńczoną EGTA do odpowiednich studzienek.

Następnie rejestruj fluorescencję organoidów w każdym studzience co pięć minut przez 30 minut. Należy wcześniej przećwiczyć obchodzenie się z organoidami i hodowlę lub organoidy, ponieważ żywotność i integralność komórek są warunkiem wstępnym powodzenia testu. W tym reprezentatywnym eksperymencie, po 70 minutach leczenia żółtym śródświetlnym Lucyferem, żółta fluorescencja Lucyfera była widoczna tylko w organoidach od zwierząt typu dzikiego leczonych interferonem gamma.

Ani niestymulowane grupy kontrolne, ani organoidy pochodzące od zwierząt z nokautem receptora interferonu gamma-2 nie wykazywały wewnątrzświetlnej żółtej fluorescencji Lucyfera pod koniec okresu leczenia. Dodanie EGTA spowodowało niespecyficzne załamanie integralności bariery jelitowej poprzez sekwestrację kofaktorów połączeń ścisłych, co spowodowało wychwyt i ekspresję żółtego Lucyfera we wszystkich organoidach, niezależnie od pochodzenia i warunków leczenia. Można również określić ilościowo względne wartości intensywności poziomu żółtej fluorescencji Lucyfera w świetle organoidu i na zewnątrz każdego organoidu.

Pamiętaj, aby wybrać organoidy o porównywalnej wielkości wokół konfiguracji i wybrać ustawioną oś tak, aby można było wyobrazić sobie centralne światło organoidu. Oprócz stosowania substancji indukujących rozpad bariery jelitowej, możemy również badać strategie hamowania niszczenia bariery jelitowej. Ponieważ metodologia ta opiera się na pierwotnych komórkach pochodzących od jednego zwierzęcia, może być stosowana w wielu testach, zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do każdego eksperymentu.