Name: Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy transportu i morfologii mitochondriów w neuronach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kontekście dziedzicznej paraplegii spastycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Paraplegii Spastycznej, Fundację Blazer i NIH (R21NS109837).

1. Generowanie neuronów glutaminergicznym kresomózgowia z iPSC
UWAGA: Szczegółowy protokół utrzymywania iPSC i ich różnicowania w neurony glutaminergiczne kresomózgowia są podobne do tych opisanych wcześniej18. W tym miejscu przedstawiono i podkreślono krytyczny proces podczas różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
<ol>
	<li>Hodowla iPSC na karmnikach z mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) w pożywce z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) uzupełnionej czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 4 ng/ml).</li>
	<li>Po inkubacji z dypazą (1 mg/ml) przez 3 minuty należy rozdzielić iPSC na małe grudki. Następnie hoduje iPSC agregowane w zawiesinie w pożywce hESC przez 4 dni. Odnieś się do tego punktu czasowego, w którym iPSC zaczynają się jako posiew zawiesiny, jako dzień 1 (D1). Zmieniaj podłoże codziennie przez 4 dni.</li>
	<li>W D5 zebrać agregaty iPSC po odwirowaniu przy 200 x g przez 2 minuty i hodowli w pożywce do indukcji neuronalnej (NIM) przez 3 dni. Hoduj komórkę agregowaną w zawiesinie przez 3 dni, zmieniając połowę pożywki co 2 dni. Dodaj DMH-1 (2 μM) i SB431542 (2 μM) do pożywki NIM, aby zwiększyć wydajność indukcji neuronalnej.</li>
	<li>W D8 zebrać agregaty iPSC po odwirowaniu przy 200 x g przez 2 minuty i pozwolić im przylegać do 6 dołków (około 20–30 agregatów na dołek płytki) poprzez hodowlę w NIM z 10% FBS (lub z płytkami pokrytymi lamininą) przez noc. Następnego dnia wyjmij starą pożywkę i zmieniaj ją na NIM co 2 dni, aż do D17. 
	UWAGA: W tym okresie obserwuje się wytwarzanie komórek neuronabłonkowych, na co wskazuje tworzenie się komórek walcowatych o strukturach rozetowych.</li>
	<li>W D17 mechanicznie wyizoluj komórki neuronabłonkowe w środku kolonii (podnosząc bezpośrednio przez przyłożenie niewielkiego nacisku do środka kolonii) lub enzymatycznie (potraktowane dypazą). Przenieść izolowane komórki nabłonka nerwowego do niepoddanej działaniu substancji kolby T25 do hodowli tkankowej bez traktowania, zawierającej 8 ml NIM z dodatkiem B27 (1x), cAMP (1 μM) i IGF (10 ng/ml). 
	UWAGA: Hodowla zawiesiny umożliwia komórkom tworzenie neurosfer, które są wzbogacone o progenitory neuronalne z projekcją korową.</li>
	<li>Po D35 umieść neurosfery na pokrytej poliornityną i wolnej od LDEV matrycy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (tabela materiałów) 35-milimetrowych szklanych naczyniach dolnych, aby wygenerować neurony glutaminergiczne kresomózgowia (neurony projekcyjne kory). Przed posiewem należy rozdzielić neurosfery na małe skupiska poprzez inkubację z roztworem do odrywania komórek o stężeniu 1 mg/ml przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór do odrywania komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki różnicującej neurony (NDM). Umieść komórki na szklanym dnie naczynia (około pięciu skupisk na 100 μl podłoża na naczynie), aby umożliwić im przyczepienie się. Następnie dodaj NDM (1 ml na szalkę) i hoduj komórki w NDM zawierającym B27 (1x), cAMP (1 μM), IGF (10 ng / ml), hBDNF (10 ng / ml) i GDNF (10 ng / ml). 
	UWAGA: Małe skupiska są platerowane, ponieważ dobrze przeżywają i dają początek długim neuronom projekcyjnym. Alternatywnie, komórki można zdysocjować i posiać z gęstością około 20 000 komórek na szalkę w celu lepszej separacji.</li>
	<li>Scharakteryzuj neurony glutaminergiczne kresomózgowia poprzez immunobarwienie markerów Tbr1 i βIII-tubuliny.</li>
</ol>
2. Badanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów neuronów glutaminergicznego kresomózgowia
<ol>
	<li>Rozgrzej NDM i włącz inkubator dla mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego na 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Aby uwidocznić mitochondria wzdłuż aksonów neuronów przodomózgowia, inkubuj neurony z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym 50 nM, aby wybarwić mitochondria w żywych komórkach (np. MitoTracker CMXRos) w NDM przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Następnie umyj komórki 2x podgrzanym NDM. Neurony są inkubowane w NDM.</li>
	<li>Aby zarejestrować transport mitochondriów wzdłuż aksonów, należy wykonać zdjęcia poklatkowe ruchu mitochondriów za pomocą obiektywu 40x z mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Aby ustabilizować hodowlę, należy wykonać obrazowanie żywych komórek, gdy komórki są inkubowane w inkubatorze przez 20 minut po barwieniu mitochondriów.</li>
	<li>W polu fazowym zidentyfikuj aksony na podstawie cech morfologicznych (bezpośrednio wyłaniają się z ciała komórki neuronalnej, stałe cienkie długie neuryty bez rozgałęzień). Mitochondria poruszają się w kierunku następczym (od ciała komórki do dystalnego aksonu) i wstecznym (od końca aksonu do ciała komórki). Aby rozróżnić kierunek ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów, wyraźnie zidentyfikuj ciała komórkowe neuronów. Na tym etapie skup aksony pod polem fazowym, aby zmniejszyć fotowybielanie.</li>
	<li>Po rozróżnieniu ciała komórki i aksonu dostosuj czas ekspozycji i skupienie mitochondriów w aksonach. Następnie przechwytuj transport mitochondriów w aksonach co 5 s przez łączny czas 5 minut, uzyskując 60 klatek. Losowo przejmij co najmniej pięć miejsc dla każdego dania i powtórz 3 razy dla każdej grupy.</li>
</ol>
3. Analiza danych dotyczących transportu i morfologii mitochondriów w neuronach korowych
UWAGA: Analizuj zebrane dane dotyczące transportu mitochondrialnego za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ lub MetaMorph19). Ponieważ ImageJ jest łatwo dostępny, przeprowadź analizę transportu i morfologii mitochondriów za pomocą ImageJ z wtyczkami MultiKymograph, Macros i Analyze particles .
<ol>
	<li>Analiza transportu mitochondrialnego za pomocą ImageJ
	<ol>
		<li>Po przechwyceniu poklatkowych obrazów ruchliwości mitochondriów przeanalizuj prędkość i ruch mitochondriów za pomocą wtyczki MultiKymograph. Obrazy są zapisywane jako pliki w formacie .tiff, które są analizowane przez oprogramowanie Fidżi zgodnie z wcześniej zgłoszoną metodą20.</li>
		<li>Pobierz oprogramowanie Fidżi. Pobierz wtyczki, które będą potrzebne do analizy prędkości ruchu mitochondriów z kimogramów. Pobierz pakiet Bio-formats i wtyczkę Kymograph wraz z tymi czterema wtyczkami .class, w tym: MultipleKymograph.class, MultipleOverlay.class, StackDifference.class i WalkingAverage.class (Tabela materiałów). Przenieś te pliki do folderu wtyczek Fidżi. Pobierz wtyczki "tsp050706.txt" do folderu wtyczek. Uruchom ponownie oprogramowanie Fiji, gdy pliki zostaną przeniesione do folderu wtyczek.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie Fiji. Wybierz wtyczki, a następnie zaimportuj obrazy serii .tiff za pomocą Bio-Formats Importer w sekcji Bio-Formats. Upewnij się, że w widoku stosu wybrano opcję Standardowy ImageJ, wybierz pozycję Otwórz wszystkie serie, zaznacz opcję Autoskalowanie, a następnie kliknij przycisk OK. Zwróć uwagę na numer klatki i rozmiar obrazów w pikselach, które są wyświetlane w górnej części obrazu. 
		UWAGA: Zrób 60 klatek na obraz.</li>
		<li>Zastanów się, czy obrazy są wyraźniejsze, dostosowując jasność/kontrast w menu Obraz dla wszystkich 60 klatek.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie linii, aby wybrać linię segmentową i narysować linię segmentowaną, zaczynając od treści komórki i kończąc na aksonie końcowym. Wygeneruj kimograf, wybierając MultipleKymograph w obszarze Wtyczki. Wybór szerokości linii jest wyświetlany po wybraniu MultipleKymograph. Upewnij się, że jest to liczba nieparzysta. Wybierz 1 dla szerokości linii. Po wykonaniu tego kroku generowany jest kimograf. 
		UWAGA: Z kimografu można odczytać kilka ważnych informacji. Oś y kimografu to czas trwania (5 minut) dla 60 klatek. Oś x reprezentuje położenie wybranych aksonów.</li>
		<li>Użyj ukośnej linii w kimografie, aby określić kierunek ruchu mitochondriów (następczy, wsteczny lub stabilny). Na przykład linia biegnąca w dół w prawo wzdłuż osi y wskazuje na ruch następczy, a linia biegnąca w dół w lewo wzdłuż osi y wskazuje na ruch wsteczny. Pionowa linia wskazuje, że w mitochondrium nie było ruchu.</li>
		<li>Zmierz odległość, wartości czasu i prędkość poruszających się mitochondriów za pomocą wtyczki Makra w oprogramowaniu Fidżi. Przejdź do Wtyczki | Makra | Instalacja | tsp050607.txt. Narysuj odcinkową linię nad śladem ruchu mitochondriów na kimografie i zawsze rysuj linię od górnego do dolnego obszaru (oś y).</li>
		<li>Po narysowaniu linii przejdź do zakładki Wtyczki | Makra | Odczyt prędkości z TSP. Ponieważ wzdłuż ścieżki rysowana jest linia podzielona na segmenty, wtyczka odczytuje prędkości segmentowe odpowiadające linii. 
		UWAGA: Jednostką wszystkich danych są piksele. Suma dy to czas zużyty od punktu początkowego, a suma dx wskazuje odległość mitochondrium poruszającego się w osi x. dy now i dx pokazują teraz odpowiednio okres, czas i odległość ruchu dla każdego segmentu. Rzeczywista prędkość pokazuje prędkość dla każdego segmentu (DX TERAZ/DY TERAZ). Średnia prędkość wskazuje średnią prędkość poruszania się mitochondriów (suma DX/suma DY).</li>
		<li>Zmień teraz jednostkę dx z piksela na μm jako stosunek pikseli w μm, mierząc pasek skali. Przelicz jednostkę odległości od piksela na μm, mierząc podziałkę liniową na obrazach. Użyj narzędzia linii, aby narysować linię wzdłuż podziałki liniowej i zmierz długość linii, wybierając opcję Zmierz w sekcji "Analizuj. Zmień czas z piksela na sekundy, ponieważ w tym eksperymencie 1 piksel = 5 sekund.</li>
		<li>W pliku arkusza kalkulacyjnego oblicz średnią prędkość i odpowiednio oznacz ruch wsteczny lub następczy. Uśrednij prędkość ruchu w kierunku następczym lub wstecznym.</li>
		<li>Określ procent stacjonarnych i ruchliwych mitochondriów na podstawie kimografu. Poruszające się mitochondria w kierunku następczym lub wstecznym definiuje się jako poruszające się o 5 μm do przodu lub do tyłu od początku przez cały okres21. Mitochondria uważa się za nieruchome, jeśli nie poruszyły się o więcej niż 5 μm w ciągu 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza morfologii mitochondriów za pomocą ImageJ 
	UWAGA: Określ morfologię mitochondriów, mierząc długość, powierzchnię i proporcje mitochondriów za pomocą ImageJ. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować długość i obszar mitochondriów w aksonach, pobierz wtyczkę Straighten_.jar ze strony ImageJ (patrz Spis materiałów) i przenieś ją do folderu wtyczek. Uruchom ponownie oprogramowanie ImageJ.</li>
		<li>Otwórz obraz za pomocą funkcji otwierania w obszarze Plik i przekonwertuj obraz 32-bitowy na 8-bitowy za pomocą opcji Typ w obszarze Obraz.</li>
		<li>Narysuj linię podzieloną na segmenty wzdłuż aksonów. Wybierz opcję Prostowanie w obszarze Wtyczki i ustaw 50 pikseli dla szerokości filamentu/szerokiej linii. Spowoduje to wygenerowanie wyprostowanego aksonu.</li>
		<li>Dostosuj próg w obszarze Obraz i ustaw pomiar w obszarze Analizuj, wybierając "Obszar | Obwód | Dopasuj elipsę | Deskryptory kształtów.</li>
		<li>Zmierz podziałkę liniową za pomocą funkcji linii i ustaw skalę w obszarze Analizuj, wypełniając odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości. Następnie wybierz pozycję Globalne, aby ustawić to ustawienie skali.</li>
		<li>Użyj opcji Analizuj cząstki w obszarze Analizuj, aby określić obszar. Parametry monitu to rozmiar (piksel^2) = 0,20–nieskończoność, okrągłość = 0,00–1,00 i show = elipsy. Wybierz pozycję Wyświetl wyniki. 
		UWAGA: Pomiar przyniesie wyniki wielu parametrów morfologii mitochondriów, w tym powierzchni, obwodów, długości (główna), szerokości (mniejsza) i współczynnika proporcji (AR). Podawana jest również odpowiednia liczba mitochondrialna.</li>
		<li>Oblicz liczbę mitochondriów na akson (μm), używając liczby mitochondrialnej podzielonej przez długość aksonów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+membranous+and+nonmembranous+cargoes%3A+a+unified+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective.</a> Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).</li>
<li>Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking in neurons.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).</li>
<li>Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).</li>
<li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Course, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+Mitochondrial+Transport+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromethods%22%5BJournal%5D)">Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons.</a> Neuromethods. 123, 49-66 (2017).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+mitochondria+with+fluorescent+dyes+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Mitochondrial+Movement+Within+Neurons%3A+Manual+Versus+Automated+Tracking+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods.</a> Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).</li>
<li>Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html</a> (2015).</li>
<li>Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+biogenesis%2C+defective+axonal+transport+of+mitochondria%2C+abnormal+mitochondrial+dynamics+and+synaptic+degeneration+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).</li>
<li>Denton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+dynamics+underlie+axonal+defects+in+hereditary+spastic+paraplegias%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).</li>
<li>Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parkinsonian+mimetic%2C+MPP%2B%2C+specifically+impairs+mitochondrial+transport+in+dopamine+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).</li>
<li>Shirendeb, U. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin%27s+interaction+with+mitochondrial+protein+Drp1+impairs+mitochondrial+biogenesis+and+causes+defective+axonal+transport+and+synaptic+degeneration+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease.</a> Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).</li>
<li>Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia%3A+clinical-genetic+characteristics+and+evolving+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms.</a> Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).</li>
<li>Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia.</a> Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).</li>
<li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).</li>
<li>Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+rescue+of+axon+growth+defects+in+a+human+iPSC+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+SPG3A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).</li>
<li>Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Time-Lapse+Imaging+in+the+Zebrafish+Lateral+Line%3A+A+Flexible%2C+Open-Ended+Research+Project+for+an+Undergraduate+Neurobiology+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).</li>
<li>Kang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+of+axonal+mitochondria+by+syntaphilin+controls+their+mobility+and+affects+short-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation.</a> Cell. 132 (1), 137-148 (2008).</li>
<li>Mou, Y., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+axonal+defects+by+targeting+mitochondrial+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegias%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias.</a> Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photostable+naphthalimide-based+fluorescent+probe+for+mitochondrial+imaging+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking.</a> Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).</li>
<li>Carvalho, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+benzothiadiazole+fluorophores+for+selective+mitochondrial+imaging+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics.</a> Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).</li>
<li>Yamakoshi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+specific+Raman+probe+based+on+bisarylbutadiyne+for+live+cell+imaging+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantifying+mitochondrial+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">A new method for quantifying mitochondrial axonal transport.</a> Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).</li>
<li>De Vos, K. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+mitochondrial+dynamics+in+living+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells.</a> Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).</li>
<li>Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Axonal+Phenotypes+with+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).</li>
<li>Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+Tracker%3A+ImageJ+plugins+for+fully+automated+analysis+of+multiple+axonal+transport+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).</li>
<li>Reis, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motor+function+in+axonal+transport+in+vivo+probed+by+genetic+and+computational+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).</li>
<li>Broeke, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+cellular+traffic+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of cellular traffic in living cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).</li>
<li>Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+robust+method+for+automated+analysis+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+%3A+EBJ%22%5BJournal%5D)">A fast and robust method for automated analysis of axonal transport.</a> European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).</li>
<li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+kymograph+analysis+for+profiling+axonal+transport+of+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules.</a> Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy.</a> Autophagy. 12, 1(2016).</li>
<li>Metivier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+detection+of+mitochondrial+alterations+in+early+CD95%2FFas%2FAPO-1-triggered+apoptosis+of+Jurkat+T+lymphoma+cells.+Comparison+of+seven+mitochondrion-specific+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes.</a> Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).</li>
<li>Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+proper+fluorescent+dyes%2C+proteins%2C+and+imaging+techniques+to+study+mitochondrial+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells.</a> Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).</li>
<li>Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mitochondrial+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of mitochondrial transport in neurons.</a> Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W artykule opisano metodę analizy transportu i morfologii mitochondriów w aksonach neuronalnych przy użyciu czerwonego barwnika fluorescencyjnego i oprogramowania ImageJ, które stanowią unikalną platformę do badania zwyrodnienia aksonów i morfologii mitochondriów w chorobie neurodegeneracyjnej. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, w tym barwienie mitochondriów, obrazowanie żywych komórek i analiza obrazów. W tej metodzie użyto barwnika fluorescencyjnego do barwienia mitochondriów. Ponieważ ludzkie neurony p...

Ruchliwość i dystrybucja mitochondriów odgrywają istotną rolę w zaspokajaniu zmiennych i wyspecjalizowanych potrzeb energetycznych w spolaryzowanych neuronach. Neurony mogą rozciągać bardzo długie aksony, aby łączyć się z celami poprzez tworzenie synaps, które wymagają wysokiego poziomu energii dla buforowania Ca2+ i prądów jonowych. Transport mitochondriów z somy do aksonu ma kluczowe znaczenie dla wspierania funkcji aksonalnych i synaptycznych neuronów. Przestrzennie i czasowo dynamiczny ruch mitochondriów odbywa się za pomocą szybkiego transportu aksonalnego z prędkością kilku mikrometrów na sekundę1.
W szczególności, białka motoryczne lub adaptorowe, takie jak kinezyna i dyneina, uczestniczą w szybkim transporcie organelli wzdłuż mikrotubul, aby kontrolować ruch mitochondriów2,3. Normalna aktywność neuronalna wymaga prawidłowego transportu nowo powstałych mitochondriów z somy neuronalnej do dystalnego aksonu (następczy transport aksonalny) oraz odwrotnego transportu mitochondriów z dystalnego aksonu z powrotem do ciała komórki (transport wsteczny). Ostatnie badania wykazały, że niewłaściwa alokacja mitochondriów jest silnie związana z defektami neuronów i chorobami zwyrodnieniowymi neuronów ruchowych4,5. Dlatego, aby przeanalizować rolę mitochondriów w neurodegeneracji, ważne jest ustalenie metod badania ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów w żywych kulturach.
Istnieją dwa główne wyzwania związane z badaniem i analizą śledzenia mitochondriów: (1) identyfikowanie mitochondriów z tła w każdej klatce, oraz (2) analizowanie i generowanie połączeń między każdą klatką. Rozwiązując pierwsze wyzwanie, szeroko stosuje się podejście do znakowania fluorescencyjnego w celu odróżnienia mitochondriów od tła, takie jak barwnik MitoTracker lub transfekcja mitochondrialnego białka ukierunkowanego na fluorescencje (np. mito-GFP)6,7,8. Aby przeanalizować związek między ramkami, w poprzednich badaniach opisano kilka algorytmów i narzędzi programowych9. W niedawnym artykule naukowcy porównali cztery różne zautomatyzowane narzędzia (np. Volocity, Imaris, wrMTrck i Difference Tracker) w celu ilościowego określenia transportu mitochondrialnego. Wyniki pokazały, że pomimo rozbieżności w długości ścieżki, przemieszczeniu mitochondriów, czasie trwania ruchu i prędkości, te zautomatyzowane narzędzia są odpowiednie do oceny różnic w transporcie po leczeniu10. Oprócz tych narzędzi, zintegrowana wtyczka "Macros" dla ImageJ (napisana przez Rietdorfa i Seitza) jest szeroko stosowana do analizy transportu mitochondrialnego11. Ta metoda generuje kimografy, które można wykorzystać do analizy ruchu mitochondriów, w tym prędkości zarówno w kierunku następczym, jak i wstecznym.
Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które nieustannie zmieniają liczbę i morfologię w odpowiedzi na warunki fizjologiczne i patologiczne. Rozszczepienie i fuzja mitochondriów ściśle regulują morfologię i homeostazę mitochondriów. Brak równowagi między rozszczepieniem mitochondriów a fuzją może indukować bardzo krótkie lub długie sieci mitochondrialne, co może upośledzać funkcję mitochondriów i powodować nieprawidłową aktywność neuronów i neurodegenerację. Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i dziedziczna paraplegia spastyczna (HSP)12,13,14,15. HSP to niejednorodna grupa dziedzicznych zaburzeń neurologicznych charakteryzujących się zwyrodnieniem drogi korowo-rdzeniowej i wynikającym z tego brakiem kontroli mięśni kończyn dolnych16,17. W tym badaniu neurony przodomózgowia pochodzące z iPSC są wykorzystywane do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w HSP. Metoda ta zapewnia unikalny paradygmat do badania dynamiki mitochondriów aksonów neuronalnych w żywych kulturach.

<table><tbody><tr><td>Rozwiązanie Accutase Cell Detachment Innowacyjne</td><td>technologie komórkowe</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 SERIES A2</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>Wirówka Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R/ </td><td></td>75004261</tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Chemiglass Nauki przyrodnicze</td><td>1760-012</td><td></td></tr><tr><td>Cykliczny AMP (cAMP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Selleckchem</td><td>S7146</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 (DMEM/F12)</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16141-002</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2, bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Obniżony czynnik wzrostu Macierz błony podstawnej</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>Gem21 NeuroPlex Suplement bez serum</td><td>Gemini</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Szklane pipety 9''</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik glejowy (BDNF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Insulinowy czynnik wzrostu 1 (IGF1)</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik</td> <td>surowicy nokautującejGibco</td><td>A31815</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L-6274</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 NeuroPle Bez serum Suplement</td><td>Gemini</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus IX83</td><td>Olympus</td><td>IX83-ZDC2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Olympus</td><td>CKX41/ IX2-SLP</td><td></td></tr> płytki <tr><td>6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny (poliornityna))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny jednorazowy system filtracji próżniowej 50 ml 0,22 i mu; m Millipore Express&reg; Plus Membrana</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 500/1000 ml Durapore 0,22 &mu; M PVDF</td><td>Przeciwciało milipore</td><td>SCGVU10RE</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1 (1:2000)</td><td>Chemicon</td><td>AB9616</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Gibco</td><td>17075029</td><td></td></tr><tr><td>probówki 50 ml Probówki</td><td>Phenix</td><td>SS-PH50R</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Kolby</td><td>Phenix</td><td>SS-PH15R</td><td></td></tr><tr><td>T25 (nieobrobione)</td><td>VWR</td><td>10861-572</td><td></td></tr><tr><td> Wtyczki do oprogramowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-formats Package</td><td><a href="http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/" target="_blank">http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td><a href="https://fiji.sc/" target="_blank">https://fiji.sc/</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka Kymograph</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultipleKymograph.class</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultipleOverlay.class</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WalkingAverage.class</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>StackDifference.class</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straighten_.jar</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tsp050706.txt</td><td><a href="https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html" target="_blank">https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurony mają duże zapotrzebowanie na energię, aby wspierać swoje funkcje. W ludzkich neuronach zaobserwowano upośledzony transport mitochondrialny wzdłuż aksonów, co może przyczyniać się do neurodegeneracji w różnych stanach chorobowych. Chociaż badanie dynamiki mitochondriów w żywych ludzkich nerwach jest trudne, takie paradygmaty mają kluczowe znaczenie dla badania roli mitochondriów w neurodegeneracji. Opisano tutaj protokół analizy transportu mitochondrialnego i morfologii mitochondriów w aksonach neuronów przodomózgowia pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). IPSC są różnicowane w neurony glutaminergiczne kresomózgowia przy użyciu dobrze znanych metod. Mitochondria neuronów są barwione za pomocą MitoTracker CMXRos, a ruchy mitochondriów w obrębie aksonów są rejestrowane za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek wyposażonego w inkubator do hodowli komórek. Obrazy poklatkowe są analizowane za pomocą oprogramowania z wtyczkami "MultiKymograph", "Bioformat importer" i "Macros". Generowane są kimografy transportu mitochondrialnego, a z kimografu odczytywana jest średnia prędkość mitochondrialna w kierunku następczym i wstecznym. Jeśli chodzi o analizę morfologii mitochondriów, długość, obszar i proporcje mitochondriów uzyskuje się za pomocą ImageJ. Podsumowując, protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondriów wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii w celu ułatwienia badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

W niniejszej pracy ludzkie iPSC zróżnicowano w telencefalne neurony glutaminergiczne, które scharakteryzowano za pomocą immunobarwienia markerami Tbr1 i βIII tubuliną (Rysunek 1A). Aby zbadać transport aksonalny mitochondriów, komórki te zabarwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym i przeprowadzono obrazowanie time-lapse. Ponieważ ImageJ jest powszechnie dostępny i łatwiejszy do pozyskania, transport mitochondriów analizowano dalej przy użyciu wtyczek do ImageJ „MultiKym...

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Dysfunkcja mitochondriów leży u podstaw wielu chorób neurodegeneracyjnych. Nasz protokół stanowi ważne narzędzie do badania dynamiki mitochondriów w aksonach, ułatwiając badanie chorób neurologicznych związanych ze zwyrodnieniem aksonów. Łącząc znakowanie mitochondriów, obrazowanie żywych komórek i technologię indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, nasz protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania transportu mitochondriów wzdłuż ludzkich aksonów i analizy ich morfologii.Upośledzony transport i morfologię mitochondriów można zaobserwować w hodowlach komórek macierzystych i modelach zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych, które stanowią potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu tych chorób. Po trzydziestym piątym dniu hodowli rozdziel neurosfery zróżnicowane od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na małe skupiska za pomocą 1 mg / ml roztworu do odrywania komórek przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zebrać klastry komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze NDM.Płytka około pięciu klastrów komórek w stu mikrolitrach pożywki na poliornitynę i dehydrogenazę laktozy, podnoszącą wolną od wirusa matrycę błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, pokryte 35-milimetrowymi szklanymi naczyniami dolnymi. Następnie dodaj jeden mililitr NDM uzupełniony witaminą B27, cyklicznym monofosforanem adenozyny, insulinopodobnym czynnikiem wzrostu, czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z ludzkiego mózgu i czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z komórek glejowych do każdej hodowli. Aby uwidocznić mitochondria wzdłuż aksonów neuronów przodomózgowia, najpierw zabarwić neurony 50 nanomolowym czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w NDM przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie przepłukać je w ciepłym NDM.Następnie umieść kulturę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i wybierz obiektyw 40X. W polu fazowym zidentyfikuj aksony na podstawie ich cech morfologicznych. Aby rozróżnić kierunek ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów, wyraźnie zidentyfikuj ciała komórkowe neuronów.Po rozróżnieniu ciała komórki i aksonu dostosuj czas ekspozycji i skupienie mitochondriów w aksonach i uchwyć transport mitochondrialny w aksonach co pięć sekund, w sumie przez pięć minut. Aby przeanalizować transport mitochondrialny w ImageJ, otwórz Fiji i wybierz wtyczkę Bio-Formats. Użyj importera Bio-Formats, aby zaimportować obrazy poklatkowe serii tiff i wybierz standardowe ImageJ i Otwórz wszystkie serie.Zaznacz automatyczne skalowanie podzielonych kanałów i kliknij OK, zwracając uwagę na numer klatki i rozmiar obrazów w pikselach. Po dostosowaniu jasności i kontrastu dla wszystkich 60 klatek użyj linii segmentowej, aby narysować linię od korpusu komórki do aksonu końcowego. Aby wygenerować Kymograph, wybierz wtyczkę Multiple Kymograph i wybierz szerokość linii.Aby zmierzyć odległość, wartości czasu i prędkość poruszających się mitochondriów, otwórz tsp050607. txt we wtyczce makr. I narysuj odcinkową linię nad śladem ruchu mitochondriów na kimografie od górnego do dolnego obszaru.Po narysowaniu linii otwórz odczyt prędkości z tsp we wtyczce makr, aby odczytać prędkości segmentowe odpowiadające linii. Następnie otwórz oryginalny obraz i użyj narzędzia linia, aby narysować linię wzdłuż paska skali. Wybierz opcję Analizuj, aby zmierzyć długość linii i przekonwertować teraz wartość dx oraz jednostki odległości z pikseli na mikrometry.Następnie zmień czas z piksela na sekundy. Aby przeanalizować długość i obszar mitochondriów w aksonach w ImageJ, zainstaluj wtyczkę prostowanie podkreślenia kropki JAR i otwórz interesujący obraz aksonu. Przekonwertuj obraz 32-bitowy na ośmiobitowy i użyj narzędzia linii segmentowej, aby prześledzić akson.Wybierz wtyczkę Prostuj podkreślenie JAR i ustaw szerokość szerokiej linii filamentu na 50 pikseli. Ponownie prześledź akson, aby wygenerować wyprostowany akson i dostosować próg obrazu. Wybierz opcję Analizuj, ustaw pomiary, dopasowanie obwodu, elipsę i kształt, aby ustawić pomiar, a następnie użyj funkcji linii, aby zmierzyć podziałkę liniową na oryginalnym obrazie, jak pokazano.W obszarze Analizuj i ustaw skalę, wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości, aby ustawić skalę. Następnie wybierz opcję globalną, aby ustawić skalę dla wszystkich obrazów. Na koniec wybierz Analizuj i Analizuj cząstki, aby określić obszar i wybierz Wyświetl wyniki, aby wyświetlić wynikowy pomiar.Po różnicowaniu się w neurony glutaminergiczne kresomózgowiowe, komórki można scharakteryzować ekspresją markera tubuliny T-B-R jednego i beta trzech. Barwienie czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym i obrazowanie poklatkowe pozwala na ocenę transportu aksonalnego mitochondriów. Pojedyncze mitochondrium może pozostać statyczne lub poruszać się w kierunku następczym lub wstecznym w obrębie aksonu.Prędkość ruchu mitochondriów wzdłuż aksonu można określić ilościowo, jak pokazano na ilustracji. Na przykład, korzystając z dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego, odsetek ruchliwych mitochondriów jest znacznie zmniejszony w neuronach S-P-G-3-A w porównaniu z neuronami typu dzikiego. Aby przeanalizować długość obszaru mitochondriów i współczynnik proporcji, aksony można wyprostować w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybrać, dostosowując próg.Obszar mitochondriów, obwód, długość, szerokość i współczynnik kształtu można następnie uzyskać z wyprostowanego aksonu. Na przykład zarówno długość mitochondriów, jak i proporcje są znacznie zmniejszone w aksonach neuronów S-P-G 15 w porównaniu z aksonami typu dzikiego w kontrolnej. Ważne jest, aby podgrzać pożywkę i inkubator mikroskopowy, aby delikatnie umyć komórki i pozwolić komórkom ustabilizować się przez dwadzieścia minut przed obrazowaniem.Po obrazowaniu żywych komórek hodowle można utrwalić i poddać barwieniu immunologicznemu w celu zbadania ekspresji innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Badanie dynamiki mitochondriów w żywych ludzkich nerwach jest trudne. Technika ta stanowi unikalne narzędzie do badania dynamiki mitochondriów i zwyrodnienia nerwów w chorobach neurologicznych.

analyzing-mitochondrial-transport-morphology-human-induced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Organoidy mózgowe stanowią cenny model dla badań nad encefalomiopatią mitochondrialną, kwasicą mlekową oraz epizodami podobnymi do udaru (MELAS), oferując wgląd w ich podstawową patofizjologię i stanowiąc platformę do badań przesiewowych leków. Organoidy pochodzące z linii komórkowych o różnym poziomie heteroplazmy genów wywołujących chorobę wykazują istotne różnice fenotypowe.

Modelowanie chorób mitochondrialnych za pomocą organoidów mózgowych: Skupienie się na encefalomiopatii mitochondrialnej, kwasicy mlekowej oraz epizodach podobnych do udaru

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Poznaj metodę analizy transportu i morfologii mitochondriów w neuronach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kontekście dziedzicznej paraplegii spastycznej.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Przeglądaj więcej filmów