Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej
9 lutego 2020
Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.
Dysfunkcja mitochondriów leży u podstaw wielu chorób neurodegeneracyjnych. Nasz protokół stanowi ważne narzędzie do badania dynamiki mitochondriów w aksonach, ułatwiając badanie chorób neurologicznych związanych ze zwyrodnieniem aksonów. Łącząc znakowanie mitochondriów, obrazowanie żywych komórek i technologię indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, nasz protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania transportu mitochondriów wzdłuż ludzkich aksonów i analizy ich morfologii.
Upośledzony transport i morfologię mitochondriów można zaobserwować w hodowlach komórek macierzystych i modelach zwierzęcych chorób neurodegeneracyjnych, które stanowią potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu tych chorób. Po trzydziestym piątym dniu hodowli rozdziel neurosfery zróżnicowane od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na małe skupiska za pomocą 1 mg / ml roztworu do odrywania komórek przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zebrać klastry komórek przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze NDM.
Płytka około pięciu klastrów komórek w stu mikrolitrach pożywki na poliornitynę i dehydrogenazę laktozy, podnoszącą wolną od wirusa matrycę błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu, pokryte 35-milimetrowymi szklanymi naczyniami dolnymi. Następnie dodaj jeden mililitr NDM uzupełniony witaminą B27, cyklicznym monofosforanem adenozyny, insulinopodobnym czynnikiem wzrostu, czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z ludzkiego mózgu i czynnikiem neurotroficznym pochodzącym z komórek glejowych do każdej hodowli. Aby uwidocznić mitochondria wzdłuż aksonów neuronów przodomózgowia, najpierw zabarwić neurony 50 nanomolowym czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym w NDM przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie przepłukać je w ciepłym NDM.
Następnie umieść kulturę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego i wybierz obiektyw 40X. W polu fazowym zidentyfikuj aksony na podstawie ich cech morfologicznych. Aby rozróżnić kierunek ruchu mitochondriów wzdłuż aksonów, wyraźnie zidentyfikuj ciała komórkowe neuronów.
Po rozróżnieniu ciała komórki i aksonu dostosuj czas ekspozycji i skupienie mitochondriów w aksonach i uchwyć transport mitochondrialny w aksonach co pięć sekund, w sumie przez pięć minut. Aby przeanalizować transport mitochondrialny w ImageJ, otwórz Fiji i wybierz wtyczkę Bio-Formats. Użyj importera Bio-Formats, aby zaimportować obrazy poklatkowe serii tiff i wybierz standardowe ImageJ i Otwórz wszystkie serie.
Zaznacz automatyczne skalowanie podzielonych kanałów i kliknij OK, zwracając uwagę na numer klatki i rozmiar obrazów w pikselach. Po dostosowaniu jasności i kontrastu dla wszystkich 60 klatek użyj linii segmentowej, aby narysować linię od korpusu komórki do aksonu końcowego. Aby wygenerować Kymograph, wybierz wtyczkę Multiple Kymograph i wybierz szerokość linii.
Aby zmierzyć odległość, wartości czasu i prędkość poruszających się mitochondriów, otwórz tsp050607. txt we wtyczce makr. I narysuj odcinkową linię nad śladem ruchu mitochondriów na kimografie od górnego do dolnego obszaru.
Po narysowaniu linii otwórz odczyt prędkości z tsp we wtyczce makr, aby odczytać prędkości segmentowe odpowiadające linii. Następnie otwórz oryginalny obraz i użyj narzędzia linia, aby narysować linię wzdłuż paska skali. Wybierz opcję Analizuj, aby zmierzyć długość linii i przekonwertować teraz wartość dx oraz jednostki odległości z pikseli na mikrometry.
Następnie zmień czas z piksela na sekundy. Aby przeanalizować długość i obszar mitochondriów w aksonach w ImageJ, zainstaluj wtyczkę prostowanie podkreślenia kropki JAR i otwórz interesujący obraz aksonu. Przekonwertuj obraz 32-bitowy na ośmiobitowy i użyj narzędzia linii segmentowej, aby prześledzić akson.
Wybierz wtyczkę Prostuj podkreślenie JAR i ustaw szerokość szerokiej linii filamentu na 50 pikseli. Ponownie prześledź akson, aby wygenerować wyprostowany akson i dostosować próg obrazu. Wybierz opcję Analizuj, ustaw pomiary, dopasowanie obwodu, elipsę i kształt, aby ustawić pomiar, a następnie użyj funkcji linii, aby zmierzyć podziałkę liniową na oryginalnym obrazie, jak pokazano.
W obszarze Analizuj i ustaw skalę, wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość i jednostkę długości, aby ustawić skalę. Następnie wybierz opcję globalną, aby ustawić skalę dla wszystkich obrazów. Na koniec wybierz Analizuj i Analizuj cząstki, aby określić obszar i wybierz Wyświetl wyniki, aby wyświetlić wynikowy pomiar.
Po różnicowaniu się w neurony glutaminergiczne kresomózgowiowe, komórki można scharakteryzować ekspresją markera tubuliny T-B-R jednego i beta trzech. Barwienie czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym i obrazowanie poklatkowe pozwala na ocenę transportu aksonalnego mitochondriów. Pojedyncze mitochondrium może pozostać statyczne lub poruszać się w kierunku następczym lub wstecznym w obrębie aksonu.
Prędkość ruchu mitochondriów wzdłuż aksonu można określić ilościowo, jak pokazano na ilustracji. Na przykład, korzystając z dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego, odsetek ruchliwych mitochondriów jest znacznie zmniejszony w neuronach S-P-G-3-A w porównaniu z neuronami typu dzikiego. Aby przeanalizować długość obszaru mitochondriów i współczynnik proporcji, aksony można wyprostować w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybrać, dostosowując próg.
Obszar mitochondriów, obwód, długość, szerokość i współczynnik kształtu można następnie uzyskać z wyprostowanego aksonu. Na przykład zarówno długość mitochondriów, jak i proporcje są znacznie zmniejszone w aksonach neuronów S-P-G 15 w porównaniu z aksonami typu dzikiego w kontrolnej. Ważne jest, aby podgrzać pożywkę i inkubator mikroskopowy, aby delikatnie umyć komórki i pozwolić komórkom ustabilizować się przez dwadzieścia minut przed obrazowaniem.
Po obrazowaniu żywych komórek hodowle można utrwalić i poddać barwieniu immunologicznemu w celu zbadania ekspresji innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Badanie dynamiki mitochondriów w żywych ludzkich nerwach jest trudne. Technika ta stanowi unikalne narzędzie do badania dynamiki mitochondriów i zwyrodnienia nerwów w chorobach neurologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje transport i morfologię mitochondriów w neuronach przedmózgowia pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w kontekście dziedzicznej spastycznej paraplegii. Protokół umożliwia szczegółową ocenę dynamiki mitochondriów wzdłuż aksonów, co przyczynia się do zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Choroby neurodegeneracyjne
Wstęp
- Dysfunkcja mitochondriów jest kluczowym czynnikiem w różnych chorobach neurodegeneracyjnych.
- Zaburzenia transportu i morfologii mitochondriów powiązano z degeneracją aksonalną.
- Wykorzystanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych zapewnia odpowiedni model do badania ludzkich procesów neuronalnych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu badania zachowania mitochondriów w aksonach.
- Wyjaśnienie zależności między dynamiką mitochondriów a mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych.
- Identyfikacja potencjalnych celów terapeutycznych dla schorzeń takich jak dziedziczna spastyczna paraplegia.
Zastosowane metody
- Hodowla komórkowa neuronów przedmózgowia pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych.
- Obrazowanie żywych komórek w połączeniu z znakowaniem mitochondriów w celu oceny śledzenia mitochondriów.
- Kluczowe etapy obejmują dysocjację neurosfer oraz prawidłowe barwienie barwnikami fluorescencyjnymi.
- Analiza obrazów przeprowadzona przy użyciu programu ImageJ, obejmująca generowanie kymografów.
Główne wyniki
- Charakterystyka transportu mitochondriów ujawniła istotne różnice w dynamice mitochondrialnej.
- Ilościowe określenie długości i ruchu mitochondriów wykazało obniżoną ruchliwość w neuronach pochodzących z modeli dziedzicznej spastycznej paraplegii.
- Wyniki podkreślają znaczenie funkcji mitochondriów w zdrowiu i chorobach układu nerwowego.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza kluczowego podejścia eksperymentalnego do analizy dynamiki mitochondriów w kontekście neurodegeneracji.
- Uzyskane informacje mogą stać się podstawą dla przyszłych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję mitochondriów.
- Zastosowana metodologia może poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmów neuronalnych i progresji choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednią ocenę transportu i morfologii mitochondriów w neuronach pochodzących z ludzkich iPSC, wypełniając istotną lukę w modelowaniu mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych. Poprzez ilościowe określenie prędkości transportu anterogradego i retrogradego, długości, pola powierzchni oraz współczynnika kształtu mitochondriów, metoda ta pozwala na mechanistyczną weryfikację celów w ramach walidacji szlaków degeneracji aksonalnej. Podejście to zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć, łącząc dysfunkcję mitochondriów z efektami fenotypowymi istotnymi dla dziedzicznej spastycznej paraplegii oraz schorzeń pokrewnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie deficytów transportu mitochondriów jako funkcjonalnego wskaźnika ryzyka neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki standaryzowanemu pomiarowi motywności i morfologii mitochondriów w ludzkich neuronach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków w ramach portfolio poprzez identyfikację substancji przywracających prędkość transportu lub parametry morfologiczne w modelach pochodzących z iPSC.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje dane ilościowe, w tym prędkość mitochondriów (µm/s), ich długość, powierzchnię oraz współczynnik kształtu, do wykorzystania w kampaniach przesiewowych związków.
- Powtarzalność: Wykorzystuje zestandaryzowaną analizę kymografów oraz morfometrię opartą na programie ImageJ, aby zapewnić spójne i skalowalne wyniki we wszystkich eksperymentach.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ustanawia powtarzalny schemat obrazowania i analizy do oceny funkcji mitochondriów w różnych modelach różnicowania neuronów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje deficyty mitochondrialne obserwowane w neuronach przy spastycznej paraplegii dziedzicznej, umożliwiając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając system istotny dla człowieka do oceny zaangażowania celu terapeutycznego.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Informuje o kryteriach postępu poprzez korelację ratowania mitochondriów z poprawą fenotypową w zakresie integralności aksonalnej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez w walidacji celów oraz umożliwiając identyfikację związków wiodących poprzez funkcjonalne odczyty mitochondrialne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie dynamiki mitochondrialnej jako fenotypu powiązanego ze szlakiem w procesach neurodegeneracji.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników dotyczących transportu i struktury mitochondriów w celu oceny wpływu związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary prędkości, długości, pola powierzchni i współczynnika kształtu, które umożliwiają bezpośrednie porównanie warunków genetycznych lub terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy z pracami przedklinicznymi poprzez istotne dla choroby fenotypy neuronalne i biomarkery mitochondrialne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako modułowa możliwość oceny kondycji mitochondriów w wielu modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie defektów transportu mitochondrialnego z modelami chorób neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zwalidowanym protokołom obrazowania i analizy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, predykcyjnych dla ludzi wyników dotyczących funkcji mitochondriów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie przywrócenia dynamiki mitochondriów aksonalnych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w różnicowaniu iPSC, obrazowaniu żywych komórek oraz fluorescencyjnym znakowaniu mitochondriów.
- Zależne od mikroskopii fluorescencyjnej z kontrolą środowiskową oraz oprogramowania analitycznego umożliwiającego tworzenie kymografów.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji parametrów akwizycji i analizy obrazów w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody podczas stosowania jej do różnych podtypów neuronów lub modeli chorobowych.
- Ograniczone koniecznością optymalizacji technicznej w zakresie progowania obrazu i wyboru linii kymografu dla dokładnego pomiaru prędkości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Telencephalic Glutamatergic Neuron Generation
1:49
Time-Lapse Imaging of Mitochondrial Transport Along Telencephalic Glutamatergic Neuron Axons
2:44
Cortical Neuron Mitochondrial Transport Analysis
4:17
Cortical Neuron Mitochondrial Morphology Analysis
5:32
Results: Representative Mitochondrial Transport and Morphology Analyses
6:47
Conclusion
