Name: Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj technikę fuzji komórkowej linii z fluorescencyjnie znakowanymi białkami w celu badania homeostazy organelli i odpowiedzi komórkowych na perturbacje strukturalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship dla R.M. (numer https://wellcome.ac.uk/grant 100090/12/Z). Grantodawca nie odgrywał żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Ashokowi Venkitaramanowi i Paulowi Frenchowi za krytyczne rady i wskazówki dotyczące projektu. Dziękujemy Chiarze Cossetti i Gabrieli Grondys-Kotarbie z Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry za doskonałe wsparcie. Dziękujemy Liamowi Cassidayowi, Thomasowi Millerowi i Gianmarco Contino za korektę rękopisu.

1. Różnicowe znakowanie komórek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Znakowanie genów za pomocą CRISPR Cas9
	<ol>
		<li>Użyj edycji genomu CRISPR Cas9, aby oznaczyć rootletynę (lub inne interesujące geny) za pomocą białek fluorescencyjnych meGFP lub mScarlet-I w ludzkich liniach komórkowych raka. 
		nuta: Szczegółowe protokoły edycji genomu są omówione gdzie indziej24,25,26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie barwnikami fluorescencyjnymi
	<ol>
		<li>Hoduj ludzkie komórki rakowe Cal51 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), L-glutaminą i 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze. 
		nuta: Ważne jest, aby zapewnić, że komórki są regularnie sprawdzane pod kątem braku zanieczyszczenia mykoplazmą oraz tożsamości linii komórkowej. Nie należy używać komórek, które zostały w znacznym stopniu pasażowane w hodowli (>15 pasaży). Komórki muszą być zdrowe i rosnąć wykładniczo. Unikaj niedostatecznej lub nadmiernej konfluencji.</li>
		<li>Wysiewaj każdy typ komórek (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I i rodzicielskie nieoznakowane komórki Cal51) tak, aby ~6 x 106 komórek było obecnych następnego dnia dla każdej próbki, przy zbiegu 70−90%. 
		nuta: Jest to w przybliżeniu jedna kolba do hodowli tkankowych T75 lub jedna 10-centymetrowa półka na każdy typ komórki. Nieoznaczone komórki rodzicielskie są wymagane jako kontrola negatywna w dalszej części protokołu. Protokół ten pozwala na produkcję ~ 20 000 połączonych komórek, ale liczba ta może zostać zwiększona poprzez skalowanie protokołu ze zwiększoną liczbą partii.</li>
		<li>Następnego dnia podgrzej DMEM, trypsynę i 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyj komórki rootletin-meGFP i rootletin-mScarlet-I 2x w PBS, wylewając lub odsysając pożywkę i zastępując 10 ml PBS.</li>
		<li>Oznacz komórki Cal51 rootletin-meGFP, dodając 500 nM barwnika z komórek fioletowych (tabela materiałów) w PBS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Oznacz komórki korzenia Cal51 mScarlet-I, dodając 200 nM barwnika dalekich krwinek czerwonych (tabela materiałów) w PBS przez 1 minutę w RT. 
		nuta: Tam, gdzie to możliwe, po barwieniu fluorescencyjnym próbki należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania fluorescencji.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcje znakowania barwnika, dodając 10 ml DMEM na 5 minut.</li>
		<li>Usuń nieoznakowane rodzicielskie komórki Cal51 z inkubatora (od kroku 1.2.2). 
		nuta: Komórki te zostaną później wykorzystane jako nieznakowane kontrole ujemne (etap 3.3.2).</li>
		<li>Umyj wszystkie komórki raz, odlewając pożywkę wzrostową i zastępując 10 ml PBS.</li>
		<li>Odlej PBS i inkubuj przez 5 minut w warunkach hodowli z 1 ml wstępnie podgrzanej 1x trypsyny.</li>
		<li>Przenieść komórki do plastikowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 1000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Ostrożnie usuń i wyrzuć trypsynę z osadu komórkowego za pomocą pipety.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić ponownie fioletowe i dalekie od czerwieni oznaczone granulki komórek w 1 ml PBS.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić macierzysty (niefluorescencyjny) osad komórkowy w 1 ml DMEM i wrócić do inkubatora. 
		nuta: Próbka ta nie zostanie poddana fuzji komórka-komórka, ale zostanie wykorzystana później podczas cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fuzja komórka-komórka
<ol>
	<li>Wymieszaj 3 x 106 komórek znakowanych na fioletowo z 3 x 106 komórek znakowanych na czerwono w probówce o pojemności 15 ml, delikatnie pipetując razem po 0,5 ml każdego typu komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Odwirować pozostałe niezmieszane komórki z kroku 2.1 przy 1 000 x g przez 5 minut, następnie odlać PBS, ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM i powrócić do inkubatora. 
	nuta: Te pozostałe niezmieszane, znakowane pojedynczo próbki zostaną później wykorzystane jako kontrole ujemne i kompensacyjne określone w sekcji 3 protokołu.</li>
	<li>Odwirować zmieszane komórki z kroku 2.1 przy 1 000 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Dodawać kroplami 0,7 ml 50% roztworu 1450 PEG do osadu komórkowego (krok 2.3) za pomocą pipety o pojemności 1 ml przez okres 30 sekund.</li>
	<li>Pozostaw na 3,5 min w RT. 
	nuta: Czas inkubacji z PEG może być zoptymalizowany w zależności od typu komórki, chociaż należy pamiętać, że dłuższy czas inkubacji zwiększa toksyczność komórek.</li>
	<li>Dodaj kroplami 10 ml DMEM bez surowicy przez 30 s i pozostaw w inkubatorze na 10 minut.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml kompletnego podłoża (DMEM zawierającego FBS). 
	nuta: Przejdź bezpośrednio do sekcji 3. Istnieje toksyczność związana z ekspozycją na PEG, po której następuje cytometria przepływowa i obrazowanie, więc utrzymuj komórki w warunkach hodowli w jak największym stopniu, postępując szybko między etapami.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia połączonych komórek
<ol>
	<li>Przygotować wszystkie komórki do cytometrii przepływowej, delikatnie pipetując każdą próbkę oddzielnie przez filtr 70 μm do probówki FACS. 
	nuta: Wymagane są cztery próbki: komórki zrośnięte, pojedynczo znakowane krwinki dalekiej czerwieni, pojedynczo znakowane komórki fioletowe, nieznakowane komórki rodzicielskie. Po wyjęciu z okapu do hodowli tkanek sterylnych komórki mają zdolność do zakażenia, dlatego od tego momentu należy zminimalizować czas ekspozycji próbek na niesterylne środowisko. Komórki są sortowane w kompletnym pożywce DMEM.</li>
	<li>Użyj cytometru zdolnego do sortowania pojedynczych komórek.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj sortownik komórek do sortowania aseptycznego. Przeprowadź kontrolę jakości przyrządu zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Narysuj wykres rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego oraz wykres dyskryminacji dubletowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz bramki, aby zidentyfikować połączone komórki.
	<ol>
		<li>Wzbudzić barwniki fluorescencyjne o długości fal 405 nm i 635 nm. Wykrywanie przy 450 nm i 660 nm (odpowiednio długości fal fioletowej i dalekiej czerwieni). Wykreśl dalekie długości fal czerwonych i fioletowych.</li>
		<li>Przepuść nieoznakowane komórki rodzicielskie przez cytometr i zapisz intensywność fluorescencji. 
		nuta: Wartości powyżej tej linii bazowej określają dodatniość dla barwienia barwnikiem.</li>
		<li>Przepuść pojedyncze znakowane fioletowe komórki przez cytometr. Upewnij się, że nie ma rozlewania się fioletu do dalekiego kanału czerwonego.</li>
		<li>Przepuścić pojedyncze znakowane dalekie krwinki czerwone przez cytometr i upewnić się, że nie ma rozlania się dalekiej czerwieni do kanału fioletowego. 
		nuta: W przypadku reprezentatywnych danych pokazano, komórki sortowano pod ciśnieniem 20 psi na sortowniku wyposażonym w dyszę 100 μm.</li>
		<li>Uruchom na krótko próbkę fuzji, aby potwierdzić, że połączone komórki są widoczne z bramkami utworzonymi w kroku 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównaj strumień sortowania centralnie w 8-dołkowej misce do obrazowania.</li>
	<li>FACS sortuje połączone komórki, obecne jako podwójnie dodatnie komórki znakowane fioletem i daleką czerwienią, bezpośrednio do 8-dołkowej naczynia obrazowania zawierającej 100 μl pożywki wzrostowej. 
	nuta: Maksymalna zalecana liczba komórek to ~50 000 na 8-dołkowe naczynie. Zadbaj o zdrowie komórek podczas sortowania. Konfluencja komórek może wpływać na zdrowie komórek, więc utrzymuj komórki między 20-90% konfluencji po sortowaniu, sortując odpowiednią liczbę komórek do naczynia do obrazowania. Każda posortowana kropla zawiera około 3 nl płynu w osłonce. Upewnij się, że płyn osłonowy nie rozcieńcza znacząco podłoża wzrostowego podczas sortowania.</li>
	<li>Bezpośrednio po sortowaniu należy zabrać komórki z powrotem do inkubatora i pozostawić na >2 godziny lub na noc. 
	>nuta: W tym okresie przylegające komórki będą stopniowo ponownie przylegać do szkiełka nakrywkowego, począwszy od sortowania, a zatem ich morfologia zmieni się z czasem, jeśli zostaną pobrane bezpośrednio pod mikroskop.</li>
</ol>
4. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie fuzji komórka-komórka
UWAGA: Połączone komórki mogą być obrazowane na żywo lub po utrwaleniu i dalszym barwieniu fluorescencyjnym (lub obu), w zależności od wymaganych eksperymentów i pomiarów.
<ol>
	<li>Obrazowanie żywych komórek
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę wzrostową pożywką obrazową bez czerwieni fenolowej (tabela materiałów) i przejdź bezpośrednio do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i barwienie
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS.</li>
		<li>Utrwalić komórki, inkubując je w 100 μl 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć PFA po 15 min. 
		ostrożność: PFA jest toksyczny w przypadku wdychania, dlatego ten etap należy wykonać w dygestoriach z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej. 
		nuta: Po fiksacji eksperyment można wstrzymać i w razie potrzeby wznowić później. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C, w razie potrzeby chronić przed światłem.</li>
		<li>Umyj komórki 3x w 200 μl PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej w 200 μl 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (tabela materiałów) i 0,1% niejonowego detergentu (tabela materiałów) rozcieńczonego w PBS.</li>
		<li>Blokować 200 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami w 150 μl PBS zawierającego 3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego oraz 0,05% niejonowego detergentu przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
		nuta: Pierwszorzędowymi przeciwciałami stosowanymi do generowania reprezentatywnych wyników są fluorescencyjnie sprzężone nanobody anty-GFP (stosowane w rozcieńczeniu 1:400) i fluorescencyjnie sprzężone anty-mScarlet-I nanobody (stosowane w rozcieńczeniu 1:500). Wzmacniają one sygnał już fluorescencyjnych białek.</li>
		<li>Myć 2x przez 5 min w 300 μL PBS, a następnie pozostawić w 200 μL PBS. 
		nuta: Próbki są obrazowane w PBS. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu
	<ol>
		<li>Uzyskuj obrazy za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do obrazowania czterokolorowego (np. oświetlenie konfokalne, szerokokątne, strukturalne).</li>
		<li>Wzbudz kanały meGFP i mScarlet-I za pomocą laserów o długości fali 488 nm i 561 nm. Ustaw detektory tak, aby wykrywały przy ~505−550 nm i ~590−650 nm. Wzbudzaj kanały barwnika fioletowego i dalekiej czerwieni za pomocą laserów o długości fali 405 nm i 633 nm. Ustaw detektory tak, aby wykrywały przy ~430−500 nm i ~660−750 nm.</li>
		<li>Empirycznie określ intensywność lasera tak, aby nie wystąpiło znaczące fotowybielanie i aby komórki pozostały zdrowe (w przypadku obrazowania żywych komórek).</li>
		<li>Empirycznie określ wzmocnienie w taki sposób, aby sygnał był uzyskiwany bez nasycania lub sztucznego przycinania wartości pikseli.</li>
		<li>Zbieraj dane ze stosu Z, tak aby obrazy były trójwymiarowe, obejmujące zakres 20−60 μm z rozmiarem kroku ~500 μm. 
		nuta: Obrazy pokazane w reprezentatywnych danych zostały uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B), Airyscan (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C) lub mikroskopii oświetlenia strukturalnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Każda komórka jest heterokarionem w dobrej wierze, jeśli zawiera zarówno fioletowe, jak i dalekie czerwone barwniki nakładające się na siebie w cytoplazmie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+meaning+of+life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).</li>
<li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li>
<li>Köhler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Cell+Fusion%3A+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li>
<li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li>
<li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse%2C+Chinese+hamster%2C+and+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li>
<li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li>
<li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li>
<li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li>
<li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li>
<li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li>
<li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li>
<li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li>
<li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li>
<li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+glycol%29+%28PEG%29-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers%3A+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li>
<li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li>
<li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich%27s+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li>
<li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li>
<li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li>
<li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Trapping+and+Optical+Micromanipulation+XIII%22%5BJournal%5D)">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).</li>
<li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li>
<li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li>
<li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+centrosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li>
<li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).</li>
<li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li>
<li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+%28PEG%29-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+%28CAScT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li>
<li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).</li>
<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Demonstrujemy łatwy i ekonomiczny protokół fuzji komórek i wizualizacji późniejszej architektury hybryd komórkowych za pomocą mikroskopii, co zajmuje około dwóch dni od początku do końca. Krytycznymi częściami tego protokołu są wzbogacanie połączonych komórek poprzez sortowanie komórek (sekcja protokołu 3) oraz staranna walidacja połączonych komórek za pomocą mikroskopii (sekcja protokołu sekcja 4). Sekcje te zapewniają, że połączone komórki są łatwo uzyskane i są heterokarionami w dobrej wierze. Należy przestrzegać stęż...

Homeostatyczne utrzymanie struktury komórkowej jest kluczowe dla życia. Komórki mają charakterystyczne morfologie, liczbę organelli subkomórkowych i wewnętrzny skład biochemiczny. Zrozumienie, w jaki sposób generowane są te podstawowe właściwości i jak przebiegają nieprawidłowo podczas choroby, wymaga narzędzi laboratoryjnych, aby je zaburzyć.
Fuzja komórek to połączenie dwóch lub więcej oddzielnych komórek. Fuzja komórek mogła mieć kluczowe znaczenie dla pojawienia się życia eukariotycznego1. W ludzkim ciele fuzja komórek jest stosunkowo rzadka, zachodzi w ograniczonych warunkach rozwojowych i typach tkanek, takich jak zapłodnienie lub tworzenie mięśni, kości i łożyska2. Protokół ten opisuje indukcję fuzji komórka-komórka w liniach komórkowych hodowli tkankowej z różnie fluorescencyjnie znakowanymi organellami, jako narzędzie do zrozumienia mechanizmów kontrolujących strukturę i funkcję komórki.
Indukowana in vitro fuzja komórkowo-komórkowa jest kluczowa dla produkcji przeciwciał monoklonalnych3, ważne narzędzie do badań biologicznych i leczenia chorób. Fuzja komórkowa została również wykorzystana do zadawania wielu różnych podstawowych pytań biologicznych dotyczących dominacji cyklu komórkowego4, aneuploidy5,6, przeprogramowanie komórkowe7,8, naprawa uszkodzonych neuronów9, proliferacja wirusów10, apoptosis11, nowotworygeneza12, dynamika cytoszkieletu13 oraz membrane fusion14,15. Laboratoryjne metody indukowania fuzji komórka-komórka16,17,18,19 indukują koalescencję błony lipidowej poprzez fizyczne połączenie dwóch dwóch warstw w jedną. Fuzja komórek może być indukowana przez elektryczność18, metody oparte na wirusach17, ogrzewanie termoplazmoniczne20, transgene expression19, oraz chemikalia, w tym glikol polietylenowy (PEG)16,21,22.
Centrosomy to centra organizujące mikrotubule kontrolujące kształt, ruchliwość, polaryzację i podział komórek23. Korzenie centrosomalne to włókniste struktury wyrastające z centrosomów zawierających białko rootletin24 (kodowane przez gen CROCC). Niedawno użyliśmy fuzji komórka-komórka, aby zrozumieć, jak zmienia się pozycja i liczba centrosomów wewnątrz heterokarionów w stosunku do komórek rodzicielskich24. Uzasadnieniem zastosowania tej metody jest śledzenie komórki pochodzenia korzeni w heterokarionie po fuzji różnie fluorescencyjnie znakowanych komórek rodzicielskich, a tym samym zobrazowanie fuzji i rozszczepienia organelli. Znakowane fluorescencyjnie białka rootletin-meGFP lub rootletin-mScarlet-I są tworzone przez edycję genomu w oddzielnych liniach komórkowych, które są następnie łączone przez fuzję komórek za pośrednictwem PEG. Opisujemy zastosowanie barwników komórkowych (tabela materiałów) do identyfikacji połączonych komórek za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie identyfikacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej komórki centrosomu pochodzenia i morfologii (ryc. 1). Podejście to jest solidną i unikalną metodą badania, w jaki sposób główne zmiany w stanie komórkowym, w tym liczba organelli, wpływają na homeostazę komórki.

<table><tbody><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>37% roztworem formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 Skaning laserowy Konfokalny mikroskop Airyscan</td> Carl <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe naczynia do obrazowania</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz GFP z alpaki anty-GFP nanobody</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Napływ Sortownik komórek</td><td>BD Biosciences Albumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Filtry komórkowe (70 &mu; m)</td> <td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Far Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX, pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anty-mScarlet-I alpaka nanobody</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-AT565</td><td></td></tr><tr><td>L15 Niezależna pożywka do obrazowania CO2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej, wysoka zawartość glukozy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O do 1 l</td></tr><tr><td>glikolu polietylenowego Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioOdczynniki</td><td>BP151</td><td>niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>niejonowy detergent</td></tr></tbody></table>

fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Życie jest przestrzennie podzielone w błonach lipidowych, aby umożliwić izolowane tworzenie odrębnych stanów molekularnych wewnątrz komórek i organelli. Fuzja komórek to połączenie dwóch lub więcej komórek w jedną komórkę. Tutaj przedstawiamy protokół fuzji komórek dwóch różnych typów komórek. Skondensowane komórki hybrydowe są wzbogacane przez sortowanie oparte na cytometrii przepływowej, a następnie mikroskopię fluorescencyjną struktury i funkcji komórek hybrydowych. Znakowane fluorescencyjnie białka generowane przez edycję genomu są obrazowane wewnątrz połączonych komórek, co pozwala na identyfikację struktur komórkowych na podstawie emisji fluorescencji i odniesienie z powrotem do typu komórki, z której pochodzą. Ta solidna i ogólna metoda może być stosowana do różnych typów komórek lub organelli będących przedmiotem zainteresowania, aby zrozumieć strukturę i funkcję komórkową w zakresie szeregu podstawowych pytań biologicznych.

Odpowiednio oznakowane komórki są widoczne podczas cytometrii przepływowej jako sygnał fluorescencyjny wyższy niż w przypadku nieoznakowanych komórek kontrolnych (Rysunek 2A). Bramki ustawia się w celu sortowania komórek podwójnie pozytywnych, wzbogacając tę populację bezpośrednio w naczyniach do obrazowania w celu dalszych analiz mikroskopowych. Połączone komórki są wykrywalne jako wyraźne komórki podwójnie fluorescencyjnie pozytywne i stano...

Celem tego protokołu jest połączenie dwóch różnych typów komórek w celu stworzenia komórek hybrydowych. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej połączonych komórek służy do śledzenia komórki pochodzenia organelli komórkowych. Test ten można wykorzystać do zbadania, w jaki sposób struktura i funkcja komórkowa reagują na zakłócenia spowodowane fuzją komórek.

Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Metoda ta pozwala na zakłócenie struktury i funkcji komórkowej poprzez fuzję dwóch różnych typów komórek w celu odpowiedzi na pytania, takie jak to, jak komórki reagują na zmiany liczby organelli. Obrazując fluorescencyjnie znakowane białka w połączonych komórkach, struktury komórkowe można odnieść z powrotem do ich typu pochodzenia komórkowego w celu zbadania mechanizmów homeostazy i funkcji organelli. W celu znakowania barwnikiem fluorescencyjnym należy zapoznać się z interesującymi populacjami ludzkich komórek rakowych, tak aby każda hodowla rozszerzyła się do co najmniej sześć razy od 10 do szóstej komórki przy zbiegu od 70 do 90% do następnego ranka.W dniu etykietowania należy dwukrotnie przemyć komórki rootletin eGFP i rootletin-mScarlet 10 mililitrami PBS na pranie. Rozcieńczyć barwnik fioletowokomórkowy do 500 nanomolowców w PBS i barwnik z dalekiej czerwieni do 200 nanomolowych w PBS. Oznacz komórki eGFP korzenia rozcieńczonym barwnikiem z komórek fioletowych, a komórki szkarłatne korzenia mScarlet rozcieńczonym barwnikiem z komórek dalekiej czerwieni przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przerwij reakcje za pomocą 10 mililitrów DMEM na pięć minut. Umyj zarówno znakowane kultury komórkowe, jak i jedną nieznakowaną hodowlę komórek rodzicielskich 10 mililitrami świeżego PBS przed inkubacją wszystkich kultur z jednym mililitrem podgrzanej trypsyny. Pod koniec inkubacji przenieś odłączone roztwory komórek do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek do odwirowania i delikatnie ponownie zawieś znakowane barwnikiem granulki w jednym mililitrze PBS, a nieznakowane komórki w jednym mililitrze DMEM.Następnie należy zwrócić wszystkie próbki komórek do inkubatora do hodowli komórkowych. W eksperymencie fuzji komórek wymieszaj 500 mikrolitrów komórek znakowanych fioletowym barwnikiem z 500 mikrolitrami komórek znakowanych barwnikiem Far Red w nowej 15-mililitrowej probówce i osadź pozostałe niezmieszane znakowane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżego DMEM i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.Zbierz zmieszane komórki przez odwirowanie i dodaj 700 mikrolitrów 50%1450 PEG kroplami do granulki w ciągu 30 sekund. Po 3,5 minuty w temperaturze pokojowej dodaj kroplami 10 mililitrów DMEM bez surowicy przez 30 sekund i umieść probówki w inkubatorze na 10 minut. Pod koniec inkubacji osadź zmieszane komórki przez odwirowanie i delikatnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża.Aby wzbogacić populację skondensowanych komórek za pomocą FACS, delikatnie przefiltruj wszystkie komórki do pojedynczych probówek FACS przez sitko o średnicy 70 mikrometrów i utwórz wykresy rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego i dyskryminacyjnego dubletów w oprogramowaniu cytometru. Uruchom nieoznakowane komórki, aby zarejestrować ich intensywność fluorescencji i utworzyć bramki do identyfikacji połączonych komórek. Następnie uruchom pojedyncze dodatnie komórki znakowane barwnikiem Far Red, aby potwierdzić, że nie ma rozlania się sygnału Far Red do kanału Far Red i pojedyncze dodatnie komórki znakowane barwnikiem Far Red, aby potwierdzić, że w kanale Far Red nie ma sygnału Far Red.Następnie na krótko uruchom próbkę fuzji, aby potwierdzić, że połączone komórki są widoczne z tymi bramkami. Po ustawieniu parametrów sortowania należy ustawić strumień sortowania centralnie w ośmiodołkowej czaszy do obrazowania zawierającej 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej i posortować podwójnie dodatnie połączone komórki bezpośrednio do naczynia. Po posortowaniu wszystkich komórek natychmiast umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwie do 16 godzin.W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy najpierw zastąpić supernatant hodowli komórkowej 200 mikrolitrami 4% paraformaldehydu na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec utrwalania umyj komórki trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS na pranie, a następnie przepuszczaj komórki w 200 mikrolitrach 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 200 mikrolitrów 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie znakuj interesującymi przeciwciałami w 150 mikrolitrach buforu barwiącego.Po godzinie w temperaturze pokojowej umyj komórki dwa razy w 300 mikrolitrach PBS przez pięć minut na pranie. Po ostatnim praniu wymień pranie na 200 mikrolitrów świeżego PBS. Aby uzyskać obrazy zrośniętych komórek, należy użyć odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do obrazowania czterokolorowego i zebrać obrazy trójwymiarowe.Odpowiednio znakowane komórki są widoczne podczas cytometrii przepływowej za pomocą sygnału fluorescencyjnego na wyższym poziomie niż nieznakowane komórki kontrolne. Bramki można ustawić na sortowanie w celu wzbogacenia populacji komórek podwójnie dodatnich bezpośrednio w naczyniach obrazowania w celu dalszej analizy mikroskopowej. Fuzja indukuje poważną rearanżację architektury komórkowej poprzez zmieszanie dwóch komórek w jedną.Heterokariony są identyfikowane jako komórki zawierające oba fluorescencyjne sygnały barwnika zmieszane wewnątrz pojedynczej komórki bez interweniujących błon plazmatycznych. Dodatkowo, dwa jądra mogą być również widoczne w połączonych komórkach dzięki obrazowaniu Brightfield. Struktura i funkcja komórki mogą być dalej badane poprzez łączenie komórek zawierających białka znakowane meGFP i mScarlet.Fuzja powoduje podwojenie liczby centrosomów wewnątrz heterokarionów widocznych jako co najmniej cztery ogniska materiału okołocentrycznego, gdy składnik pericentriolarny centrosomu NEDD1 jest znakowany fluorescencyjnie. Fuzja komórek z endogennie fluorescencyjnie znakowaną rootletyną pozwala na identyfikację komórki pochodzenia każdego centrosomu w heterokarionie. Protokół ten pokazuje, jak łączyć różnie znakowane linie komórkowe i jak obrazować ich organelle, aby zrozumieć ich strukturę i funkcję.Ten solidny protokół jest zarówno stosunkowo łatwy, jak i stosunkowo niedrogi do wykonania w porównaniu z podobnymi metodami. Technika ta może być wykorzystana do zadawania szeregu pytań, takich jak sposób regulacja fuzji organelli i jak komórki reagują na zmiany liczby organelli subkomórkowych.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj technikę fuzji komórkowej linii z fluorescencyjnie znakowanymi białkami w celu badania homeostazy organelli i odpowiedzi komórkowych na perturbacje strukturalne.

Fuzja komórka-komórka linii komórkowych z edytowanym genomem w celu perturbacji struktury i funkcji komórkowej

Przeglądaj więcej filmów