Name: Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj izolację komórek nabłonkowych z trzech regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej. Ta metoda pozwala badać heterogeniczność i właściwości funkcjonalne komórek dla zastosowań klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasze badania były wspierane przez granty z Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 i 21081) oraz CONACYT (A1-S-8450 i 252756). Dziękujemy Jessice González Norris i Lidii Yuririi Paredes Vivas za wsparcie techniczne.

Ten protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Instituto Nacional de Perinatología w Meksyku (numer rejestru 212250-21041). Wszystkie procedury wykonane w tych badaniach były zgodne ze standardami etycznymi Instituto Nacional de Perinatología, Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi określonymi w Oficjalnym Standardzie Meksykańskim Ministerstwa Zdrowia.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór 1x PBS z EDTA. Aby to zrobić, dodaj 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml 1x PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM EDTA.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną dla HAEC. Weź 450 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnij go 5 ml pirogronianu sodu (100 mM), 50 ml nieaktywnej termicznie płodowej surowicy bydlęcej zakwalifikowanej do komórek macierzystych, 5 ml aminokwasów endogennych (100x), 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (100x), 5 ml L-glutaminy (200 mM) i 500 μL merkaptoetanolu (1000x).</li>
	<li>Wysterylizuj pojemniki do transportu i przetwarzania tkanki: pojemnik ze stali nierdzewnej z pokrywką do transportu całego łożyska z sali operacyjnej do laboratorium, taca (20 cm x 30 cm x 8 cm) do mycia i usuwania krwi z całego łożyska przed wycięciem błony owodniowej oraz plastikowa deska do krojenia do oddzielenia błony owodniowej na trzy regiony.</li>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (skalpele, nożyczki, kleszcze i zaciski), zlewki o pojemności 500 ml, gazy bawełniane i roztwór soli fizjologicznej.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki łożyskowej
UWAGA: Błony owodniowe pobrano od kobiet w czasie ciąży (37−40 tygodni), pod wskazaniem do cesarskiego cięcia, bez żadnych oznak aktywnego porodu i bez mikrobiologicznych cech infekcji. Pełne procedury izolacji i hodowli przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Na sali operacyjnej zaciśnij pępowinę, aby zapobiec przepływowi krwi do reszty tkanki. Zebrać całe łożysko za pomocą pępowiny zaciśniętej w sterylnym pojemniku.</li>
	<li>Dodaj 500 ml roztworu soli fizjologicznej do pojemnika, aby nawodnić łożysko.</li>
	<li>Zamknąć pojemnik i przetransportować tkankę do laboratorium w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść pojemnik z łożyskiem w szafie bezpieczeństwa biologicznego. 
	UWAGA: W przypadku, gdy sekcja nie zostanie przeprowadzona w ciągu 15 minut od pobrania łożyska, pojemnik z łożyskiem należy przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia. Należy unikać więcej niż 1 godziny, czasu między uzyskaniem łożyska a rozpoczęciem sekcji.</li>
</ol>
3. Separacja mechaniczna według regionu błony owodniowej
UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w sterylnych warunkach i w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Wyjmij całe łożysko z pojemnika i umieść je na tacy z pępowiną skierowaną do góry.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej bawełnianej gazy oczyść skrzepy krwi z powierzchni błony kosmówkowej, która pokrywa łożysko.</li>
	<li>Zidentyfikuj trzy obszary błony: owodnię pępowinową otaczającą pępowinę, owodnię łożyskową pokrywającą podstawkę decidua oraz obszar odbity, który jest resztą owodni, która nie jest przyczepiona do łożyska (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Rozwiń obszar owodni pępowinowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy preparacyjnych przytrzymaj część błony owodniowej, która pokrywa połączenie łożyska i pępowiny.</li>
		<li>Za pomocą skalpela rozetnij obszar otaczający pępowinę, jednocześnie rozciągając ją, aby oddzielić ją od kosmówki.</li>
		<li>Oddzieloną tkankę umieścić w oznakowanej zlewce ze 100 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiń obszar owodni łożyskowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej bawełnianej gazy usuń skrzepy krwi z powierzchni kosmówki-owodni pokrywającej łożysko.</li>
		<li>Przytrzymaj błonę na granicy między łożyskiem a odbitym obszarem za pomocą kleszczy preparacyjnych.</li>
		<li>Przeciąć skalpelem wzdłuż obwodu łożyska.</li>
		<li>Oddziel owodnię łożyskową od kosmówki, uważając, aby nie przeciąć żadnych naczyń z łożyska.</li>
		<li>Umieść oddzieloną tkankę w innej oznakowanej zlewce z 300 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddziel resztę błony owodniowej, która nie jest przyczepiona do łożyska (tj. część odbitą) od kosmówki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).
	<ol>
		<li>Zbierz odbity obszar w innej oznakowanej zlewce z 300 ml roztworu soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Podczas preparacji należy stale dodawać roztwór soli fizjologicznej, aby zapobiec wysychaniu tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mycie membran
UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Wyrzuć roztwór soli z każdego obszaru membrany osobno.</li>
	<li>Dodaj 100 ml świeżego roztworu soli fizjologicznej do okolicy pępowiny.</li>
	<li>Dodaj 300 ml świeżego roztworu soli fizjologicznej odpowiednio do łożyska i odbitych obszarów.</li>
	<li>Wymieszaj błony za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby usunąć pozostałości krwi.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór soli fizjologicznej.</li>
	<li>Powtórz pranie i mieszanie co najmniej 3 razy, aż membrany staną się przezroczyste.</li>
	<li>Umieść i rozciągnij membrany na desce, aby oczyścić sterylną gazą skrzepy krwi, które nie zostały usunięte za pomocą washes. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest usunięcie jak największej liczby erytrocytów, ponieważ ich obecność wpływa na funkcję trypsyny i żywotność kolejnych hodowli komórkowych.</li>
</ol>
5. Trawienie enzymatyczne błon z różnych regionów
UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Pokrój odbite i łożyskowe obszary na dwie lub trzy fragmenty.</li>
	<li>Nie przecinaj okolicy pępowiny.</li>
	<li>Umieść fragmenty każdego regionu w probówkach wirówkowych. Dodaj odpowiednio 20 ml 0,5% trypsyny/EDTA do obszaru odbitego i łożyskowego oraz 5 ml 0,5% trypsyny/EDTA do okolicy pępowinowej. 
	UWAGA: Ważne jest, aby pociąć odbite i łożyskowe obszary na mniejsze kawałki, ponieważ muszą one być całkowicie zanurzone w roztworze trypsyny.</li>
	<li>Lekko potrząsaj probówkami wirówkowymi przez 30 sekund. Wyrzuć trypsynę.</li>
	<li>Dodaj 30 ml nowej 0,5% trypsyny/EDTA odpowiednio do obszaru odbitego i łożyskowego oraz 15 ml nowego 0,5% trypsyny/EDTA do okolicy pępowinowej.</li>
	<li>Umieść probówki w rotatorze wewnątrz inkubatora.</li>
	<li>Inkubować z rotacją (20 obr./min) przez 40 min w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Jeśli obracacz rurek nie jest dostępny, delikatnie potrząsaj rurkami ręcznie co 10 minut.</li>
	<li>Przenieś roztwory trypsyny/komórek z każdego regionu do nowych probówek wirówkowych.</li>
	<li>Dodać 2 razy objętość pożywki HAEC podgrzanej w temperaturze 37 °C na probówkę, aby dezaktywować enzym.</li>
	<li>Przechowuj pierwsze trawienie na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.6−5.8 dla drugiego okresu trawienia.</li>
	<li>Dla każdego regionu przytrzymaj jeden koniec części owodni za pomocą kleszczy preparacyjnych, a drugą parą ściśnij wzdłuż tkanki, aby usunąć rzędy komórek nabłonka, które nie odkleiły się całkowicie podczas poprzednich okresów inkubacji.</li>
	<li>Zebrać drugą mineralizację do innego zestawu probówek wirówkowych i dezaktywować 2x większą objętością pożywki HAEC.</li>
	<li>Wyrzuć strawione błony do pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
</ol>
6. Izolacja HAEC
UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Odwirować wszystkie probówki o stężeniu 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki HAEC (do temperatury 37 °C) na probówkę i delikatnie pipetować w celu rozdrobnienia każdej granulki.</li>
	<li>Połącz zawiesiny komórkowe dwóch procesów trawienia w osobnej probówce dla każdego regionu błony.</li>
	<li>Przefiltruj zawiesiny komórkowe za pomocą filtrów komórkowych 100 μm, aby usunąć resztki macierzy zewnątrzkomórkowej i uzyskać pojedyncze komórki.</li>
	<li>Przygotować trzy porcje z 90 μl błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodać 10 μl każdej zawiesiny komórkowej na obszar błony do probówek do mikrowirówek i wymieszać.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem pola świetlnego.</li>
</ol>
7. Kultura HAEC
<ol>
	<li>Wysiewać HAEC z trzech regionów oddzielnie o gęstości 3 × 104 komórek/cm2 z podgrzanym podłożem HAEC, uzupełnionym 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
	<ol>
		<li>Zasiej komórki na płytkach o średnicy 100 mm, aby utrzymać je in vitro lub na płytkach 24-dołkowych do analizy immunochemicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować szalki w temperaturze 37 °C w warunkach normoksyjnych (5% CO2 ) w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Dodawaj EGF codziennie i zmieniaj podłoże co trzeci dzień. 
	UWAGA: Komórki zlewają się po 4−6 dniach.</li>
	<li>Użyj komórek do konwencjonalnej immunohistochemii, analizy sortowania komórek, kriokonserwacji, ekstrakcji RNA i białek lub do kontynuowania pasażu.</li>
</ol>
8. Przejście HAEC
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę HAEC i przemyć 2x roztworem PBS/EDTA 0,01M.</li>
	<li>Inkubować z roztworem PBS/EDTA 0,01M przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń PBS/EDTA i dodaj 1,5 ml 0,5% trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Inkubować przez 5-8 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dezaktywować enzym za pomocą dwóch objętości pożywki HAEC.</li>
	<li>Zebrać zmieszany roztwór i odwirowywać przez 5 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Policz komórki i kontynuuj podążanie za fragmentami lub użyj komórek do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelium+%28HAE%29+as+a+possible+source+of+stem+cells+%28SC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gaceta+Medica+de+Mexico%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li>
<li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li>
<li>Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+S+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).</li>
<li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082(2015).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li>
<li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacological+Sinica%22%5BJournal%5D)">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li>
<li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li>
<li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).</li>
<li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003(2018).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+proliferation%2C+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li>
<li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells%2C+in+contrast+to+trophoblast+cells%2C+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li>
<li>Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. 268-318 (1995).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion%3A+implications+for+human+parturition+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131(2011).</li>
<li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+gene+expression+profiling%3A+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li>
<li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761(2017).</li>
<li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Epithelial+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li>
<li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells%3A+a+Smad2%2F3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li>
<li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320(2015).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wdrożyliśmy nowy protokół izolacji HAEC od błon terminowych. Różni się od poprzednich doniesień tym, że każda błona została podzielona na trzy regiony anatomiczne przed izolacją w celu analizy komórek z każdego z nich.
Jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole jest umycie błony w celu usunięcia wszystkich skrzepów krwi, ponieważ mogą one zakłócać aktywność trypsyny podczas oddzielania komórek nabłonka. Niewłaściwe wykonanie tego kroku może prowadzić do uzyskania pierwotnej hodowli z ...

Ludzkie komórki nabłonka owodniowego (HAEC) powstają we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego, około ośmiu dni po zapłodnieniu. Powstają one z populacji płaskonabłonkowych komórek nabłonka epiblastu, które pochodzą z najbardziej wewnętrznej warstwy błony owodniowej1. W związku z tym HAEC są uważane za pozostałości komórek pluripotencjalnych z epiblastu, które mają potencjał do różnicowania się w trzy listki rozrodcze zarodka2. W ciągu ostatniej dekady różne grupy badawcze opracowały metody izolowania tych komórek z błony owodniowej w okresie ciąży, aby scharakteryzować ich przypuszczalne właściwości związane z pluripotencją w modelu hodowli in vitro3,4. 
W związku z tym stwierdzono, że HAEC posiada cechy charakterystyczne dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (HPSC), takie jak antygeny powierzchniowe SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; rdzeń czynników transkrypcyjnych pluripotencji OCT4, SOX2 i NANOG; oraz marker proliferacji KI67, sugerujący, że są one samoodnawiające się5,6,7. Co więcej, komórki te zostały poddane próbie wykorzystania protokołów różnicowania w celu uzyskania komórek dodatnich dla specyficznych dla linii markerów trzech listków zarodkowych (ektodermy, mezodermy i endodermy)4,5,8, a także w zwierzęcych modelach chorób ludzkich. Wreszcie, HAEC wyraża E-kadherynę, które pokazują, że zachowują nabłonkową naturę, podobnie jak HPSC5,9.
Oprócz swojego embrionalnego pochodzenia, HAEC mają inne wewnętrzne właściwości, które sprawiają, że nadają się do różnych zastosowań klinicznych, takich jak wydzielanie cząsteczek przeciwzapalnych i przeciwbakteryjnych10,11, czynniki wzrostu i uwalnianie cytokin12, brak powstawania potworniaków po ich przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności, w przeciwieństwie do HPSC2i tolerancję immunologiczną, ponieważ wyrażają HLA-G, co zmniejsza ryzyko odrzucenia przeszczepu po przeszczepie13.
Jednak poprzednie raporty zakładały, że ludzka owodnia jest jednorodną błoną, nie biorąc pod uwagę, że można ją anatomicznie i fizjologicznie podzielić na trzy regiony: łożyskowy (owodnia pokrywająca decidua basalis), pępowinowy (część otaczająca pępowinę) i odbita (reszta błony nie przylegająca do łożyska)14. Wykazano, że łożyskowe i odbite obszary owodni wykazują różnice w morfologii, aktywności mitochondriów, wykrywaniu reaktywnych form tlenu15, ekspresji miRNA16 i aktywacji szlaków sygnałowych17. Wyniki te sugerują, że ludzka owodnia jest zintegrowana z heterogeniczną populacją o różnej funkcjonalności, która powinna być brana pod uwagę w dalszych badaniach przeprowadzanych na modelach in situ lub in vitro. Podczas gdy inne laboratoria opracowały protokoły izolacji HAEC z całej membrany, nasze laboratorium opracowało protokół izolacji, hodowli i charakteryzowania komórek z różnych regionów anatomicznych.

<table><tbody><tr><td>Culture odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM</td></tr><tr><td>Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>15240062</td><td>100X</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>12430054</td><td>Uzupełniony o wysoką zawartość glukozy i HEPES</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Embrionalne komórki macierzyste FBS, kwalifikowane</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10439024</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11140050</td><td>100X</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td></td><td>10010023 1X</td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej (chlorek sodu 0,9%)</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11360070</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td> Materiał jednorazowego użytku< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 i mikro; m Sitko do komórek</td><td>Corning/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TC</td><td>Corning/Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TC</td><td>Corning/Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Niepirogenna sterylna probówka wirówkowa</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td>ze stożkiem dolne</td></tr><tr><td>Niepirogenne sterylne końcówki 1,000 &mikro; l, 200 i mikro; l oraz 10 &mikro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gazy bawełniane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pipety serologiczne o pojemności 5, 10 i 25 ml</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawice chirurgiczne</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>bezpieczeństwa biologicznego</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowane pipety Napełniacz/dozownik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne zlewki o pojemności 500 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa deska</td><td></td><td></td><td></td>do krojenia</tr><tr><td>Sterylne skalpele, nożyczki, kleszcze, zaciski</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny pojemnik</td><td></td><td></td><td></td> ze stali nierdzewnej</tr><tr><td>Sterylna taca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka Rotator</td><td>MaCSmix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała i zestawy</td><td></td><td></td><td>Przeciwciało ID</td></tr><tr><td>Anti-E-kadheryna</td><td>610181</td><td></td><td>RRID:AB_3975</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Santa Cruz</td><td>23900</td><td>RRID:AB_627859)</td></tr><tr><td>Anty-NANOG</td><td>Peprotech</td><td>500-P236</td><td>RRID:AB_1268274</td></tr><tr><td>Anty-OCT4</td><td>Abcam</td><td>AB19857</td><td>RRID:AB_44517</td></tr><tr><td>Anty-SOX2</td><td>Milipore</td><td>AB5603</td><td>RRID:AB_2286686</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>anty-SSEA-4</td><td>4755</td><td>RRID:AB_1264259</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>anty-TRA-1-60</td><td>4746</td><td>RRID:AB_2119059</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysz Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>RRID:AB_2534088</td></tr><tr><td>Kozia anty-królik Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11036</td><td>RRID:AB_10563566</td></tr><tr><td>Zestaw testowy tunel</td><td>Abcam</td><td>66110</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

W literaturze opisano kilka protokołów dotyczących izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodniowego (HAEC). Zakładają one jednak, że nabłonek owodniowy jest warstwą jednorodną. Ludzką owodnię można podzielić na trzy obszary anatomiczne: odbity, łożyskowy i pępowinowy. Każdy region ma inną rolę fizjologiczną, na przykład w stanach patologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół preparowania ludzkiej tkanki owodniowej w trzech sekcjach i utrzymywania jej in vitro. W hodowli komórki pochodzące z odbitej owodni wykazywały prostopadłościenną morfologię, podczas gdy komórki zarówno z okolic łożyska, jak i pępowiny były płaskonabłonkowe. Niemniej jednak wszystkie uzyskane komórki mają fenotyp nabłonkowy, o czym świadczy immunodetekcja E-kadheryny. W związku z tym, że łożysko i odbite regiony in situ różnią się składnikami komórkowymi i funkcjami molekularnymi, może być konieczne rozważenie tych różnic w badaniach in vitro, ponieważ mogą one mieć fizjologiczne implikacje dla zastosowania HAEC w badaniach biomedycznych i obiecującego zastosowania tych komórek w medycynie regeneracyjnej.

Komórki HAEC wyizolowano z każdego z trzech obszarów anatomicznych błony owocni i hodowano indywidualnie in vitro. Po 48 h hodowli komórki o fenotypie nabłonkowym przylgnęły do powierzchni płytki, choć w medium znajdowały się również szczątki komórkowe i komórki pływające, które usunięto podczas wymiany pożywki (Rysunek 3).
Podczas przetwarzania hodowli pierwotnej (pasaż zero, P0) mogą wystąpić pewne komplikacje, które mogą zakłócić analizę danych eksperymentalnyc...

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące niejednorodności i właściwości funkcjonalnych ludzkich komórek nabłonka owodniowego wyizolowanych z błony owodniowej. Podczas gdy poprzednie protokoły izolowały komórki z błony owodniowej bez rozróżniania między regionami, nasz protokół pozwala na hodowlę populacji komórek wyizolowanych z trzech różnych regionów anatomicznych. Aby oddzielić błonę owodniową według regionu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, zidentyfikuj owodnię pępowinową otaczającą pępowinę, owodnię łożyskową pokrywającą decidua basalis oraz obszar odbity, który jest uważany za resztę owodni, która nie jest przyczepiona do łożyska.Aby wypreparować okolicę owodni pępkowej, użyj kleszczy preparacyjnych, aby przytrzymać część błony owodniowej, która pokrywa połączenie łożyska i pępowiny, i użyj skalpela, aby wypreparować obszar otaczający pępowinę, jednocześnie rozciągając, aby oddzielić obszar od kosmówki. Następnie umieść oddzieloną tkankę w oznakowanej zlewce ze 100 mililitrami roztworu soli fizjologicznej. Aby wypreparować obszar owodni łożyskowej, użyj sterylnej bawełnianej gazy, aby usunąć skrzepy krwi z powierzchni ko

in-vitro-culture-epithelial-cells-from-different-anatomical-regions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Poznaj izolację komórek nabłonkowych z trzech regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej. Ta metoda pozwala badać heterogeniczność i właściwości funkcjonalne komórek dla zastosowań klinicznych.

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

Przeglądaj więcej filmów