Name: Oczyszczanie komórek macierzystych Prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania komórek macierzystych Prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy. Protokół ten umożliwia badanie rozwoju móżdżku oraz chorób takich jak ataksja rdzeniowo-móżdżkowa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Opal za ich sugestie. Praca ta była wspierana przez granty NIH 1RO1 NS062051 i 1RO1NS08251 (Opal P)

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (2011) i zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Northwestern (Protokół IS00011368).
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór dysocjacyjny tkanek wykonany ze sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) zawierającego czerwień fenolową z papainą (100 j./ml), cysteiną (0,2 mg/ml) i DNazą (250 j./ml).</li>
	<li>Aby przygotować roztwór DNazy, rozcieńczyć 100 mg liofilizowanego proszku DNazy I (jedna butelka) w 50 mlH2O. Dobrze wymieszać i przefiltrować roztwór podstawowy. Przygotować 10 ml porcji podstawowych. Podziel jedną probówkę podstawową na 0,5 ml porcji jednorazowego użytku. Porcje jednorazowego użytku należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotować odczynniki do separacji magnetycznej, przygotowując bufor kolumny magnetycznej X: 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM roztworu EDTA.</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę neurosferyczną, użyj pożywki neuropodstawowej zawierającej penicylinę/streptomycynę z L-glutaminą i uzupełnij 2% B27, 20 ng / ml ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20 ng / ml ludzkiego rekombinowanego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).</li>
	<li>Do przygotowania pożywki różnicującej należy użyć pożywki neuropodstawowej i uzupełnić 10 ng/ml płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF-AA) lub 10 ng/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF) i 2% B27.</li>
	<li>Użyj bardzo niskich płytek hodowlanych 12 dołków (3,5 cm2) i 6 dołków (9,6 cm2).</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie móżdżku
<ol>
	<li>Znieczulenie szczeniąt myszy (P3-P7) izofluranem i odcięcie głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Spryskaj oddzieloną głowę szczeniąt 70% etanolem.</li>
	<li>Przenieś każdą głowę do pustego sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm. Oddziel skórę za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, a następnie usuń czaszkę, przesuwając nożyczki strzałkowo wzdłuż linii środkowej.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy #7 oderwij kości czaszki, zaczynając doogonowo od pnia mózgu. Ostrożnie podnieś mózg za pomocą szpatułki, utrzymując móżdżek w stanie nienaruszonym, i przenieś mózg do świeżego sterylnego naczynia o średnicy 10,0 cm zawierającego 15 ml lodowatego roztworu soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>Umieść naczynie zawierające mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą cienkich kleszczy #5 usuń opony mózgowe i duże naczynia krwionośne z móżdżku i oddziel móżdżek od pnia mózgu za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Przenieś móżdżek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5,0 ml lodowatego roztworu HBSS. Umyj móżdżek przez płukanie i dekantację 3x za pomocą 5,0 ml HBSS. 
	nuta: Każdy móżdżek należy umieścić we własnej rurce w celu dalszej obróbki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
<ol>
	<li>Po ostatnim płukaniu dodać 5 ml roztworu do dysocjacji tkanek na bazie papainy (na podstawie poprzedniej pracy13,18), który został wstępnie podgrzany do 37 °C. Inkubować tkankę przez 15 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Powoli mieszaj zawartość, odwracając rurkę w górę iw dół 3x–5x co 3 minuty za pomocą miksera nutującego lub ręcznie.</li>
	<li>Przygotuj pipetę Pasteura o szerokiej średnicy (zwykła szklana pipeta) i wąskiej średnicy (polerowana ogniowo przez podgrzewanie nad palnikiem Bunsena), jak opisano wcześniej19.</li>
	<li>Umyj chusteczkę 3x 5 ml roztworu HBSS, unikając utraty tkanki podczas ręcznego dekantowania.</li>
	<li>Usunąć ostatnie płukanie HBSS i dodać do tkanki 5 ml roztworu DPBS zawierającego 250 μl roztworu DNazy. Dysocjacja tkanki przez rozcieranie 10x–15x za pomocą pipety Pasteura o dużej średnicy. Wykonaj ten krok delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Następnie inkubować gnojowicę przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, mieszając przez odwrócenie i wyprostowanie probówki.</li>
	<li>Użyj pipety Pasteura o zmniejszonej średnicy, aby jeszcze bardziej rozprowadzić zawiesinę tkankową 10x. Jeśli pozostaną duże kawałki tkanki, delikatnie dociśnij je do dna probówki końcówką pipety i kontynuuj pipetowanie, aż komórki osiągną drobną zawiesinę.</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 10 minut, powtarzając poprzednie etapy mieszania.</li>
</ol>
4. Znakowanie immunologiczne komórek macierzystych
<ol>
	<li>Umieść probówki wirówkowe na lodzie i użyj lodowatych roztworów do kolejnych kroków. Przecedzić zdysocjowane komórki przez sitko o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Na filtrze zalej 10,0 ml roztworu HBSS, aby upewnić się, że komórki przechodzą przez siatkę w tym dodatkowym roztworze.</li>
	<li>Przefiltrowane komórki przenieść do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i całkowicie odrzucić supernatant ostrożnie za pomocą aspiratora próżniowego.</li>
	<li>Zawiesić osad w 160 μl bufora kolumny magnetycznej. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową przed etykietowaniem magnetycznym, przepuść komórki przez nylonową siatkę o grubości 30 μm, aby usunąć grudki komórek, które w przeciwnym razie mogą zatkać kolumnę.</li>
	<li>Dodaj 40 μl mikrogranulek anty-promininy-1 do każdej probówki o pojemności 15 ml, wymieszaj i inkubuj w lodówce przez 15 minut, aby przeciwciało związało się z komórkami wykazującymi ekspresję promininy-1.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 1,0–2,0 ml buforu kolumnowego X i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1,0 ml buforu kolumnowego X. 
	nuta: Jeśli po ponownym zawieszeniu osadu w 1,0 ml buforu kolumnowego X widoczne są małe grudki, należy je ostrożnie usunąć za pomocą końcówki pipety Pasteura, w przeciwnym razie grudki te mogą zablokować kolumnę magnetyczną podczas sortowania komórek.</li>
</ol>
5. Przygotowanie kolumn magnetycznych, sortowanie komórek i powlekanie
UWAGA: Separacja magnetyczna od różnych warunków genotypu (choroba vs. kontrola) musi być przeprowadzona w tym samym czasie, ponieważ każde opóźnienie może wpłynąć na morfologię neurosfery.
<ol>
	<li>Przygotuj kolumny magnetyczne, umieszczając je na stojaku magnetycznym wystawionym na działanie pola magnetycznego. Przepłukać kolumnę raz 500 μl buforu X, nakładając bufor, który kapie do probówki wirówkowej w celu wyrzucenia. 
	nuta: Przygotować świeży bufor kolumny magnetycznej X dla każdego eksperymentu; Jeśli nie, to wydajność komórek macierzystych będzie niska.</li>
	<li>Nałóż oznaczone zawieszenie komórki na kolumnę. Zbierz przepływ zawierający nieznakowane komórki, które składają się głównie z mieszanych komórek neuronalnych móżdżku / glejowych, do świeżych probówek o pojemności 15 ml (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3x 500 μl buforu X (każde płukanie trwa około 2–4 min). 
	nuta: Mieszana kultura neuronalno-glejowa móżdżku wzbogacona o ziarniste neurony móżdżku może służyć jako użyteczny produkt uboczny tego etapu oczyszczania.</li>
	<li>Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 1,0 ml pożywki hodowlanej (pożywki neurosferycznej) do kolumny i wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać komórki oznaczone kulkami promininy-1 do świeżej probówki sokoła o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Aby zwiększyć czystość komórek znakowanych promininą-1, przełóż eluowane komórki przez drugą kolumnę, wykonując kroki 5.1–5.4.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Typowa wydajność to 10-7 komórek na móżdżek. Umieść komórki na płytkach o bardzo niskim stopniu mocowania (6 lub 12 dołków, w zależności od gęstości wymaganej do dalszych eksperymentów).</li>
</ol>
6. Pasażowanie neurosfer i różnicowanie
<ol>
	<li>Umieść komórki macierzyste znakowane promininą-1 na 12-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu w pożywce neurosferycznej (5,000 komórek / dołek).</li>
	<li>Po 7–10 dniach komórki dzielą się, tworząc pływające neurosfery w kształcie kuli (neurosfery pierwotne). 
	nuta: W tym eksperymencie generowane są wtórne neurosfery, które rozszerzają się liczebnie do dalszego wykorzystania. Pierwotne populacje neurosfer nie są wykorzystywane w tych eksperymentach, ponieważ mogą zawierać zanieczyszczające komórki, które nie mają właściwości komórek macierzystych i mogą zlepiać się ze sobą z neurosferami.</li>
	<li>W celu pasażowania przenieś pierwotne neurosfery wraz z pożywką hodowlaną za pomocą końcówek pipet o pojemności 1,0 ml do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Granulować neurosfery przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml pożywki dysocjacyjnej tkanek, która zawiera papainę lub 0,05% roztwór trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki neurosferycznej i mechanicznie zdysocjować komórki za pomocą plastikowej pipety Pasteura i powoli pipetować w górę iw dół 10 razy.</li>
	<li>Umieść komórki (ponownie) w pożywkach neurosfery, jak opisano wcześniej. Po 7–10 dniach w hodowli płytkę należy wzbogacić o neurosfery wtórne. 
	nuta: Kultury te mogą być pasażowane do 8 razy z dobrą wydajnością, po czym rozmiar neurosfery jest zwykle mniejszy i sugeruje spadek proliferacji.</li>
	<li>Policz komórki na hemocytometrze i nałóż optymalną liczbę do przyszłych eksperymentów na płytkach pokrytych poli-D-lizyną (6 lub 12 dołków).</li>
	<li>Aby zróżnicować komórki macierzyste, zbierz neurosfery od drugiego do ósmego pasażu przez odwirowanie, jak opisano wcześniej, z wyjątkiem dodania pożywki różnicującej do osadu. 
	UWAGA: Po 7 dniach in vitro komórki macierzyste różnicują się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty, jak wykazano przez barwienie markerem neuronalnym tubuliną β-III, markerem astrocytarnym GFAP i producentem oligodendrocytów O4.</li>
</ol>

<ol><li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+connections+between+cerebellar+development%2C+behaviour+and+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li>
<li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li>
<li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li>
<li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337(2014).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450(2014).</li>
<li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+paper%3A+the+cerebellum%27s+role+in+movement+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+%22stemness%22+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li>
<li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li>
<li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li>
<li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133%2C+CD15%2C+and+CD24%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li>
<li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li>
<li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li>
<li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li>
<li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li>
<li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin%28%2B%29+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li>
<li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207(2019).</li>
<li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebellum%2C+sensitive+periods%2C+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li>
<li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+down+and+one+to+go%3A+modeling+medulloblastoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li>
</ol>

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Komórki macierzyste móżdżku wykazujące ekspresję promininy 1 znajdują się w prospektywnej istocie białej w ciągu pierwszych 3 tygodni życia poporodowego. Ich proliferacja jest ściśle kontrolowana przez soniczny szlak jeża wspierany przez komórki Purkinjego17. Te komórki macierzyste / progenitorowe przyczyniają się do powstawania później powstałych interneuronów GABA-ergicznych zwanych komórkami koszyczkowymi i komórkami gwiaździstymi. Te interneurony znajdują się w warstwie molekularnej, gdzie łąc...

Móżdżek od dawna uznawany jest za główny obwód neuronalny koordynujący dobrowolne ruchy1. Odbiera dane wejściowe z szerokich obszarów neuroosi, które obejmują informacje proprioceptywne z obwodu, aby precyzyjnie dostroić moc motoryczną i koordynować ruch. Ostatnio został również zamieszany w regulację funkcji poznawczych i emocji poprzez potencjalne wykorzystanie podobnych sieci przetwarzania informacji2,3,4.
Dorosły móżdżek składa się z zewnętrznej kory móżdżku i wewnętrznej istoty białej. Pomiędzy tymi strukturami znajdują się głębokie jądra śródmózgowia. Podobnie jak w przypadku reszty układu nerwowego, rozwój móżdżku jest napędzany przez proliferację multipotencjalnych komórek progenitorowych (komórek macierzystych), które migrują i różnicują się, aby uzyskać tę dobrze zorganizowaną strukturę. We wczesnym rozwoju (E10.5–E13.5) komorowa nisza macierzysta wokół rozwijającej się czwartej komory generuje neurony GABAergiczne (tj. komórki Purkinjego, komórki Lugaro, komórki Golgiego) wraz z glejem Bergmanna5,6,7,8.
W późniejszym okresie rozwoju (pierwszy tydzień po urodzeniu), druga nisza komórek macierzystych w rombowej wardze generuje komórki progenitorowe wyrażające MATH1 i Nestin, które dają początek pobudzającym neuronom ziarnistym9,10,11,12. Ostatnio została opisana trzecia nisza komórek macierzystych13. Komórki te wyrażają promininę-1 (znaną również jako CD133), glikoproteinę obejmującą błonę, która definiuje podzbiór komórek macierzystych w jelicie i układzie krwiotwórczym14,15,16. Mapowanie losów in vivo pokazuje, że te komórki macierzyste generują kluczowe interneurony warstwy molekularnej (tj. komórki koszyczkowe i komórki gwiaździste) wraz z astrocytami w ciągu pierwszych trzech tygodni po urodzeniu. W przeszłości trudno było badać te komórki in vitro, ponieważ wcześniejsze metody wymagały kosztownych i czasochłonnych technik (tj. sortowania komórek aktywowanego fluorescencją [FACS]), które są zależne od barwienia promininą-112,13,17. Protokół ten opisuje opartą na immunomagnetyzmie metodę izolacji tych komórek macierzystych, które można następnie łatwo hodować i różnicować.

<table><tbody><tr><td>0,05%Trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific 17504001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mM roztwór EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-promininy-1</td><td>Miltenyi Biote</td><td>130-092-333</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane ultra - niskie nasadka</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D4513-1VL</td><td>250 U/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Bufor fosforanowy Saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040141</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka-HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Promega</td><td>G507A</td><td>20 ng / ml</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Promega</td><td>G502A</td><td>20 ng / ml</td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamina</td><td>Mikroskopia Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td></td> Lieca <td></td><td></td><td>TCS SP5 mikroskopy konfokalne</td></tr><tr><td>Separator MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mysia anty-prominina-1</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-1331</td><td>1 w 100</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab27952</td><td>1 w 200</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>O4</td><td>Millopore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>(100 U / mL)</td></tr><tr><td>Płytkowy czynnik wzrostu</td><td>Sigma</td><td>H8291</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Antytubulina królika, b-III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>1 na 500</td></tr><tr><td>Rabit anty-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1 w 500</td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne-kolumny MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie komórek macierzystych prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Większość neuronów móżdżku powstaje z dwóch embrionalnych nisz macierzystych: rombowej niszy wargowej, która generuje wszystkie pobudzające móżdżkowe neurony glutaminergiczne, oraz niszy strefy komorowej, która generuje hamujące GABA-ergiczne komórki Purkinjego, które są neuronami tworzącymi głębokie jądra móżdżku i glej Bergmana. Ostatnio opisano trzecią niszę komórek macierzystych, która powstaje jako wtórna strefa rozrodcza z niszy strefy komorowej. Komórki tej niszy są definiowane przez marker powierzchni komórki promininę-1 i są zlokalizowane w rozwijającej się istocie białej móżdżku po urodzeniu. Ta nisza odpowiada za późno urodzone interneurony GABA-ergiczne warstwy molekularnej wraz z astrocytami móżdżku generowanymi po urodzeniu. Oprócz ich roli rozwojowej, nisza ta zyskuje na znaczeniu translacyjnym ze względu na jej udział w neurodegeneracji i nowotworzenia. Biologia tych komórek była trudna do rozszyfrowania z powodu braku skutecznych technik ich oczyszczania. Zademonstrowano tutaj skuteczne metody oczyszczania, hodowli i różnicowania tych postnatalnych komórek macierzystych móżdżku.

Postnatalne komórki macierzyste móżdżku wykazujące ekspresję promininy-1 tworzyły neurosfery w pośrodku do neurosfer bogatym w czynniki wzrostu (EGF i bFGF). Neurosfery te były pozytywne w barwieniu na promininę-1, marker wykorzystany do ich izolacji, a także w barwieniu na inne markery komórek macierzystych, takie jak Nestin i GFAP13 (Rycina 1). Ekspresja markerów komórek macierzystych była utrzymana przez cały okres hodowli i do co najmniej ośmiu pasaży<sup class="x...

Pokazano tutaj skuteczną i opłacalną metodę oczyszczania, hodowli i różnicowania komórek macierzystych istoty białej z pourodzeniowego móżdżku myszy.

Oczyszczanie komórek macierzystych Prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Protokół ten opisuje łatwą i opłacalną metodę oczyszczania komórek macierzystych z móżdżku po urodzeniu. Te komórki macierzyste odpowiadają za późno urodzone, molekularnie zniekształcone interneurony, ale odpowiadają również za astrocyty móżdżku pochodzące po urodzeniu. Tak więc badanie tych komórek jest wyraźnie ważne dla zrozumienia rozwoju móżdżku.Korzystając z tego protokołu, wydajność komórek macierzystych jest porównywalna do strategii opartej na FACS, która jest zwykle 10 razy droższa. Protokół ten można uogólnić w celu ekstrakcji komórek macierzystych eksprymujących promininę-1 z innych tkanek, takich jak jelito i szpik kostny. Zacznij od umieszczenia naczynia z mózgiem pod mikroskopem preparacyjnym.Użyj cienkich kleszczy numer pięć, aby usunąć opony mózgowe i duże naczynia krwionośne z móżdżku, a następnie oddziel móżdżek od pnia mózgu za pomocą szpatułki. Przenieś móżdżek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów lodowatego roztworu HBSS. Opłucz go, a następnie zdekantuj HBSS.Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim płukaniu dodaj pięć mililitrów roztworu do dysocjacji tkanek na bazie papainy, który został wstępnie podgrzany do 37 stopni Cels

purification-of-prominin-1-stem-cells-from-postnatal-mouse-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli progenitorowych komórek ziarnistych neuronów móżdżku oraz neuronów ziarnistych móżdżku z myszy w okresie postnatalnym. <br...

Izolacja i hodowla postnatalnych progenitorów neuronów ziarnistych oraz neuronów z móżdżku myszy

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek macierzystych z móżdżku myszy po urodzeniu i różnicowania ich w komórki nerwowe. Komórki macierzyste z izolowanej zawiesiny komórkowej są oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami i są hodowane w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery są następnie utrzymywane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia komórek nerwowych.

Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Przedstawiamy protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych. Protokół ten, oparty na ekstrakcji perycytów zorientowanej na wzbogacanie bez antybiotyków, jest cennym narzędziem do badań in vitro, zapewniając wysoką czystość i wysoką wydajność, zmniejszając w ten sposób liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.

Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Poznaj metodę oczyszczania komórek macierzystych Prominin-1+ z poporodowego móżdżku myszy. Protokół ten umożliwia badanie rozwoju móżdżku oraz chorób takich jak ataksja rdzeniowo-móżdżkowa.

Oczyszczanie komórek macierzystych Prominin-1⁺ z poporodowego móżdżku myszy

Przeglądaj więcej filmów