Name: Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj analizę cyklu komórkowego na poziomie pojedynczych komórek za pomocą cytometrii masowej z wykorzystaniem analogu pirymidyny IdU. Ta metoda pozwala badać właściwości proliferacyjne rzadkich komórek nowotworowych i podzbiorów komórek odpornościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wysiłkom Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang i Justin Lyeberger za ich eksperymentalne wsparcie. Praca ta była wspierana przez Program Stypendialny Pelotonia. Wszelkie opinie, ustalenia i wnioski wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają opinie Programu Stypendialnego Pelotonia.

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Dr Behbehani otrzymuje wsparcie w podróży od Fluidigm. Firma Fluidigm zakupiła również odczynniki i materiały do użytku laboratoryjnego.

Przedstawione tutaj przykłady pokazują, jak wykorzystać platformę MCM do analizy rozkładu cyklu komórkowego. Wykazano również, że analiza cyklu komórkowego jest wrażliwa na warunki eksperymentalne, takie jak czas i temperatura, co jest ważnym czynnikiem, który naukowcy muszą wziąć pod uwagę, rozważając MCM w analizie cyklu komórkowego14. Próbki pozostawione w magazynie przez krótki okres czasu, nie dłuższy niż godzinę, będą miały włączenie IdU porównywalne z ich normalnym stanem. Próbki w systemie...

Cytometria masowa umożliwia wykrycie około 40 parametrów dzięki wykorzystaniu wysokiej rozdzielczości i ilościowej natury spektroskopii mas. Zamiast przeciwciał sprzężonych z fluoroforem stosuje się przeciwciała znakowane metalem, które pozwalają na większą liczbę kanałów i powodują minimalne rozprzestrzenianie się1,2. MCM ma zalety i wady w odniesieniu do analizy cyklu komórkowego w porównaniu z cytometrią przepływową. Jedną z głównych zalet MCM jest to, że duża liczba parametrów umożliwia jednoczesny pomiar stanu cyklu komórkowego w dużej liczbie immunofenotypowo odrębnych typów komórek T w wysoce heterogenicznych próbkach. MCM został z powodzeniem wykorzystany do pomiaru stanu cyklu komórkowego podczas prawidłowej hematopoezy w ludzkim szpiku kostnym3 i transgenicznych mysich modelach niedoboru telomerazy4. Analiza stanu cyklu komórkowego w ostrej białaczce szpikowej (AML) wykazała, że cykl komórkowy korelował ze znanymi odpowiedziami na terapie kliniczne, zapewniając wgląd in vivo w cechy funkcjonalne, które mogą informować o wyborze terapii5. Drugą zaletą analizy cyklu komórkowego metodą cytometrii masowej jest możliwość pomiaru dużej liczby innych markerów funkcjonalnych, które mogą być skorelowane ze stanem cyklu komórkowego. Ostatnie prace były w stanie skorelować syntezę białek i RNA ze stanem cyklu komórkowego dzięki zastosowaniu IdU i przeciwciał znakowanych metalami przeciwko BRU i rRNA6. Tego rodzaju wysoce parametryczna analiza mierząca stan cyklu komórkowego w wielu populacjach w kontinuum różnicowania byłaby prawie niemożliwa przy użyciu obecnej technologii cytometrii przepływowej. Główną wadą MCM jest brak porównywalnych barwników DNA lub RNA, jak te stosowane w fluorescencyjnej cytometrii przepływowej (np. DAPI, Hoechst, Pyronin Y itp.). Barwniki fluorescencyjne mogą dawać stosunkowo precyzyjne pomiary zawartości DNA i RNA, ale ta precyzja jest możliwa tylko ze względu na zmiany właściwości fluorescencyjnych tych barwników, które zachodzą po interkalacji między zasadami nukleotydowymi. Analiza MCM nie jest więc w stanie zmierzyć zawartości DNA lub RNA z podobną precyzją. Zamiast tego analiza cyklu komórkowego z cytometrią masową opiera się na pomiarach białek związanych ze stanem cyklu komórkowego, takich jak cyklina B1, fosforylowane białko siatkówczaka (pRb) i fosforylowany histon H3 (pHH3) w połączeniu z bezpośrednim pomiarem atomu jodu z inkorporacji IdU do komórek fazy S. Te dwa podejścia pomiarowe dają bardzo podobne wyniki podczas normalnej proliferacji komórek, ale mogą być potencjalnie niezgodne, gdy progresja cyklu komórkowego zostanie zakłócona.
Pomiar liczby komórek w każdej fazie cyklu komórkowego jest ważny dla zrozumienia normalnego rozwoju cyklu komórkowego, jak również zakłóceń cyklu komórkowego, które są powszechnie obserwowane w nowotworach i chorobach immunologicznych. MCM zapewnia wiarygodny pomiar czynników zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych przy użyciu przeciwciał znakowanych metalem; jednak pomiar fazy S był ograniczony, ponieważ interkalator DNA oparty na irydzie nie był w stanie odróżnić DNA 2N i 4N. Aby zdefiniować fazy cyklu komórkowego, Behbehani opracował metodę, która wykorzystuje IdU o masie 127, która mieści się w zakresie cytometru masowego i umożliwia bezpośredni pomiar komórek w S-phase3. Ten bezpośredni pomiar pozwala uniknąć konieczności stosowania przeciwciał drugorzędowych lub stosowania środków denaturujących DNA, takich jak kwas lub DNaza. W połączeniu z markerami cykli wewnątrzkomórkowych umożliwia wysoką rozdzielczość rozkładu cyklu komórkowego w modelach eksperymentalnych.
Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do popularnych protokołów cytometrii przepływowej dla MCM. Nasze metody zapewniają wygodny i prosty sposób uwzględniania parametrów cyklu komórkowego. Inkorporacja IdU próbek in vitro wymaga tylko 10 do 15 minut inkubacji w temperaturze 37 °C, czyli krócej niż większość protokołów barwienia BrdU, które zalecają czas inkubacji wynoszący kilka godzin3,7. Próbki zawierające IdU i BrdU można utrwalić za pomocą stabilizatora proteomicznego, a następnie przechowywać przez pewien czas w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Pozwala to na archiwizację dużej liczby próbek barwionych IdU do analizy wsadowej bez obniżania jakości próbki.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Składnik</td></tr><tr><td>wirówki</td> CSM <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Wirowanie próbki</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identyfikacja komórek apoptotycznych</td></tr><tr><td>Cyklina B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Rozdzielczość</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Kriokonserwant</td></tr><tr><td>EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Wewnętrzny metalowy standard do wydajności CyTOF</td></tr><tr><td>Rurka FACS z sitkiem siatkowym</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Sitko do komórek do usuwania grudek/zanieczyszczeń przed uruchomieniem CyTOF</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Suplement na wzrost hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF System/Platforma</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Dodatek barwiący zapobiegający niespecyficznemu barwieniu</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2&prime;-deoksyurydyna)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Zawiera w fazie S</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Potwierdzenie G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Zestaw do etykietowania metali, mocuje metale do przeciwciał</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>Thermo Scientific 88880023</td><td></td><td>Mieszanie próbek podczas barwienia</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td>Utrwalacz</td></tr><tr><td>pentametylocyklopentadienylo-Ir(III)-dipirydofenazyny</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Identyfikacja komórek podczas akwizycji CyTOF</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Wykrywanie uszkodzeń DNA</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td> Sól fizjologiczna buforowana fosforanem o <td>rozdzielczości M-fazowej</td></tr><tr><td>(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Roztwór płuczący do hodowli komórkowych i składnik roztworu utrwalającego</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td> Stabilizator proteomiczny o <td>rozdzielczości G0/G1</td></tr><tr><td></td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Utrwalacz próbki</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>Składnik buforu CSM/przeciwciała, biocyd</td></tr></tbody></table>

zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (idu) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Regulacja fazy cyklu komórkowego jest ważnym aspektem proliferacji komórkowej i homeostazy. Zakłócenie mechanizmów regulacyjnych rządzących cyklem komórkowym jest cechą wielu chorób, w tym raka. Badanie cyklu komórkowego wymaga umiejętności zdefiniowania liczby komórek w każdej części progresji cyklu komórkowego, a także wyraźnego rozgraniczenia między każdą fazą cyklu komórkowego. Pojawienie się cytometrii masowej (MCM) zapewnia ogromny potencjał w zakresie wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek poprzez bezpośrednie pomiary izotopów pierwiastków, a opracowanie metody pomiaru stanu cyklu komórkowego za pomocą MCM jeszcze bardziej rozszerza użyteczność MCM. Tutaj opisujemy metodę, która bezpośrednio mierzy 5-jodo-2′-deoksyurydynę (IdU), podobną do 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU), w systemie MCM. Korzystanie z tego MCM opartego na IdU ma kilka zalet. Po pierwsze, IdU jest szybko włączany do DNA podczas jego syntezy, co pozwala na wiarygodny pomiar komórek w fazie S przy inkubacji trwającej zaledwie 10-15 minut. Po drugie, IdU mierzy się bez potrzeby stosowania przeciwciał wtórnych lub konieczności degradacji DNA. Po trzecie, barwienie IdU można łatwo połączyć z pomiarem cykliny B1, fosforylowanego białka siatkówczaka (pRb) i fosforylowanego histonu H3 (pHH3), co łącznie zapewnia wyraźne nakreślenie pięciu faz cyklu komórkowego. Połączenie tych markerów cyklu komórkowego z dużą liczbą parametrów możliwą do uzyskania dzięki MCM pozwala na połączenie z wieloma innymi wskaźnikami.

Wykorzystując komórki HL-60 oraz aspirat szpiku kostnego człowieka, można wykazać, w jaki sposób warunki eksperymentalne mogą wpływać na rozkład i analizę cyklu komórkowego. W pierwszej kolejności należy opracować strategię bramkowania (gating), aby zademonstrować, w jaki sposób wyznacza się fazy cyklu komórkowego. Na Rysunku 1 przedstawiamy ustalanie bramki dla singletów, co jest istotne dla oddzielenia debris komórkowego oraz dubletów i wyodrębnienia populacji pojedynczych komórek. W przyp...

Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do wykorzystania na platformie cytometrii masowej. Dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii masowej, bezpośredni pomiar inkorporacji jodu umożliwia identyfikację komórek w fazie S, podczas gdy markery cyklu wewnątrzkomórkowego umożliwiają scharakteryzowanie każdego stanu cyklu komórkowego w szeregu warunków eksperymentalnych.

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Protokół ten pozwala nam zbadać cykl komórkowy na poziomie pojedynczej komórki za pomocą cytometru masowego, a to umożliwia przeprowadzenie kilku nowatorskich badań i badań klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota. IdU jest dodawany bezpośrednio do komórek i nie ma potrzeby dalszego leczenia ani przeciwciał.Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania stanu cyklu komórkowego u pacjentów z ostrą białaczką szpikową w obrębie przedziałów komórek macierzystych i progenitorowych. To pokazało, że właściwości cyklu komórkowego tych konkretnych typów komórek mogą korelować z wynikami klinicznymi pacjentów z tymi chorobami. Technika ta może być przydatna do zrozumienia właściwości wzrostu rzadkich komórek nowotworowych i zrozumienia proliferacji podzbiorów komórek odpornościowych.Przed i po dodaniu IdU do próbek komórek, utrzymuj komórki w interesujących je warunkach wzrostu. W tym przypadku w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2 w celu oznaczenia komórek IdU, rozcieńczyć stężony roztwór podstawowy IdU w ilości od 1 do 50 w pożywce wzrostowej komórek. Następnie przenieś próbki do okapu bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 10 mikrolitrów jednego milimolowego IdU do każdego mililitra komórek.Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 10 do 15 minut przed przeniesieniem próbek do pojedynczych stożkowych probówek. Zbierz komórki przez odwirowanie w 15-mililitrowych stożkowych probówkach i ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach PBS na probówkę. W razie potrzeby oznacz komórki odpowiednią żywą/martwą plamą, aby oznaczyć martwe komórki.Po barwieniu żywym/martwym, ugasić komórki pożywką przemytą CSM przed utrwaleniem komórek za pomocą 25 mikrolitrów 16% paraformaldehydu. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać komórki przez odwirowanie. Dodaj od pięciu do 15 mililitrów CSM i ponownie odwiruj.Zawiesić granulki w 500 mikrolitrach pożywki do barwienia komórek uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem. Następnie przenieś komórki do mniejszych probówek, aby przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby znormalizować analizę cyklu komórkowego, zaimportuj pliki do odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i utwórz dwuosiowy wykres długości zdarzenia w funkcji 191 irydu.Komórki utworzą wyraźną populację o wysokiej zawartości jasnego irydu. Zmień skalę długości zdarzenia, aby komórki były bardziej widoczne. Następnie utwórz bramkę singletową, aby wykluczyć od 50 do 60% dubletów i gruzu, a następnie ustaw szczątkowe i przesunięte parametry Gaussa, aby usunąć wszelkie pozostałe dublety i zanieczyszczenia.Aby ustawić bramkę fazy S, utwórz dwuosiowy wykres IdU w funkcji znacznika proliferacji. Komórki dodatnie IdU w fazie S utworzą odrębną populację. W przypadku bramkowania G0/G1 i G2/M ustal bramki na wykresie IdU i Cyclin B1.Faza G0 / G1 będzie niską cykliną B1, ujemną IdU, a fazą G2 / M będzie wysoką cykliną B1, ujemną IdU. Aby uzyskać bramkę dla określonych typów komórek, wykreśl tylko komórki fazy S na wykresie cykliny B1 w funkcji IdU, aby pomóc w ustaleniu separacji między komórkami fazy G0 / G1 i G2 / M. Narysuj bramę wokół wysokiej populacji cykliny B1.W niektórych przypadkach może to być trudne do zauważenia, ale poziom cykliny B1 wynoszący około 5% populacji fazy S jest zazwyczaj punktem granicznym między bramkami fazowymi G0 / G1 i G2 / M. Komórki znajdujące się w poprzedniej bramce będą populacją fazy G2 / M, podczas gdy reszta będzie populacją fazy G0 / G1. Aby ustalić populację fazy G0, utwórz wykres fosforylowanego białka siatkówczaka w funkcji IdU.Faza G0 będzie reprezentowana przez fosforylowaną populację białka siatkówczaka o niskiej wartości IdU. Ponieważ aktywna populacja cykliczna będzie wykazywać wysoko ufosforylowane białko siatkówczaka i inkorporację IdU, bramka fazowa G0 może zostać narysowana na tej granicy, ponieważ zwykle ulega ekspresji w dwóch różnych populacjach. Jeśli bramka G0 jest trudna do zdefiniowania, uczyń populację fazy S populacją aktywną i narysuj bramkę zawierającą górne 90 do 100% populacji o wysokiej zawartości fosforylowanego białka siatkówczaka.Fosforylowana populacja białka siatkówczaka o niskiej zawartości poza bramą to zazwyczaj populacja G0, podczas gdy komórki G0 / G1 z poziomami pRb, które mieszczą się w tej bramce, to komórki G1. W przypadku bramkowania w fazie M utwórz IdU w stosunku do fosforylowanego histonu H3 na wykresie osiowym. Faza fazy M będzie obserwowana jako bardzo mała frakcja komórek w populacji fosforylowanego histonu H3.Komórki w populacji G2/M o niższym poziomie pHH3 to komórki G2. Jeśli inkorporacja IdU nie powiodła się lub nie była możliwa, zdefiniuj cykliczne i niecykliczne frakcje komórek za pomocą Ki67 i fosforylowanego białka siatkówczaka. Podwójnie dodatnia populacja będzie reprezentować aktywną populację rowerową korelującą z fazami G1, S, G2 i M.Podwójnie niska populacja będzie reprezentować populację niecykliczną korelującą z fazą G0. Po ustanowieniu wszystkich bramek wyeksportuj wartości liczbowe z bramek. Wartości procentowe w każdym cyklu można uzyskać, odejmując pojedyncze populacje od połączonych populacji, aby wygenerować wartości liczbowe dla każdej pojedynczej fazy cyklu komórkowego do późniejszego tworzenia wykresów i analizy statystycznej.Ustanowienie bramki singletowej jest ważne dla oddzielenia szczątków komórkowych i dubletów, aby umożliwić izolację populacji pojedynczej komórki. Następnie można przeprowadzić analizę cyklu komórkowego pojedynczych komórek. Na znakowanie IdU, a tym samym na dalszą analizę cyklu komórkowego, może mieć znaczący wpływ czas i temperatura.Na przykład komórki, które pozostają zbyt długo w zamkniętych naczyniach lub w transporcie między lokalizacjami, będą miały zmniejszone frakcje fazy S, co nie będzie dokładne w przypadku analizy cyklu komórkowego. Próbki komórek utrzymywane przez krótkie okresy godziny lub krócej nadal wykazują normalny rozkład cyklu komórkowego, co wskazuje, że szybki transport może nie mieć negatywnego wpływu na analizę. Kriokonserwowane komórki mogą wymagać długiego okresu równowagi, zanim komórki powrócą do aktywnego cyklu komórkowego, który nadal może nie odzwierciedlać stanu cyklu komórkowego sprzed kriokonserwacji.Na różne typy komórek mogą również w różny sposób wpływać warunki utrzymania. Na przykład w tej próbce ludzkiego szpiku kostnego limfocyty T wykazały zmniejszenie liczby komórek w porównaniu z monoblastami z tej samej próbki. Kolejną zaletą cytometrii masowej jest zdolność do rozróżniania komórek w zatrzymaniu cyklu komórkowego lub tych, które mają nieprawidłowy rozkład cyklu komórkowego.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona łatwo kompatybilna z innymi pomiarami cytometrii masowej, takimi jak fenotypowanie powierzchniowe, struktura chromatyny, stymulacja cytokin wewnątrzkomórkowych, które można skorelować ze stanem cyklu komórkowego. Użyliśmy tej techniki do zbadania wyczerpania komórek odpornościowych, starzenia się i pokazania, że odpowiedź na chemioterapię u pacjentów z ostrą białaczką może korelować z właściwościami cyklu komórkowego komórek białaczkowych.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.

Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Ten film opisuje protokół barwienia immunofluorescencyjnego BrdU. Technika ta pozwala na identyfikację komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciał pozwala na szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Barwienie immunofluorescencyjne BrdU: technika identyfikacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego

Film demonstruje oparte na immunofluorescencji podejście do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych. Komórki poddane działaniu hydroksymocznika wytwarzają jednoniciowy DNA, wykrywany za pomocą immunofluorescencji. Liczba ognisk zielonej fluorescencji wskazuje na poziom stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych.

Metoda oparta na immunofluorescencji do ilościowego określania stresu replikacyjnego w komórkach nowotworowych

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

W obecnym protokole pokazujemy, jak wizualizować dwuniciową resekcję końca DNA podczas fazy S/G2 cyklu komórkowego przy użyciu metody opartej na immunofluorescencji.

Ocena globalnej resekcji końca dwuniciowego DNA przy użyciu znakowania BrdU-DNA w połączeniu z obrazowaniem dyskryminacji cyklu komórkowego

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Poznaj analizę cyklu komórkowego na poziomie pojedynczych komórek za pomocą cytometrii masowej z wykorzystaniem analogu pirymidyny IdU. Ta metoda pozwala badać właściwości proliferacyjne rzadkich komórek nowotworowych i podzbiorów komórek odpornościowych.

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów