Name: Model angiogenezy wieńcowej in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj model angiogenezy wieńcowej in vitro wykorzystujący eksplanty zatoki zatokowej i śródbłonka myszy. Ta metoda pozwala badać odpowiedź komórkową na VEGF-A oraz mechanizmy tworzenia naczyń krwionośnych serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Sharma za zapewnienie wspierającego środowiska badawczego. Szczególne podziękowania kierujemy do Diane (Dee) R. Hoffman, która utrzymuje i opiekuje się naszą kolonią myszy. Chcielibyśmy również podziękować doktorom Philipowi J. Smaldino i Carolyn Vann za staranną korektę manuskryptu i dostarczenie pomocnych komentarzy. Praca ta była wspierana przez fundusze z Biura Rektora Uniwersytetu Stanowego Ball i Wydziału Biologii dla B.S., fundusze Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant dla B.S. oraz fundusze NIH (RO1-HL128503) i The New York Stem Cell Foundation dla K.R.

Użycie wszystkich zwierząt w tym protokole było zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Ball State University.
1. Ustalanie hodowli myszy i wykrywanie zatyczek dopochwowych w przypadku ciąży w określonym czasie
<ol>
	<li>Ustaw klatkę hodowlaną myszy z samcami i samicami myszy typu dzikiego. Upewnij się, że wiek myszy hodowlanych wynosi od 6 do 8 tygodni. Ustaw parę (1 samiec i 1 samicę) lub jako trio (1 samiec i 2 samice) do hodowli.</li>
	<li>Następnego ranka sprawdź, czy nie ma korka dopochwowego. Użyj kątowej metalowej sondy, aby wykryć głęboką zatyczkę, wkładając ją do otworu pochwy. Oznacz poranek dodatniego czopu pochwowego jako dzień embrionalny 0,5 (e0,5). 
	UWAGA: Czop dopochwowy może być albo powierzchowny (który jest łatwo widoczny, patrz Rysunek 1) lub głęboki (który nie jest łatwo widoczny). Obecność głębokiej zatyczki zablokuje pełne włożenie sondy, podczas gdy brak wtyczki pozwoli na pełne włożenie bez oporu.</li>
	<li>Utrzymuj ciążę w czasie, aż zarodki osiągną e11.5, w którym zostaną zebrane. Aby potwierdzić ciążę przed pobraniem zarodków, zapisz masę samic myszy między e7,5 a e11,5, 
	UWAGA: Codzienny wzrost masy ciała matki będzie wskazywał na udaną ciążę, podczas gdy brak zmiany masy ciała będzie wskazywał na nieudaną ciążę.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków od ciężarnych myszy
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: komora eutanazyjna CO2, 70% etanolu, ręczniki papierowe, zwykłe kleszcze, cienkie kleszcze, nożyczki, 1x sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10 cm sterylne szalki Petriego, pojemnik z lodem, perforowana łyżka, stereoskop preparacyjny.
<ol>
	<li>Umieść ciężarną mysz e11.5 w czystej komorze eutanazyjnej CO2 , aby ją poświęcić. Zamknij pokrywę komory, aby zapobiec ucieczce myszy.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu myszy w komorze eutanazyjnej włącz CO2. Upewnij się, że regulujesz natężenie przepływu CO2 zgodnie z zaleceniami IACUC (tj. 10-30% wyporności na minutę). Po całkowitej eutanazji myszy wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę nad brzuch za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie za pomocą nożyczek i przedłuż nacięcie na boki. Powiększ nacięcie do przodu aż do przepony i odsłoń róg macicy zawierający zarodki (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2).</li>
	<li>Wyciągnij sznurek zarodków (róg macicy + zarodki), chwytając macicę i odcinając ją. Umieść sznurek zarodków w lodowato zimnym sterylnym 1x PBS.</li>
	<li>Wypreparuj poszczególne zarodki z rogu macicy, odrywając mięsień macicy, woreczek żółtkowy i owodnię jeden po drugim (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A-F) pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś oczyszczone zarodki za pomocą perforowanej łyżki na szalkę Petriego zawierającą sterylny 1x PBS na lodzie. Upewnij się, że zarodki są zimne.</li>
</ol>
3. Izolowanie serc od embrionów e11.5
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: zwykłe kleszcze, drobne kleszcze, 1x sterylny PBS, 10 cm sterylna szalka Petriego, 6 cm sterylna szalka Petriego, pojemnik z lodem, perforowana łyżka, stereoskop preparacyjny.
<ol>
	<li>Ustaw nową szalkę Petriego z lodowato zimnym sterylnym 1x PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś zarodek z kroku 2.5 na szalkę Petriego, aby wypreparować serce.</li>
	<li>Usuń głowę zarodka za pomocą kleszczy. Najpierw jedną ręką ściśnij głowę między kleszczami, a następnie zdejmij głowę, zeskrobując ją drugą ręką za pomocą zamkniętych kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A-C).</li>
	<li>Po zdjęciu głowy ustaw zarodek brzuszną stroną do góry, trzymając zarodek kleszczami na brzuchu jedną ręką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4D).</li>
	<li>Drugą ręką otwórz ścianę klatki piersiowej zarodka, wykonując najpierw małe nacięcie w klatce piersiowej nieco powyżej przepony za pomocą cienkich kleszczy. Następnie bardzo ostrożnie powiększ nacięcie, wkładając zamknięte kleszcze i rozrywając ścianę klatki piersiowej, otwierając kleszcze. Upewnij się, że nie pchasz zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić serce. Za pomocą kleszczy utrzymuj ścianę klatki piersiowej szeroko otwartą, aby odsłonić serce i płuca w klatce piersiowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4E).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie przesuń serce do przodu (90°) i odsłoń aortę/żyłę grzbietową. Wyciągnij serce/płuca do przodu, chwytając aortę grzbietową/żyłę u podstawy serca (<silna klasa="xfig">Rysunek 4F-H). 
	UWAGA: Bądź delikatny podczas wyciągania serca/płuc, aby uniknąć rozerwania SV, który znajduje się po grzbietowej stronie serca.</li>
	<li>Przepłucz serce/płuca zimnym 1x PBS, aby usunąć krwinki.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.6, aby usunąć serce/płuca z pozostałych zarodków. Upewnij się, że izolowane serce/płuca znajdują się na lodzie.</li>
</ol>
4. Izolowanie SV i komór od e11.5 Embrionalne serca myszy
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego z sercem/płucami z kroku 3.7 pod mikroskopem stereoskopowym, aby wyizolować SV i całe komory. Oderwij przyczepione płaty płuc jeden po drugim od ich korzenia za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Ustaw serce na jego grzbietowej stronie i usuń przedsionki i przylegającą tkankę otaczającą SV z przodu, nie rozrywając SV. Usuń lewe i prawe przedsionki z serca, przytrzymując je u podstawy i zeskrobując za pomocą cienkich kleszczy (<silna klasa="xfig">Ryc. 5B). Usuń sąsiednią tkankę otaczającą SV przy użyciu podobnej techniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). 
	UWAGA: Należy pamiętać, że prawe przedsionek jest przymocowany do SV, więc należy uważać, aby zdjąć tylko przedsionek.</li>
	<li>Aby odizolować SV, najpierw ustaw serce grzbietową stroną skierowaną do góry (ponieważ SV znajduje się po stronie grzbietowej) i utrzymuj serce w tej pozycji, delikatnie przytrzymując serce w komorach za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: SV jest narządem dopływowym serca embrionalnego, który leży pomiędzy przedsionkami po grzbietowej stronie serca.</li>
	<li>Usuń SV, ostrożnie odklejając go od serca, do którego jest przymocowany, lub przytrzymując SV u podstawy jego mocowania za pomocą cienkich kleszczyków i zeskrobując go zamkniętymi kleszkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5D,E).</li>
	<li>Przenieść wyizolowaną SV na nową 6-centymetrową szalkę Petriego z lodowato zimnym sterylnym 1x PBS na lodzie za pomocą sterylnej pipety transferowej i oznaczyć szalkę Petriego jako SV.</li>
	<li>Aby wyizolować całe komory, usuń drogę odpływu (aortę i pień płucny) z serca po usunięciu SV (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5F,G).</li>
	<li>Przenieść całe komory na nową 6 cm szalkę Petriego zawierającą sterylny 1x PBS na lodzie za pomocą sterylnej pipety transferowej i oznaczyć szalkę Petriego jako komory. Trzymaj izolowany SV i komory na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.7, aby wyizolować SV i komory z pozostałych serc.</li>
</ol>
5. Ustawianie płytek do hodowli tkankowych z wkładkami i powłoką macierzy zewnątrzkomórkowej
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: komercyjny roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM; np. Matrigel), wkładki do hodowli politereftalanu etylenu (PET) 8,0 μM, płytki 24-dołkowe, 37 °C, inkubator 5% CO2.
<ol>
	<li>Pozwól roztworowi ECM rozmrozić się na lodzie. Roztwór ECM należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć zestalenia.</li>
	<li>Umieścić wkładki do hodowli membranowej PET (wielkość porów = 8,0 μm, obszar filtracji = 0,3 cm2, średnica filtra = 6,5 mm) w studzienkach 24-dołkowych płytek poddanych działaniu kultur nietkankowych. Oznacz płytki jako SV lub komory odpowiednio do testów SV lub angiogenezy wsierdzia. 
	UWAGA: Umieść wkładki w osobnych płytkach dla SV i komór podczas wykonywania obu kultur jednocześnie. Upewnij się, że ustawiłeś wystarczającą liczbę studzienek dla wszystkich próbek eksperymentalnych i kontroli.</li>
	<li>Po rozmrożeniu roztworu ECM należy natychmiast rozcieńczyć ECM w stosunku 1:2 we wstępnie schłodzonym podłożu podstawowym (tj. pożywce podstawowej EBM-2, patrz Tabela Materiałów) do odpowiedniej objętości (100 μl/wkładkę x liczba wkładek). 
	UWAGA: Na przykład, jeśli jest sześć wkładek, całkowita objętość wyniesie 100 μL x 6 = 600 μL. Dodaj 200 μL ECM do 400 μL podłoża podstawowego.</li>
	<li>Pokryj wkładki 100 μl świeżo rozcieńczonego ECM, dodając go bezpośrednio na membranę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut, aby umożliwić ECM zestalenie się. 
	UWAGA: Należy to wykonać pod kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>
6. Kultury SV i całych komór
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: 70% etanol, pipeta transferowa, stereomikroskop, kleszcze, kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, zestaw uzupełniający komórki śródbłonka mikronaczyniowego (tabela materiałów), podłoże podstawowe, 1x sterylny PBS). Rysunek 6 pokazuje przebieg SV i hodowli komorowej.
<ol>
	<li>Rozmrozić zawartość zestawu suplementów na lodzie. Przygotować kompletną pożywkę, dodając całą zawartość zestawu suplementów do 500 ml podłoża podstawowego pod certyfikowanym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym. Dobrze wymieszać podłoże i rozprowadzić na 50 ml porcji.</li>
	<li>Wysterylizuj podstawę mikroskopu stereoskopowego i otaczający go obszar roboczy 70% etanolem.</li>
	<li>Uzyskać płytki do hodowli tkankowych z kroku 5.4. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie przenieś eksplantaty z kroku 4.7 na membranę wkładu. Pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą czystych kleszczyków umieść eksplantaty na środku wkładek, aby upewnić się, że nie utknęły w rogu wkładek ani nie są przymocowane do ścianek bocznych.</li>
	<li>Po umieszczeniu eksplantatów i wyśrodkowaniu ich na wkładkach, ostrożnie usuń nadmiar PBS z wkładek i zamknij pokrywki płytek.</li>
	<li>Pod kapturem do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym dodać 100 μl wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki na wierzch wkładek i 200 μl do studzienek, aby wyhodować eksplantaty na granicy faz powietrze-ciecz tak, aby podstawowa powierzchnia wkładki stykała się z pożywką, ale górna powierzchnia była wystawiona na działanie powietrza. 
	UWAGA: Upewnij się, że dostosowałeś głośność, aby uzyskać interfejs powietrze-ciecz, jeśli używasz wkładek/płytek dołkowych o różnych rozmiarach.</li>
	<li>Dodać 300 μl PBS do niewykorzystanych studzienek na płytkach 24-dołkowych i przykryć pokrywką. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i hodować kultury przez 5 dni.</li>
	<li>W kolejnych dniach rutynowo obserwuj kultury pod mikroskopem światła odwróconego, aby ocenić stan kultur eksplantatów. Upewnij się, że eksplantaty wykazują bicie skurczowe i że wszystkie eksplantaty są przymocowane do dna membrany osadzonej za pomocą ECM. Zwróć uwagę na wszelkie pływające eksplantaty. 
	UWAGA: Okresowe kurczenie się eksplantatów wskazuje, że są żywe. W analizie należy pominąć eksplantaty pływające.</li>
	<li>Po ocenie stanu kultury umieść płytkę hodowlaną z powrotem w inkubatorze i kontynuuj hodowlę przez okres do 5 dni.</li>
</ol>
7. Traktowanie kultur za pomocą VEGF-A (kontrola pozytywna)
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym, 1x PBS, podłoże podstawowe + 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), podłoże podstawowe + VEGF-A, pipety i końcówki do pipet.
<ol>
	<li>Przygotować podłoże podstawowe + 1% FBS i podłoże podstawowe + VEGF-A.
	<ol>
		<li>Aby przygotować podłoże podstawowe + 1% FBS, najpierw określ liczbę potrzebnych studzienek kontrolnych. Na przykład, jeśli istnieją trzy studzienki kontrolne, to 300 μL/studzienkę x 3 = 900 μL to całkowita potrzebna objętość. Dodaj 9 μl FBS do 891 μl podłoża podstawowego, aby uzyskać podłoże podstawowe + 1% FBS.</li>
		<li>Aby przygotować podłoże podstawowe + VEGF-A, najpierw określ całkowitą liczbę studzienek wymagających pożywki VEGF-A. Jeśli są trzy dołki, to 300 μL/studzienkę x 3 = 900 μL to całkowita objętość, a 50 ng/studzienka x 3 = 150 ng VEGF-A. Dodać 150 ng VEGF-A do 900 μl podłoża podstawowego, aby uzyskać podłoże podstawowe + VEGF-A. 
		UWAGA: Złóż ten roztwór w większej objętości niż obliczono, aby zapewnić wystarczającą liczbę mniejszych porcji dla każdego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 2 usuń pożywkę z obu komór (wkładek i studzienek). Przemyć kultury 300 μL 1x PBS, dodając 100 μL do wkładek i 200 μL do studzienek. Mocno zakręć płytkami kilka razy i wyjmij PBS.</li>
	<li>Dodać 300 μl podłoża podstawowego + 1% FBS (100 μl do wkładki i 200 μl do studzienek), aby zagłodzić kultury przez 24 godziny.</li>
	<li>W dniu 3, po zagłodzeniu, dodać odpowiednio 300 μl podłoża podstawowego + 1% FBS (100 μl do wkładki i 200 μl do studzienek) do studzienek kontrolnych i podłoża podstawowego + VEGF-A (50 ng/studzienkę) do studzienek zabiegowych.</li>
	<li>Po leczeniu kontynuuj hodowlę kultur w inkubatorze.</li>
</ol>
8. Utrwalenie i barwienie immunologiczne
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujący sprzęt i odczynniki: 4% paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, przeciwciała pierwszorzędowe i wtórne, shaker, 0,5% niejonowy środek powierzchniowo czynny w PBS (PBT).
<ol>
	<li>Szóstego dnia hodowli usunąć pożywkę i przemyć kultury 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).
	<ol>
		<li>Utrwalić kultury, dodając 200 μl 4% roztworu PFA do studzienek i 100 μl do wkładek. Utrwal kultury w temperaturze 4 °C na 20 minut podczas kołysania.</li>
		<li>Po 20 minutowym utrwaleniu usunąć PFA z kultur w dygestoriach i przemyć kultury 1x PBS, dodając 200 μl do studzienek i 100 μl do wkładek.</li>
		<li>Powtórz pranie 3 razy po 10 minut, jednocześnie bujając. Następnie przystąp do wykonywania barwienia immunologicznego. 
		UWAGA: Wszystkie etapy mycia są wykonywane na blacie w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VE-kadheryna, anty-ERG 1/2/3) w roztworze blokującym (5% surowica osła, 0,5% PBT). Dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (200 μl do studzienek dennych i 100 μl do wkładek). Inkubować kultury w przeciwciałach pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C podczas kołysania. 
	UWAGA: Anty-VE-kadheryna służy do znakowania błony komórkowej śródbłonka, a anty-ERG 1/2/3 służy do znakowania jądra komórkowego śródbłonka w celu uwidocznienia angiogennych kiełków komórek śródbłonka.</li>
	<li>Następnego dnia umyj i rozbujaj płytki hodowlane 10x w 0,5% PBT, zmieniając PBT co 10 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (anty-szczur Alexa Fluor 488 i osła anty-królik Alexa Fluor 555) w roztworze blokującym. Dodać 300 μl przeciwciała drugorzędowego, jak w kroku 8.2 i inkubować kultury przez noc w temperaturze 4 °C, kołysząc się. Następnego dnia przemyj przeciwciała drugorzędowe 10 razy w PBT, zmieniając PBT co 10 min. 
	UWAGA: Prać minimum 10 razy, ale więcej prań jest lepszych. Po zakończeniu mycia kultury można przechowywać z 1x PBS do momentu zamontowania na szkiełkach.</li>
</ol>
9. Montaż kultur na szkiełkach, obrazowanie i analiza
UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz następujące urządzenia i odczynniki: drobne kleszcze, szkiełka, podłoże montażowe z 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), szkiełka nakrywkowe i mikroskop konfokalny. Po wtórnym barwieniu przeciwciałami zamontuj kultury na szkiełkach w celu obrazowania, wykonując następujące czynności.
<ol>
	<li>Ostrożnie oderwij membranę od wkładki za pomocą drobnych kleszczyków i przenieś ją na szkiełka, kładąc membranę stroną do dołu i umieszczając kultury eksplantatów do góry. Umieść powtórzone próbki na tych samych szkiełkach i oznacz je jako kontrolne lub VEGF-A. Dodać kilka kropel medium montażowego z DAPI bezpośrednio na membranę i przykryć szkiełka szkiełkami nakrywkowymi. 
	UWAGA: Upewnij się, że podczas zakładania szkiełek nakrywkowych nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Uszczelnij krawędzie szkiełek przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia. 
	UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Szkiełka obrazowe za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Wykonaj analizę, aby zmierzyć długość wyrostu angiogennego. Określ ilościowo długość wzrostu angiogennego, mierząc odległość komórek śródbłonka (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) rozciągniętych od wewnętrznej granicy komórek ERG 1/2/3+ w hodowlach komorowych i od środka eksplantatów SV w kulturach SV.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić kwantyfikację za pomocą FIJI/ImageJ, najpierw pobierz oprogramowanie FIJI.</li>
		<li>Otwórz pliki obrazów na FIDŻI: przejdź do Plik | Otwórz | Teczka | Nazwa pliku | Otwarty.</li>
		<li>Przejdź do punktu Analiza | Ustawianie pomiarów | Wybierz opcję Obwód.</li>
		<li>Wybierz narzędzie Linia prosta w oknie głównym.</li>
		<li>Narysuj linię w poprzek długości kiełka, zgodnie z sugestią w kroku 9.4.</li>
		<li>Przejdź do punktu Analiza | Środek. 
		UWAGA: Pomiary długości są wyświetlane w nowym oknie.</li>
		<li>Wykonaj kwantyfikację na obrazach, które reprezentują co najmniej trzy losowo wybrane pola widzenia. Uśrednij pomiary długości kiełków i podaj je jako średnią ± odchylenie standardowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Red-Horse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
<li>Volz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+progenitors+for+coronary+artery+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+and+aortic+cardiomyocytes+guide+coronary+artery+stem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).</li>
<li>Chang, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DACH1+stimulates+shear+stress-guided+endothelial+cell+migration+and+coronary+artery+growth+through+the+CXCL12-CXCR4+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis.</a> Genes and Development. , (2017).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cells+Form+the+Coronary+Arteries+by+Angiogenesis+through+Myocardial-Endocardial+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).</li>
<li>Das, S., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+in+cardiovascular+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity in cardiovascular development and disease.</a> Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).</li>
<li>Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Development%3A+Progenitor+Cells+and+Differentiation+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways.</a> Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).</li>
<li>Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+and+developmental+program+of+coronary+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis.</a> Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).</li>
<li>Ruhrberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+patterning+cues+provided+by+heparin-binding+VEGF-A+control+blood+vessel+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis.</a> Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).</li>
<li>Kikuchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antiangiogenic+isoform+of+VEGF-A+contributes+to+impaired+vascularization+in+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).</li>
<li>Folkman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+tumor+factor+responsible+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+VEGF+in+the+regulation+of+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis.</a> Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).</li>
<li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%2C+a+specific+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niektóre z najważniejszych kroków do pomyślnego wyhodowania naczyń wieńcowych z tkanek progenitorowych SV i Endo to: 1) Prawidłowa identyfikacja i wyizolowanie tkanki SV do hodowli SV; 2) wykorzystanie komór z zarodków w wieku od e11−11,5 do dokładnej hodowli Endo; 3) utrzymanie sterylnych warunków przez cały okres preparacji i utrzymywanie tkanek w chłodzie przez cały czas; oraz 4) utrzymywanie eksplantatów przymocowanych do membrany pokrytej ECM, aby uniknąć unoszenia się tkanki w podłożu.
P...

Naczynia krwionośne serca są powszechnie nazywane naczyniami wieńcowymi. Naczynia te składają się z tętnic, żył i naczyń włosowatych. Podczas rozwoju najpierw powstają silnie rozgałęzione naczynia włosowate, które następnie przekształcają się w tętnice i żyły wieńcowe1,2,3,4,5. Te początkowe naczynia włosowate są zbudowane z komórek progenitorowych śródbłonka znajdujących się w tkankach nadsierdzia, zatoki żylnej (SV) i wsierdzia (Endo)1,6,7,8. SV jest narządem dopływowym serca embrionalnego, a Endo jest wewnętrzną wyściółką światła serca. Śródbłonkowe komórki progenitorowe znajdujące się w SV i Endo budują większość naczyń wieńcowych, podczas gdy nasierdzie przyczynia się do stosunkowo niewielkiej jego części2. Proces, w którym sieć naczyń włosowatych naczyń wieńcowych rośnie w sercu z wcześniej istniejących komórek prekursorowych, nazywa się angiogenezą wieńcową. Choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a mimo to brakuje skutecznego leczenia tej choroby. Zrozumienie szczegółowych mechanizmów komórkowych i molekularnych angiogenezy wieńcowej może być przydatne w projektowaniu nowatorskich i skutecznych terapii naprawy i regeneracji uszkodzonych tętnic wieńcowych.
Ostatnio, dzięki rozwojowi nowych narzędzi i technologii, nasz wzrost wiedzy na temat rozwoju naczyń wieńcowych został częściowo osiągnięty. W szczególności znakowanie linii in vivo i zaawansowane technologie obrazowania okazały się bardzo przydatne w odkrywaniu pochodzenia komórkowego i szlaków różnicowania naczyń wieńcowych9,10,11,12. Pomimo zalet tych narzędzi in vivo, istnieją ograniczenia pod względem szybkości, elastyczności i dostępności. W związku z tym solidne systemy modelowe in vitro mogą uzupełniać systemy in vivo w celu wyjaśnienia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej w sposób wysokoprzepustowy.
Tutaj opisujemy model in vitro angiogenezy wieńcowej. Opracowaliśmy system hodowli eksplantatów in vitro do hodowli naczyń wieńcowych z dwóch tkanek progenitorowych, SV i Endo. Za pomocą tego modelu pokazujemy, że w kulturach eksplantatów tkanek in vitro wyrastają kiełki naczyń wieńcowych, gdy są stymulowane przez pożywkę wzrostową. Dodatkowo, kultury eksplantatów rosną szybko w porównaniu z kontrolą, gdy są stymulowane przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A (VEGF-A), bardzo silne białko angiogenne. Ponadto stwierdziliśmy, że angiogenne kiełki z hodowli SV ulegają odróżnicowaniu żylnemu (utracie ekspresji COUP-TFII), mechanizmowi podobnemu do angiogenezy SV in vivo1. Dane te sugerują, że system hodowli eksplantatów in vitro wiernie przywraca zdarzenia angiogenne, które występują in vivo. Podsumowując, opisane tutaj modele angiogenezy in vitro są idealne do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej w sposób wysokoprzepustowy i dostępny.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 MM</td><td>Fisher Scientific 877222</td><td></td><td>Określany w protokole jako szalka Petriego</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli membrany PET 8,0 uM</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-królik 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-szczur 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Kątowa metalowa sonda</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>10088-15</td><td>Kąt 45 stopni, używany do wykrywania głębokich zatyczek Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-ERG 1/2/3</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-VE-Kadheryna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, producent BD BioSciences</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu CO2</td><td>Różni dostawcy</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>Dla 37 & stopni; C, 5% inkubacja CO2</td></tr><tr><td>Sekcja stereomicrosope</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i Stereomikroskop Leica S9i</td></tr><tr><td>EBM-2 podłoże podstawowe</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Wzrost komórek śródbłonka podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Roztwór ECM</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Komercyjnie znany jako Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Zestaw Singlequots</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Zestaw suplementów komórek śródbłonka mikronaczyniowego; Jest on mieszany z EBM-2, aby EGM-2 był kompletnym podłożem</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>11412-11</td><td>Używany do zarodka preparacja</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne Fisherbrand z prostym ostrzem</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli tkanek z przepływem laminarnym</td> Dostępne <td>różne modele</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield z DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia</td> <td>elektronowa/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Jest to dostępne w 32%; musi być rozcieńczone do 4%</td></tr> <tr><td>Łyżka perforowana</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>10370-18</td><td>Przydatny w usuwaniu zarodków/tkanek z roztworu</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze, Dumont #5</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Komora Sure-Seal na myszy/szczura</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Komora do eutanazji</td></tr></tbody></table>

model angiogenezy wieńcowej in vitro

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Tutaj opisujemy test in vitro do badania angiogenezy wieńcowej. Naczynia wieńcowe zasilają mięsień sercowy i mają znaczenie kliniczne. Ubytki w tych naczyniach stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia, takie jak miażdżyca, która może prowadzić do zawałów mięśnia sercowego i niewydolności serca u pacjentów. W związku z tym choroba wieńcowa jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Pomimo jego znaczenia klinicznego, poczyniono stosunkowo niewielkie postępy w zakresie regeneracji uszkodzonych tętnic wieńcowych. Niemniej jednak w ostatnim czasie poczyniono postępy w zrozumieniu komórkowego pochodzenia i szlaków różnicowania rozwoju naczyń wieńcowych. Pojawienie się narzędzi i technologii, które pozwalają naukowcom na fluorescencyjne znakowanie komórek progenitorowych, śledzenie ich losu i wizualizację potomstwa in vivo, odegrało zasadniczą rolę w zrozumieniu rozwoju naczyń wieńcowych. Badania in vivo są cenne, ale mają ograniczenia pod względem szybkości, dostępności i elastyczności w projektowaniu eksperymentów. Alternatywnie, dokładne modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą obejść te ograniczenia i umożliwić naukowcom szybkie i elastyczne badanie ważnych kwestii biologicznych. Brak odpowiednich systemów modelowych in vitro mógł utrudnić postęp w zrozumieniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu naczyń wieńcowych. Tutaj opisujemy system hodowli in vitro do hodowli naczyń wieńcowych z zatoki żylnej (SV) i wsierdzia (Endo), dwóch tkanek progenitorowych, z których powstaje wiele naczyń wieńcowych. Potwierdziliśmy również, że kultury dokładnie podsumowują niektóre ze znanych mechanizmów in vivo. Na przykład pokazujemy, że angiogenne kiełki w kulturze z SV obniżają ekspresję COUP-TFII podobnie jak to obserwuje się in vivo. Ponadto wykazaliśmy, że VEGF-A, dobrze znany czynnik angiogenny in vivo, silnie stymuluje angiogenezę zarówno z kultur SV, jak i Endo. Wspólnie opracowaliśmy dokładny model hodowli in vitro do badania angiogenezy wieńcowej.

Jedną z najbardziej uderzających cech angiogenezy SV in vivo jest to, że przebiega ona określoną ścieżką i obejmuje zdarzenia dedyferencjacji oraz redyferencjacji komórek, które występują w stereotypowych czasach i miejscach1. W miarę jak początkowe komórki SV narastają na komorę serca, przestają produkować markery żylne, takie jak COUP-TFII (Rycina 7). Następnie pąki wieńcowe przyjmują dwie drogi migracji: albo po powierzchni serca, a...

Modele angiogenezy wieńcowej in vitro mogą być wykorzystane do odkrycia komórkowych i molekularnych mechanizmów angiogenezy wieńcowej. Hodowle eksplantatów in vitro tkanek zatok żylnych i wsierdzia wykazują silny wzrost w odpowiedzi na VEGF-A i wykazują podobny wzór ekspresji COUP-TFII jak in vivo.

Model angiogenezy wieńcowej in vitro

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Nasz protokół jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom badać molekularny mechanizm angiogenezy wieńcowej poza organizmem. Główną zaletą tej techniki jest to, że dokładnie modeluje ona proces angiogenezy wieńcowej wewnątrz organizmu, ułatwiając badanie mechanizmów angiogenezy wieńcowej. Zacznij od spryskania ciężarnej myszy noszącej zarodki w 11,5 dniu zarodkowym 70% etanolem.Unosząc skórę nad brzuchem za pomocą kleszczy, użyj nożyczek, aby wykonać skórę brzucha i nacięcie otrzewnej bocznie i z przodu aż do przepony, aby odsłonić róg macicy. Chwytając macicę, odetnij tkankę i wyciągnij róg macicy. Umieść sznurek zarodków w lodowatym sterylnym PBS pod mikroskopem stereoskopowym i oderwij mięsień macicy, woreczek żółtkowy i osłonę owodniową z każdego zarodka.Podczas izolowania każdego zarodka należy użyć perforowanej łyżki, aby przenieść tkanki na nową szalkę Petriego zawierającą sterylny PBS na lodzie. Aby pobrać zarodkową tkankę serca, przenieś pierwszy zarodek, który ma zostać wypreparowany, na nową szalkę Petriego pod mikroskopem i umieść zarodek brzuszną stroną do góry. Użyj cienkich kleszczy, aby wykonać małe nacięcie w klatce piersiowej, nieco powyżej przepony, i włóż zamknięte kleszcze do nacięcia, aby powiększyć nacięcie.Używając kleszczy do przytrzymania otwartej ściany klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca, użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie przesunąć serce do przodu o 90 stopni, aby odsłonić aortę grzbietową i żyłę. Następnie, chwytając te naczynia u podstawy serca, ostrożnie wyciągnij serce i płuca do przodu i spłucz tkanki zimnym PBS. Po pobraniu całej tkanki serca umieść próbki serca pod mikroskopem i usuń płaty płuc z każdego serca.Ustaw pierwsze serce na jego grzbietowej stronie i trzymając serce u podstawy, użyj cienkich kleszczyków, aby zeskrobać lewy i prawy przedsionek w sąsiedniej tkance otaczającej SV od serca. Aby odizolować SV, ustaw serce grzbietową stroną do góry. Ostrożnie usunąć SV z serca i użyć sterylnej pipety do przenoszenia, aby umieścić wyizolowaną tkankę na nowej, sześciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowato zimny sterylny PBS na lodzie.Aby odizolować całe komory, usuń drogę odpływową i użyj nowej sterylnej pipety transferowej, aby umieścić komory w oddzielnej sześciocentymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty sterylny PBS na lodzie. Aby założyć hodowle SV i całe komory, najpierw pokryj błony jednej wkładki do hodowli PET o porach o ośmiu mikrometrach na dołek 24-dołkowej płytki hodowlanej, ze 100 mikrolitrami świeżo rozcieńczonej macierzy zewnątrzkomórkowej na kulturę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy matryca zastygnie, użyj pipety transferowej, aby przenieść jeden eksplant na każdą wkładkę i przesuń płytkę pod mikroskopem.Używając czystych kleszczy, umieść eksplantaty na środku każdej wkładki, aby upewnić się, że nie są przymocowane do ścian bocznych, i ostrożnie usuń wszelkie dodatkowe PBS. Następnie przenieś płytkę z pokrywką zamkniętą pod kapturem do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym i dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki do każdej wkładki i 200 mikrolitrów do studzienki poniżej każdej wkładki. Następnie dodaj 300 mikrolitrów PBS do niewykorzystanych studzienek i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na pięć dni.W przypadku leczenia VEGF-A w drugim dniu hodowli, należy usunąć pożywkę z obu komór każdej hodowli i dodać 100 mikrolitrów PBS do każdej wkładki i 200 mikrolitrów PBS do każdej studzienki. Po kilkukrotnym zawirowaniu płytki należy zastąpić PBS 300 mikrolitrami podłoża podstawowego uzupełnionego 1% płodową surowicą bydlęcą, aby rozpocząć hodowle, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Trzeciego dnia po głodzeniu dodać 300 mikrolitrów świeżej pożywki podstawowej plus surowicę do studzienek kontrolnych i pożywki podstawowej plus 50 nanogramów na mililitr VEGF-A do studzienek zabiegowych i zwrócić płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych.W szóstym dniu hodowli umyj komory PBS, jak pokazano, i utrwal kultury za pomocą 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w każdej studzience i 100 mikrolitrów utrwalacza w każdej wkładce. Po 20 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza z kołysaniem umyj kultury 300 mikrolitrami PBS przez 10 minut na pranie z kołysaniem w temperaturze pokojowej. Po ostatnim płukaniu dodaj 300 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego do studzienek i wkładek w celu przeprowadzenia hodowli przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z kołysaniem.Następnego ranka przemyj kultury 10 razy w niejonowym środku powierzchniowo czynnym w PBS z kołysaniem, zmieniając roztwór płuczący co 10 minut przed znakowaniem kultur 300 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z kołysaniem. Następnego dnia przemyj kultury 10 razy w świeżym PBS niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, jak pokazano. Po ostatnim umyciu za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie oderwij membranę od każdej wkładki i umieść membrany na pojedynczych szklanych szkiełkach mikroskopowych, eksplantowaną stroną do góry.Przykryj próbki podłożem montażowym uzupełnionym DAPI w szkiełku nakrywkowym i uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych przezroczystym lakierem do paznokci. Gdy lakier do paznokci wyschnie, zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopii konfokalnej. Gdy początkowe komórki SV rosną w komorze serca, przestają wytwarzać markery żylne, takie jak Coup-TF2.Po pięciu dniach hodowli komórki śródbłonka SV kiełkują i migrują na błonę. Podobnie jak w sercu embrionalnym, ekspresja Coup-TF2 jest zmniejszona, gdy naczynia migrują z dala od SV. Kultury stymulowane VEGF-A wykazują zwiększony wzrost kiełków angiogennych zarówno pod względem gęstości, jak i długości. Dalsze hodowle SV stymulowane przez VEGF-A wykazują prawie trzykrotny wzrost długości kiełków w porównaniu z kontrolami, co sugeruje, że kiełki śródbłonka z SV i wsierdzia reagują na VEGF-A.Ważne jest, aby nie stracić tkanki SV podczas wyciągania serca i płuc, usuwania przedsionków i czyszczenia sąsiedniej tkanki otaczającej SV.Live można przeprowadzić eksperymenty obrazowania w celu wizualizacji angiogenezy wieńcowej i uchwycenia szczegółów dynamiki komórkowej i molekularnej podczas procesu. Technika ta jest niezwykle przydatna do oceny potencjalnych mechanizmów molekularnych angiogenezy wieńcowej oraz jako system modelowy do badania angiogenezy w ogóle.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Ten film przedstawia zmodyfikowany test oparty na kulkach mikronośnika, obejmujący perycyty w celu zbadania kiełkowania śródbłonka we wczesnych stadiach angiogenezy. Test zapewnia eksperymentalny model in vitro w celu zrozumienia molekularnych mechanizmów angiogenezy i wpływu terapii antyangiogenetycznej.

Test kiełkowania kulek do oceny angiogenezy we wczesnym stadium: model oparty na kulkach in vitro do badania kiełkowania śródbłonka w obecności perycytów

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj model angiogenezy wieńcowej in vitro wykorzystujący eksplanty zatoki zatokowej i śródbłonka myszy. Ta metoda pozwala badać odpowiedź komórkową na VEGF-A oraz mechanizmy tworzenia naczyń krwionośnych serca.

Model angiogenezy wieńcowej in vitro

Przeglądaj więcej filmów