Name: Wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania ultrasonograficznego do wykrywania guzów płuc KRAS u myszy w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia monitorowanie progresji nowotworu i ocenę skuteczności leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. I. Verma za lentiwirusowy wektor Ca2Cre-shp53. Prace zostały wsparte środkami finansowymi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR MOP 137113) dla AEK.

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu McGill, a procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu McGill (protokół wykorzystania zwierząt nr 2009-5754).
1. Generowanie miana lentiwirusowego CA2Cre-shp53
UWAGA: Poniższy protokół jest taki sam jak opisany w pracy Xia i wsp.6, z niewielkimi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przygotowanie lentiwirusa (dla szalek 15 cm x 10 cm)
	<ol>
		<li>W dniu 1. wysiać zdrowe komórki HEK293T (7,5 x 106 komórek na szalkę 10 cm) w 10 mL pożywki Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% pen/strep. Hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do transfekcji fosforanem wapnia (mieszanina na 15 szalek). Przygotować probówkę A zawierającą 225 µg (15 µg/szalka) wektora lentiwirusowego (Ca2Cre-shp53), 75 µg (5 µg/szalka) plazmidu PsPAX2 (zawierającego geny HIV-1 gag i HIV-1 pol), 75 µg (5 µg/szalka) plazmidu pMD2.G (zawierającego gen VSV-G) do pakowania, końcowe stężenie 0,15 M CaCl2 i dopełnić probówkę wodą destylowaną H2O do objętości 3,75 mL. Przygotować probówkę B zawierającą 3,75 mL 2x soli buforowanej HEPES (HBS; 50 mM HEPES, pH 7,05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·2H2O oraz 12 mM D-dekstrozy).</li>
		<li>Probówkę A wymieszać na wirówce typu vortex i dodawać kroplami do probówki B przy ciągłym mieszaniu w vortexie. 
		UWAGA: Objętość całkowita wyniesie 7,5 mL.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20−30 min.</li>
		<li>Około 9 h po wysianiu komórek dodać kroplami 500 µL mieszaniny do transfekcji do pożywki komórkowej (7,5 mL/15 szalek: 0,5 mL na szalkę).</li>
		<li>Każdą szalkę delikatnie zakręcić w celu wymieszania, a następnie wszystkie szalki inkubować w 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>W dniu 2., 12−18 h po transfekcji, wymienić pożywkę na 10 mL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, bez antybiotyków (Tabela materiałów) na szalkę 10 cm. Umieścić szalki z powrotem w inkubatorze w 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>W dniu 3. zebrać pożywkę zawierającą lentiwirusy wykazujące ekspresję Ca2Cre-shp53 i przefiltrować przez filtry 0,45 μm. Uzupełnić pożywkę świeżą pożywką z obniżoną zawartością surowicy, bez antybiotyków. 
		UWAGA: Zebrana pożywka może być przechowywana w 4 °C nie dłużej niż przez 3 dni.</li>
		<li>W dniu 4. zebrać po raz drugi pożywkę zawierającą lentiwirusa i przefiltrować przez filtr 0,45 µm. Przechowywać w 4 °C (nie dłużej niż przez 3 dni).</li>
		<li>Połączyć nadnadstąpia wirusowe z kroków 1.1.8 i 1.1.9. Skoncentrować je za pomocą jednostek filtracyjnych do wirowania (Tabela materiałów), wirując przy 1 372 x g przez 30 min w 4 °C. Powtarzać proces do momentu, aż cała zebrana pożywka przejdzie przez kolumny. 
		UWAGA: Po każdym wirowaniu można zebrać 100−200 μL skoncentrowanego filtratu.</li>
		<li>Zebrać i wymieszać skoncentrowane filtraty w schłodzonej do temperatury lodowej probówce 15 mL. Dokładnie wymieszać skoncentrowane lentiwirusy, a następnie rozdzielić na aalikwoty (np. 100 μL/probówkę). Przechowywać w -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miareczkowanie lentiwirusa 
	UWAGA: W tym protokole do ilościowego oznaczenia miana wirusa wykorzystuje się unieśmiertelnione embrionalne fibroblasty mysie (MEF) wykazujące ekspresję allelu białka fluorescencyjnego GFP flankowanego sekwencjami loxP. Niemniej jednak każda linia komórkowa z allelem loxP-GFP powinna być odpowiednia do tego etapu.
	<ol>
		<li>Hodować komórki wykazujące ekspresję allelu GFP flankowanego sekwencjami loxP w DMEM z 10% FBS i 1% pen/strep w 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Wysiać 2 x 105 komórek do dwóch studzienek 50 mm płytki 6-dołkowej. 
		UWAGA: Komórki z jednej studzienki zostaną wykorzystane do infekcji lentiwirusowej, a komórki z drugiej posłużą jako kontrola negatywna.</li>
		<li>Następnego dnia, na 2 h przed infekcją lentiwirusową, uzupełnić pożywkę komórek, dodając 2 mL DMEM z 10% FBS i 1% pen/strep.</li>
		<li>Do studzienki przeznaczonej na infekcję lentiwirusową dodać 20 µL lentiwirusa CA2Cre-shp53 (objętość może być zmieniana w zależności od potrzeb).</li>
		<li>Po 3 dniach hodowli określić częstość występowania komórek GFP-dodatnich indukowanych przez Cre za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunku 1. Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), odczepić poprzez trypsynizację i zebrać komórki przez wirowanie przy 112 x g.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS. Na koniec zawiesić komórki w 100 µL PBS. Określić procent komórek GFP-dodatnich za pomocą analizatora komórek (Tabela materiałów).</li>
		<li>Obliczyć zakaźne/funkcjonalne miano lentiwirusa, korzystając z poniższego wzoru: 
		<img alt="Schemat obliczeń miana zakaźnego, zawiera równania F, G, V, DF do analizy wirusowej." src="/files/ftp_upload/60565/60565equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie F to częstość komórek GFP-dodatnich, obliczana poprzez odjęcie częstości komórek GFP-dodatnich po infekcji (Fi) od częstości komórek GFP-dodatnich (tło) przed infekcją (Fc), jak pokazano na Rysunku 1 (F = Fi-Fc), Cn to liczba wysianych komórek (2 x 105), V to objętość inokulum (mL), a DF to czynnik rozcieńczenia wirusa. 
		UWAGA: Stężenie zakaźne/funkcjonalne = ~2 x 106 TU/mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Intratrachealna intubacja lentiwirusów u myszy LSL-KRASG12D
UWAGA: Metoda intubacji dotchawiczej została zastosowana zgodnie z opisem w opublikowanym protokole autorstwa Vandivort i wsp.9. W niniejszym protokole wykorzystano myszy LSL-KRASG12D w tle genetycznym C57BL/6 w wieku 6–8 tygodni. Zastosowano własnoręcznie wykonaną deskę do procedur operacyjnych, zgodnie z opisem w pracy Vandivort i wsp.9. Deska jest ustawiona przed eksperymentatorem w dogodnym obszarze roboczym (około 1 m2).
<ol>
	<li>Przygotować spirometr, wyjmując tłok z strzykawki 1 mL i wprowadzając do niej 60 µL PBS.</li>
	<li>Do strzykawki przymocować końcówkę cewnika 22 G i odłożyć na bok.</li>
	<li>Zanestezjować myszy poprzez dosurową iniekcję koktajlu ketamina (50 mg/mL)/ksylazyna (5 mg/mL)/acepromazyna (1 mg/mL) w dawce 1 µL/g masy ciała myszy. Prawidłową sedację myszy potwierdzić poprzez niską częstotliwość oddechów (1 oddech co 2 s).</li>
	<li>Nabrać 20 µL lentiwirusa CA2Cre-shp53 do pipety i odłożyć na bok.</li>
	<li>Umieścić zsedowaną mysz na stole zabiegowym, mocując jej górne siekacze w niciach deski. 
	UWAGA: Grzbiet myszy powinien przylegać płasko do platformy.</li>
	<li>Przykleić taśmą tylną część klatki piersiowej do platformy, aby zapewnić stabilne ułożenie myszy podczas procedury.</li>
	<li>Ustawić oświetlacz z gęsimą szyją na intensywność między 80−100% i umieścić źródło światła 1−2 cm od powierzchni skóry.</li>
	<li>Z tyłu platformy, za pomocą sterylnej pęsety, wyciągnąć język z jamy ustnej myszy.</li>
	<li>Trzymając język, wprowadzić depresor do jamy ustnej myszy, a następnie zwolnić język.</li>
	<li>Ustawić oświetlacz nad głównymi oskrzelami, aby doświetlić tchawicę. 
	UWAGA: Tchawica może być widoczna dzięki ruchom oddechowym, co powoduje fluktuację światła.</li>
	<li>Gdy tchawica będzie wyraźnie widoczna, wprowadzić przygotowany spirometr (strzykawkę z PBS i cewnikiem) do światła tchawicy.</li>
	<li>Usunąć depresor i obserwować podnoszenie i opadanie poziomu PBS w strzykawce przy każdym oddechu. 
	UWAGA: Jest to wskaźnik prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę z PBS, pozostawiając cewnik w poprzedniej pozycji wewnątrz tchawicy.</li>
	<li>Wprowadzić 20 µL lentiwirusa CA2Cre-shp53 do wnętrza cewnika.</li>
	<li>Utrzymując cewnik w miejscu, wstrzyknąć do niego 300 µL powietrza za pomocą pustej strzykawki, aby zapewnić prawidłowe rozprowadzenie lentiwirusa w płucach.</li>
	<li>Pozostawić cewnik w miejscu i ponownie włożyć do niego spirometr. 
	UWAGA: Podnoszenie i opadanie pęcherzyka PBS potwierdzi powodzenie procedury.</li>
	<li>Usunąć cewnik i taśmę. Umieścić zwierzę w ciepłym i suchym miejscu do czasu wybudzenia.</li>
</ol>
3. Obrazowanie ultrasonograficzne guzów płuc u myszy
UWAGA: Obrazowanie ultradźwiękowe wykonano po 7 i 18 tygodniach intubacji lentiwirusowej przy użyciu systemu wymienionego w Tabeli materiałów; do analizy można jednak wykorzystać dowolny model.
<ol>
	<li>Na jeden dzień przed obrazowaniem usuń sierść z okolicy klatki piersiowej intubowanej myszy. 
	UWAGA: Podczas tego kroku mysz powinna być uspokojona poprzez umieszczenie jej w komorze indukcyjnej z 3% isofluranem i 2L/minute O2.</li>
	<li>W dniu obrazowania przygotuj stanowisko pracy zgodnie z Rysunkiem 2. Włącz pompę grzewczą do żelu ultradźwiękowego oraz monitor temperatury.</li>
	<li>Przygotuj inkubator z ustawioną temperaturą 33 °C, w którym myszy będą przebywać po obrazowaniu.</li>
	<li>Umieść silnik trójwymiarowy (3D) (Rysunek 2F) na zintegrowanym systemie szynowym.</li>
	<li>Upewnij się, że silnik 3D oraz system mocowania przetwornika są stabilnie zamocowane.</li>
	<li>Podłącz wybrany przetwornik (częstotliwość: 40 MHz; Rysunek 2E oraz Tabela materiałów) do pomiarów guza, prostopadle do silnika 3D.</li>
	<li>Rozpocznij nowe badanie w oprogramowaniu do USG.
	<ol>
		<li>Wybierz Study Browser, a następnie wybierz New na dole ekranu.</li>
		<li>Wybierz New Study; pojawi się nowe okno umożliwiające wpisanie Study Name oraz dodatkowych informacji o badaniu, takich jak data, nazwisko badacza itp.</li>
		<li>Wypełnij informacje w polu Series Name, np. ID zwierzęcia, szczep, waga, data urodzenia itp.</li>
		<li>Wybierz Done; program przełączy się w tryb B-mode.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść lampę grzewczą w dogodnej pozycji nad platformą dla zwierząt.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej (3,5% isofluranu). 
	UWAGA: Prawidłowe znieczulenie potwierdza się utratą przytomności myszy oraz spowolnieniem częstotliwości oddechów do około 1 oddechu na 2 sekundy.</li>
	<li>Gdy mysz zostanie uspokojona, zmień połączenie aparatu do znieczulania tak, aby strumień był skierowany w stronę platformy dla zwierząt, i zmniejsz stężenie isofluranu do 2,5%.</li>
	<li>Umieść mysz na platformie w pozycji brzusznej (decubitus ventral), z jamą gębową skierowaną w stronę rurki do znieczulenia.</li>
	<li>Nałóż lubrykant na oczy myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji grzbietowej (decubitus dorsal) i mocno przytwierdź jej kończyny do platformy dla zwierząt za pomocą taśmy.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę żelu ultradźwiękowego na klatkę piersiową myszy.</li>
	<li>Obniż głowicę akwizycyjną za pomocą pokrętła regulacji wysokości, aby dotknęła powierzchni klatki piersiowej myszy. Ustaw głowicę tak, aby serce myszy znajdowało się mniej więcej w centrum.</li>
	<li>Użyj mikro-pokręteł, aby uzyskać obrazy całej klatki piersiowej, od obu krawędzi, w orientacji poprzecznej, zbierając idealnie 500 klatek na mysz (liczba klatek może się różnić w zależności od preferencji operatora).</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania usuń żel z klatki piersiowej myszy i umieść zwierzę w ciepłym inkubatorze.</li>
</ol>
4. Analiza 2D obrazów ultradźwiękowych
<ol>
	<li>Po otwarciu pozyskanych klatek w oprogramowaniu do ultrasonografii, należy przeszukać klatki w poszukiwaniu guzów.</li>
	<li>W przypadku małych guzów początkowych należy okresowo zliczać liczbę linii B co 10 klatek przez pełną długość 500 pozyskanych klatek. 
	W związku z tym linie B są zliczane na łącznej liczbie 50 obrazów, przy czym każdy obraz jest oddzielony od kolejnego 10 klatkami. Linie B charakteryzują się postacią podłużnych, białych, prostych linii przechodzących w pełni przez ekran.</li>
	<li>W przypadku pomiarów 2D dużych guzów należy wybrać narzędzie liniowe i zmierzyć szerokość oraz długość obecnego guza.</li>
	<li>Aby obliczyć objętość guzów, należy zastosować następujący wzór: 
	<img src="/files/ftp_upload/60565/60565equ02.jpg" alt="Wzór na objętość, V=(L×W²)/2, schemat obliczania objętości bryły w milimetrach sześciennych." data-altupdatedat="1788250015000"> 
	gdzie L i W oznaczają odpowiednio długość i szerokość guza.</li>
</ol>

<ol><li>Eisenstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine%3A+Special+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine: Special treatment.</a> Nature. 513, 8(2014).</li>
<li>Karachaliou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+mutations+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">KRAS mutations in lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).</li>
<li>Jackson, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).</li>
<li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li>
<li>Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II+and+alveolar+fluid+reabsorption+during+hypercapnia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cell+proliferation+by+IKK2+depletion+in+a+mouse+lung-cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 532(2015).</li>
<li>Demi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+potential+quantitative+measure+of+the+state+of+the+lung+using+lung+ultrasound+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy.</a> Scientific Reports. 7, 12746(2017).</li>
<li>Mohanty, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Lung+Parenchyma+Using+Ultrasound+Multiple+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).</li>
<li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).</li>
<li>Saraogi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+ultrasound%3A+Present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+India%22%5BJournal%5D)">Lung ultrasound: Present and future.</a> Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).</li>
<li>Gargani, L., Volpicelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+do+it%3A+lung+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Ultrasound%22%5BJournal%5D)">How I do it: lung ultrasound.</a> Cardiovascular Ultrasound. 12, 25(2014).</li>
<li>Soldati, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Physical+Basis+of+Pulmonary+Sonographic+Interstitial+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975(2016).</li>
<li>Raes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ultrasound+and+Photoacoustic+Imaging+of+Orthotopic+Lung+Cancer+in+Mice%3A+New+Perspectives+for+Onco-Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology.</a> PLoS One. 11 (4), 15(2016).</li>
<li>Lakshman, M., Needles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+quantification+of+the+tumor+microenvironment+with+micro-ultrasound+and+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging.</a> Nature Methods. 12 (4), 372(2015).</li>
<li>Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+for+the+Pulmonary+Consultant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+Insights%3A+Circulatory+Respiratory+and+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ultrasound for the Pulmonary Consultant.</a> Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Demonstrujemy metodę, która może ocenić wzrost guza płuc w indukowanym przez Cre modelu myszy LSL-KRAS G12D za pomocą ultradźwięków. Metoda ta może być stosowana do oceny wpływu inhibitorów farmakologicznych na wzrost guza płuc. Może być również używany do porównywania wzrostu guza płuc między myszami o różnym pochodzeniu genetycznym. Korzystanie z tej techniki nie wymaga specjalistycznych umiejętności obliczeniowych, jednak ważne jest, aby być systematycznym w liczbie ramek używanych do analizy, aby umożliwić prawidłowe...

Jako główna przyczyna zgonów związanych z rakiem na całym świecie, rak płuc pozostaje oporny na leczenie, głównie z powodu braku odpowiednich modeli przedklinicznych, które mogłyby podsumować chorobę w laboratorium1. Około 25% przypadków raka płuc jest spowodowanych mutacjami w klasie onkogenu KRAS<sup="xref">2. Rak płuca spowodowany przez KRAS jest często związany ze złym rokowaniem i niską odpowiedzią na leczenie, co podkreśla znaczenie dalszych badań nad tą chorobą2.
Zoptymalizowaliśmy metodę, która pozwala na względną ocenę wzrostu guza płuc w czasie rzeczywistym u myszy immunologicznych wywołanych rakiem płuc KRAS. Używamy myszy Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D), w których onkogen KRAS G12D może być wyrażany przez wektory lentiwirusowe Cre 3,4. Wektory te są napędzane przez anhydrazę węglanową 2, dzięki czemu infekcja wirusowa może zachodzić specyficznie w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych5. Ponadto, aby przyspieszyć inicjację i progresję nowotworów płuc, konstrukt lentiwirusowy wyraża również shRNA P53 z promotora U6 / H1 (konstrukt lentiwirusowy w tym dokumencie będzie określany jako Ca2Cre-shp53)6. Biologiczne znaczenie tej metody polega na naturalnym przebiegu rozwoju guza płuc u myszy, w przeciwieństwie do ksenoprzeszczepów guzów nieortotopowych u myszy. Przeszkodą w zastosowaniu metody ortotopowej jest monitorowanie wzrostu guza płuca bez poświęcania myszy. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zoptymalizowaliśmy obrazowanie ultrasonograficzne, aby umożliwić analizę progresji guza płuc w trybie dwuwymiarowym (2D) w tym modelu myszym. Inicjowanie nowotworów po 7 tygodniach od infekcji jest odzwierciedlone jako linie B na obrazach ultrasonograficznych, które można policzyć, ale nie będą odzwierciedlać dokładnej liczby guzów obecnych w płucach. Linie B charakteryzują się podobnymi do lasera pionowymi białymi liniami wychodzącymi z linii opłucnej w miąższu płuca7,8. Duże guzy można uwidocznić po 18 tygodniach infekcji. Względna objętość tych guzów jest określana ilościowo za pomocą pomiarów 2D wykonanych za pomocą ultradźwięków.
Ta metoda jest optymalna dla badaczy badających wpływ leków farmakologicznych na wzrost guza płuc w mysim modelu LSL-KRAS G12D. Ponadto progresję guza płuc można porównać między myszami o różnych liniach genetycznych, aby zbadać znaczenie obecności lub braku niektórych genów/białek na rozwój objętości guza płuc.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Filtry strzykawkowe Acrodisc</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 4614</td><td></td></tr><tr><td>100-mm Płytka do hodowli komórek</td><td>CELLSTAR</td><td>664 160</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>CELLSTAR</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra - 15 filtrów odśrodkowych</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td></td><td></td>UFC910024</tr><tr><td>BD LSR-Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>649225B 3024</td><td></td></tr><tr><td>CA2Cre-shp53 wektor</td><td></td><td></td> lentiwirusowy <td>Od dr. I Verma Laboratory</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Multicell</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Multicell</td><td>80450</td><td></td></tr><tr><td>LSL-KRASG12D</td><td>mysz JAX Myszy</td><td>8179</td><td></td></tr><tr><td>MX550S; Centralna transmisja: 40 MHz</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>51070</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>gibco</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Multicell</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Addgene</td><td></td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>PsPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>VEVO-3100</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>51072-50</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Z ~1,6 milionami ofiar rocznie, rak płuc ogromnie przyczynia się do światowego obciążenia rakiem. Rak płuc jest częściowo napędzany przez zmiany genetyczne w onkogenach, takich jak onkogen KRAS, który stanowi ~25% przypadków raka płuc. Trudności w terapeutycznym ukierunkowaniu raka płuc na raka płuc wywołanego przez KRAS częściowo wynikają z posiadania słabych modeli, które mogą naśladować postęp choroby w laboratorium. Opisujemy metodę, która pozwala na względną kwantyfikację pierwotnych nowotworów płuc KRAS w indukowanym przez Cre modelu myszy LSL-KRAS G12D za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Metoda ta opiera się na akwizycji miąższu płuc w trybie jasności (B). Guzy, które początkowo powstają w tym modelu, są wizualizowane jako linie B i można je określić ilościowo, zliczając liczbę linii B obecnych na uzyskanych obrazach. Reprezentowałyby one względną liczbę guzów powstałych na powierzchni płuca myszy. Ponieważ powstałe guzy rozwijają się z czasem, są one postrzegane jako głębokie szczeliny w miąższu płuc. Ponieważ obwód utworzonego guza jest dobrze określony, obliczenie względnej objętości guza uzyskuje się poprzez pomiar długości i szerokości guza i zastosowanie ich we wzorze używanym do pomiarów suwmiarki guza. Obrazowanie ultrasonograficzne jest nieinwazyjną, szybką i przyjazną dla użytkownika techniką, która jest często stosowana do ilościowego oznaczania guza u myszy. Chociaż podczas uzyskiwania obrazów ultrasonograficznych mogą pojawiać się artefakty, wykazano, że ta technika obrazowania jest bardziej korzystna dla kwantyfikacji guza u myszy w porównaniu z innymi technikami obrazowania, takimi jak obrazowanie tomografii komputerowej (CT) i obrazowanie bioluminescencyjne (BLI). Naukowcy mogą badać nowe cele terapeutyczne za pomocą tej techniki, porównując inicjację i progresję guza płuc między różnymi grupami myszy.

Po uzyskaniu miana infekcyjnego lentiwirusa wynoszącego ~2 x 106 TU/mL (Rysunek 1), lentiwirus Ca2Cre-shp53 został wstrzyknięty dotrachealnie, gdy myszy LSL-KRAS G12D osiągnęły odpowiedni wiek (6−8 tygodni)9. Obrazowanie ultradźwiękowe wykonano po 7 tygodniach od zakażenia, po zainicjowaniu powstawania guzów (Rysunek 3B). Obrazowanie przeprowadzono w 7. tygodniu, aby uwzględnić różne rodzaje zmian prekursorowyc...

Ten protokół opisuje kroki podjęte w celu wywołania guzów płuc KRAS u myszy, jak również ilościowe określenie powstałych guzów za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Małe guzy są wizualizowane we wczesnych punktach czasowych jako linie B. W późniejszych punktach czasowych pomiary względnej objętości guza są osiągane za pomocą narzędzia pomiarowego w oprogramowaniu ultrasonograficznym.

Wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Znaczenie tego protokołu polega na wykrywalności w czasie rzeczywistym guzów płuc, które rozwinęły się spontanicznie w tym modelu mysim, od inicjacji guza do progresji guza. Zaletą tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna, wymaga jedynie podstawowych umiejętności i pozwala nam bezpośrednio monitorować działanie leku i leczenia, które nas interesuje. Progresję guza płuc można również ocenić na podstawie obecności lub braku interesującego genu.Korzystając z tej analizy, nowatorskie strategie leczenia mogą zostać potencjalnie rozszerzone na praktykę kliniczną. Siedem i 18 tygodni po intubacji lentiwirusowej włącz pompę grzewczą żelu do ultradźwięków i monitor temperatury, a następnie ustaw inkubator o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Umieść silnik 3D na zintegrowanym systemie szynowym i upewnij się, że silnik i system mocowania przetwornika są zamocowane na swoim miejscu.Podłącz przetwornik częstotliwości 40 Hz do silnika 3D i otwórz nowe badanie w oprogramowaniu ultrasonograficznym. W oknie nowego badania wprowadź nazwę badania. W oknie nazwy serii wprowadź nazwę serii i wszelkie inne istotne informacje.Po kliknięciu Gotowe wybierz typ przetwornika. Program przełączy się w tryb B.

detection-of-lung-tumor-progression-in-mice-by-ultrasound-imaging

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet w Brasílii, 2Zakład Podstawowych Procesów Psychologicznych, Instytut Psychologii, Uniwersytet w BrasíliiTen film przedstawia procedurę śledzenia progresji guza in vivo poprzez wstrzyknięcie...

Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza piersi w modelu mysim płci żeńskiej

Diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne okazało się skuteczne w diagnozowaniu różnych chorób układu oddechowego u ludzi i zwierząt. Demonstrujemy kompleksowy protokół ultrasonograficzny wykorzystywany przez laboratorium dr Zuo do analizy kinetyki membrany, szczególnie w modelach mysich. Jest to również nieinwazyjna technika badawcza, która może dostarczyć ilościowych informacji na temat funkcji mięśni oddechowych myszy.

Diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne funkcji membrany myszy

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Ten artykuł opisuje wykorzystanie ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości u genetycznie modyfikowanych myszy z rakiem trzustki. Podstawowym celem jest dostarczenie szczegółowej instrukcji wykrywania i oceny endogennych nowotworów trzustki.

Wykorzystanie ultradźwięków o wysokiej rozdzielczości do monitorowania początku i wzrostu guza w genetycznie modyfikowanych modelach raka trzustki

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Obecny protokół opisuje ultrasonografię wysokiej częstotliwości do wizualizacji całej tarczycy myszy i monitorowania wzrostu anaplastycznego raka tarczycy.

Ultrasonografia o wysokiej rozdzielczości do analizy ortotopowych guzów ATC w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy

Ten protokół opisuje metodę monitorowania postępu zmian morfologicznych w czasie w macicy w indukowalnym mysim modelu raka endometrium za pomocą obrazowania ultrasonograficznego z korelacją zmian ogólnych i histologicznych.

Nieinwazyjna ocena ultrasonograficzna progresji raka endometrium w kierowanej przez Pax8 delecji supresorów guza Arid1a i Pten u myszy

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania ultrasonograficznego do wykrywania guzów płuc KRAS u myszy w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia monitorowanie progresji nowotworu i ocenę skuteczności leczenia.

Wykrywanie progresji guza płuc u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego

Przeglądaj więcej filmów