Name: Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Naucz się przygotowywać próbki w mikrowadze kwarcowej QCM do pomiarów adsorpcji białek i mechaniki polimerów. Technika ta umożliwia dokładne badanie właściwości materiałów miękkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NSF (DMR-1710491, OISE-1743748). J.R. i E.S. potwierdzają wsparcie ze strony NSF (DMR-1751308).

Adsorpcja kolagenu metodą QCM-D
1. Przygotowanie próbki i wstępne czyszczenie czujnika
<ol>
	<li>Przygotować 20 mL 0,1 M buforu octanowego, dostosowując pH za pomocą HCl i NaOH w razie potrzeby, aby uzyskać pH = 5,6.</li>
	<li>W warunkach sterylnych dodać do 20 mL buforu octanowego roztwór kolagenu z ogona szczura do końcowego stężenia 10 µg/mL.</li>
	<li>Oczyścić pozłacany czujnik kwarcowy w celu usunięcia materiałów organicznych i biologicznych25,26.
	<ol>
		<li>Umieścić czujnik stroną aktywną do góry w komorze UV/Ozon i poddać powierzchnię działaniu przez około 10 min.</li>
		<li>Podgrzać mieszaninę wody dejonizowanej (dH2O), amoniaku (25%) i nadtlenku wodoru (30%) w proporcji 5:1:1 do 75 °C. Umieścić czujnik w roztworze na 5 min.</li>
		<li>Przepłukać czujnik dH2O i osuszyć strumieniem azotu.</li>
		<li>Umieścić czujnik stroną aktywną do góry w komorze UV/Ozon i poddać powierzchnię działaniu przez 10 min. 
		UWAGA: Procedura czyszczenia powinna zostać przeprowadzona bezpośrednio przed pomiarem, aby zminimalizować zanieczyszczenia środowiskowe na powierzchni czujnika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie danych pomiarowych QCM-D
<ol>
	<li>Włącz cały niezbędny sprzęt do przeprowadzenia pomiaru, w tym pompę, jednostkę elektroniczną oraz oprogramowanie komputerowe.</li>
	<li>Zdejmij moduł przepływowy z platformy komory i odkręć duże śruby motylkowe, aby otworzyć moduł.</li>
	<li>Jeśli czujnik pozostał poza urządzeniem po wstępnym czyszczeniu (kroki 1.3.1-1.3.4), przepłucz go wodą dejonizowaną (dH2O) i osusz strumieniem azotu, aby upewnić się, że na powierzchni nie ma zanieczyszczeń.</li>
	<li>Zamontuj czujnik w module przepływowym na odsłoniętym pierścieniu O-ring, uprzednio osuszając ten obszar strumieniem azotu i sprawdzając, czy pierścień O-ring przylega płasko. Czujnik należy umieścić stroną aktywnej powierzchni do dołu, a elektrodę w kształcie kotwicy skierować w stronę znacznika w module przepływowym.</li>
	<li>Dokręć śruby motylkowe, aby uszczelnić moduł przepływowy, a następnie umieść go z powrotem na platformie komory. Podłącz niezbędne przewody PTFE pompy do modułu przepływowego i zewnętrznej pompy.</li>
	<li>Za pomocą odpowiedniego oprogramowania komputerowego ustaw temperaturę modułu przepływowego na 37 °C. Monitoruj zmianę temperatury przez 10-15 min, aby upewnić się, że ustabilizowała się ona na żądanej wartości.</li>
	<li>Wyznacz początkowe częstotliwości rezonansowe czujnika. Jeśli oprogramowanie nie wykryje niektórych częstotliwości rezonansowych, sprawdź, czy moduł przepływowy jest prawidłowo umieszczony na platformie komory lub zamontuj ponownie czujnik w module przepływowym, aby upewnić się, że jest on wycentrowany i zapewnia prawidłowy kontakt elektryczny.</li>
	<li>Umieść wlotowy przewód pompy w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Uruchom przepływ z zewnętrznej pompy z prędkością 25 µL/min i wizualnie sprawdź przewody, aby upewnić się, że ciecz przepływa przez rurkę. 
	UWAGA: Przepływ cieczy może być łatwiejszy do zaobserwowania po chwilowym zwiększeniu szybkości przepływu do 10 µL/min lub więcej. Jeśli ciecz nie przemieszcza się przez rurkę, najprawdopodobniej dwie części modułu przepływowego nie tworzą szczelnego połączenia. Spróbuj dokręcić śruby motylkowe, uszczelnić złącza przewodów do wlotu i wylotu lub zamontować ponownie czujnik, aby upewnić się, że pierścień O-ring jest płaski i wycentrowany.</li>
	<li>Pozostaw ciecz 1x PBS w przepływie przez moduł przez co najmniej 15 min w celu prawidłowej ekwilibracji.</li>
	<li>Uruchom pomiar w oprogramowaniu komputerowym, aby rozpocząć akwizycję danych. Monitoruj wartości częstotliwości i dyssypacji przez co najmniej 5 min, aby zapewnić stabilną linię bazową.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód do roztworu buforu kolagenowo-acetatowego i wznowij przepływ cieczy. Zanotuj czas tego zdarzenia do późniejszej analizy.</li>
	<li>Pozostaw nowe wartości częstotliwości i dyssypacji do czasu ustabilizowania się. W tym przypadku oczekuje się, że stabilizacja ta nastąpi po 8-12 h.</li>
	<li>Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód z powrotem do roztworu 1x PBS i wznowij przepływ cieczy. Zanotuj czas tego zdarzenia do późniejszej analizy.</li>
	<li>Pozostaw nowe wartości częstotliwości i dyssypacji do czasu ustabilizowania się. W tym przypadku stabilizacja następuje po 30 min. 
	UWAGA: Kroki 2.13 i 2.14 można powtarzać dla każdego nowego okresu przepływu cieczy w bardziej rygorystycznych eksperymentach z większą liczbą etapów.</li>
	<li>Zakończ akwizycję danych pomiarowych i zapisz dane.</li>
	<li>Oczyść i zdemontuj sprzęt QCM.
	<ol>
		<li>Zwiększ szybkość przepływu cieczy z zewnętrznej pompy do 50 µL/min lub więcej i umieść wlotowy przewód w 2% roztworze czyszczącym Hellmanex na co najmniej 20 min. 
		UWAGA: W przypadku innych eksperymentów, jeśli planowana jest dalsza analiza czujnika, należy go wyjąć przed krokiem 2.16.1 i umieścić w module inny czujnik do czyszczenia.</li>
		<li>Zatrzymaj pompę, przenieś wlotowy przewód do dH2O i wznowij przepływ cieczy, aby dalej płukać system przez co najmniej 20 min.</li>
		<li>Zatrzymaj przepływ cieczy i wyjmij czujnik z modułu przepływowego. Osusz czujnik oraz wnętrze modułu przepływowego strumieniem azotu. Wyłącz oprogramowanie komputerowe, jednostkę elektroniczną oraz pompę perystaltyczną. 
		UWAGA: Czujniki powlekane złotem można odpowiednio oczyścić, zgodnie ze szczegółami w krokach 1.3.1-1.3.4, i ponownie wykorzystać do kilku pomiarów. Wskazówkami sugerującymi, że czujnik nie nadaje się już do wiarygodnych pomiarów, mogą być m.in. duża zmienność początkowych częstotliwości rezonansowych oraz znaczne dryfowanie pomiarów linii bazowej podczas przepływu buforu. Dane można otwierać i analizować w preferowanym oprogramowaniu, w tym w programach dostarczanych przez firmy specjalizujące się w sprzęcie QCM-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Pęcznienie kompleksu polielektrolitowego w technice QCM
3. Przygotowanie próbek
UWAGA: Ten eksperyment został przeprowadzony przy użyciu programu MATLAB opracowanego w grupie badawczej Shull do zbierania i analizy danych.
<ol>
	<li>Najpierw umieść goły czujnik z kryształu kwarcu w uchwycie na próbkę podłączonym do wektorowego analizatora sieci i komputera. Włącz analizator, aby przyłożyć do czujnika napięcie oscylujące, a następnie zarejestruj referencyjne widmo przewodności czujnika w powietrzu.</li>
	<li>Zanurz uchwyt na próbkę w bezkrawędziowym zlewce o pojemności 10 mL wypełnionej wodą destylowaną i zarejestruj referencyjne widmo przewodności gołego czujnika w wodzie.</li>
	<li>Przygotuj 0,5 M roztwór bromku potasu (KBr).
	<ol>
		<li>Rozpuść 1,79 g KBr w 30 mL wody destylowanej. Wstrząsaj do czasu całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Włóż mały wafel krzemowy do roztworu KBr pod kątem, aby stworzyć podpórkę dla czujnika kwarcowego podczas etapu wygrzewania, co zapobiegnie odrywaniu się filmu od czujnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj czujnik do nanoszenia metodą spin-coatingu.
	<ol>
		<li>Ustaw parametry spin-coatingu na 10 0 rpm, przyspieszenie 8 00 i czas 5 s.</li>
		<li>Umieść czujnik w urządzeniu do spin-coatingu i włącz próżnię.</li>
		<li>Pokryj powierzchnię czujnika etanolem i uruchom urządzenie, aby oczyścić powierzchnię czujnika.</li>
		<li>Nanieś PEC (PSS:PDADMA przygotowany w ten sam sposób, jak szczegółowo opisano w Sadman et al.2) na powierzchnię czujnika.
		<ol>
			<li>Jeśli kompleks jest dwufazowy (faza bogata w polimer i faza uboga w polimer), powoli wprowadź pipetę do roztworu. Odpowietrz pipetę, wypuszczając pęcherzyki powietrza, przesuwając ją jednocześnie do gęstszej fazy bogatej w polimer.</li>
			<li>Po wypuszczeniu kilku pęcherzyków w fazie bogatej w polimer, pobierz do pipety 0,5-0,75 mL roztworu bogatego w polimer. Utrzymując nacisk na gruszkę pipety, aby zapobiec przedostaniu się fazy ubogiej w polimer do wnętrza, wyjmij pipetę z roztworu.</li>
			<li>Wytrzyj zewnętrzną część pipety ręcznikiem Kimwipe. Dodawaj roztwór kroplami na powierzchnię czujnika kwarcowego, aż zostanie ona całkowicie pokryta. Upewnij się, że w roztworze na powierzchni czujnika nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj spin-coating próbki PEC i natychmiast zanurz czujnik w 0,5 M roztworze KBr, aby zapobiec krystalizacji soli na filmie. 
	UWAGA: Ten krok jest czasami trudny do skoordynowania. Dla uzyskania najlepszych rezultatów zwolnij czujnik tuż nad roztworem KBr.</li>
	<li>Pozostaw film do wygrzewania przez co najmniej 12 h. 
	UWAGA: Dla ułatwienia przeprowadzenia eksperymentu, wykonaj krok 4 wieczorem i pozostaw film do wygrzewania przez całą noc.</li>
</ol>
4. Pomiar filmu w powietrzu i wodzie
<ol>
	<li>Przenieś czujnik do zlewki wypełnionej wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar KBr z warstwy oraz z tylnej strony czujnika. Pozostaw czujnik w roztworze na 30-60 min.</li>
	<li>Wykonaj pomiar warstwy w powietrzu. Odnieś wynik do gołego czujnika w powietrzu. Pozwól danym z pomiaru warstwy ustabilizować się.</li>
	<li>Włóż wysuszony siarczan wapnia do zlewki bez dzierswia o pojemności 10 mL i zmierz grubość całkowicie suchej warstwy. Usuń siarczan wapnia ze zlewki i wypłucz ją wodą destylowaną.</li>
	<li>Napełnij zlewkę bez dzierswia o pojemności 10 mL 30 mL wody destylowanej. Włóż mieszadło magnetyczne, aby zapewnić cyrkulację wody wokół warstwy. Mierz warstwę w wodzie przez około 30-45 min lub do momentu ustabilizowania się danych. Odnieś wynik do gołego czujnika w wodzie.</li>
	<li>Przygotuj 15 mL roztworu 3 M KBr w wodzie destylowanej. Odmierz 5,35 g KBr do cylindra miarowego i dopełnij wodą destylowaną do 15 mL. Mieszaj okrężnymi ruchami do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Dodawaj roztwór KBr do zlewki z wodą destylowaną w przyrostach 0,1 M. Tabela 1 przedstawia przyrosty 0,1 M w mL roztworu 3 M KBr. Skieruj warstwę w stronę przeciwną do miejsca, w którym roztwór KBr jest dodawany do wody, aby zapobiec rozpuszczaniu się warstwy. Upewnij się, że układ osiągnął stan równowagi przed kolejnym dodaniem roztworu KBr.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich danych wyjmij warstwę z uchwytu i umieść ją w zlewce z wodą destylowaną. Pozostaw do wypłukania soli z warstwy (30-60 min), a następnie wysusz warstwę na powietrzu.</li>
	<li>Aby usunąć warstwę PEC z czujnika, dodaj KBr do zlewki i delikatnie zamieszaj roztwór. Pozostaw na 5-10 min. Powtórz ten proces 2-3 razy, a następnie wypłucz czujnik wodą destylowaną. 
	UWAGA: Czujnik można wyczyścić i użyć ponownie, jeśli jego odpowiedź jest nadal prawidłowa. Można to sprawdzić, mierząc małą absolutną szerokość pasma dla interesujących harmonicznych (&lt;10 Hz).</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz interfejs graficzny (GUI) programu MATLAB do analizy danych QCM-D stworzony przez Sadmana (<a href="https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI" target="_blank">https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI</a>)27Otwórz plik danych powietrznych filmu, wybierając opcję „Load QCM”. 
	UWAGA: Grupa Shull opracowała podobny interfejs graficzny (GUI) w języku Python do zbierania i analizy danych dla QCM (<a href="https://github.com/shullgroup/rheoQCM" target="_blank">https://github.com/shullgroup/rheoQCM</a>). Część kodu analitycznego służącego zarówno do analizy danych, jak i do generowania rycin w niniejszej pracy została udostępniona w informacjach uzupełniających.</li>
	<li>Wybierz żądane obliczenie (albo 3,5,3 lub 3,5,5), gamma, i film w powietrzu ikony. Kliknij Wykres QCM.</li>
	<li>Wyznacz grubość suchej warstwy, korzystając z najbardziej zrównoważonego punktu pomiarowego (zazwyczaj ostatniego punktu danych) z eksperymentu. Zapisz tę wartość.</li>
	<li>Otwórz plik danych „film in water”. Wybierz te same parametry co w kroku 5.2, z wyjątkiem wybrania opcji „film in water” zamiast „film in air”.</li>
	<li>Po każdym etapie równoważenia w eksperymencie pęcznienia należy wyznaczyć grubość filmu, zespolony moduł ścinania oraz wiskoelastyczny kąt przesunięcia fazowego. Wartości te należy zapisać wraz z siłą jonową (w zakresie od 0 do 1 M, w przyrostach 0,1 M).</li>
	<li>Wyznacz procent pęcznienia jako 
	<img alt="wzór na stopień pęcznienia, schemat, przedstawia obliczenia pęcznienia polimeru z wykorzystaniem porównania gęstości" src="/files/ftp_upload/60584/60584eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"> (3) 
	gdzie dp czy grubość filmu z roztworu i dpsuchy jest grubością suchej warstwy.</li>
</ol>

<ol><li>Marx, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance%3A+A+useful+tool+for+studying+thin+polymer+films+and+complex+biomolecular+systems+at+the+solution+-+Surface+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution - Surface interface.</a> Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).</li>
<li>Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+QCM+and+TM-AFM+investigations+of+the+early+stages+of+degradation+of+silver+and+copper+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces.</a> Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).</li>
<li>Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Inhibition+of+Radical+Polymerizations+Investigated+with+the+Rheometric+Quartz+Crystal+Microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance.</a> Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).</li>
<li>Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+alkyd+cure+kinetics+with+the+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance.</a> Polymer. 103, 387-396 (2016).</li>
<li>Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quartz+crystal+rheometry+in+the+megahertz+frequency+regime%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science%2C+Part+B%3A+Polymer+Physics%22%5BJournal%5D)">Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime.</a> Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).</li>
<li>Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Frequency+Mechanical+Behavior+of+Pure+Polymer-Grafted+Nanoparticle+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs.</a> ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).</li>
<li>Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+dissipation+kinetics+for+protein+and+antibody-antigen+adsorption+under+shear+oscillation+on+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance.</a> Langmuir. 14, 729-734 (1998).</li>
<li>Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+quartz+crystal+protein+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based quartz crystal protein biosensor.</a> Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).</li>
<li>Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Adsorption+of+Plasma+Proteins+Using+a+Quartz+Crystal+Microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).</li>
<li>Keller, C. A., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+specific+kinetics+of+lipid+vesicle+adsorption+measured+with+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance.</a> Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).</li>
<li>Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+quartz+crystal+microbalance+with+dissipation+monitoring+to+evaluate+the+size+of+nanoparticles+deposited+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces.</a> ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).</li>
<li>Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+study+of+protein+adsorption+on+chitosan%2C+chitosan%2Fpoly%28vinyl+pyrrolidone%29+blends+and+chitosan-graft-poly%28vinyl+pyrrolidone%29+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioactive+and+Compatible+Polymers%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces.</a> Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).</li>
<li>Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+fibrinogen+adsorbed+to+the+surface+of+biomaterials+used+in+blood-contacting+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices.</a> Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).</li>
<li>Johannsmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic%2C+mechanical%2C+and+dielectric+measurements+on+complex+samples+with+the+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).</li>
<li>Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+rheological+characterization+of+homogeneous+polymer+films+with+the+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance.</a> Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).</li>
<li>Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+electrochemically+deposited+protein%2Fmetal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes.</a> Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).</li>
<li>Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+rheometry%3A+A+quantitative+technique+for+studying+curing+and+aging+in+artists%27+paints%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists' paints.</a> Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).</li>
<li>Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rheometry+of+Thin+Soft+Materials+Using+the+Quartz+Crystal+Microbalance+with+Dissipation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation.</a> Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).</li>
<li>Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+peptide+immobilization+techniques+on+a+qcm+surface+related+to+acetaldehyde+responses+in+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase.</a> Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).</li>
<li>Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Multicomponent+Protein+Films+by+Means+of+Electrostatic+Layer-by-Layer+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).</li>
<li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verwendung+von+Schwingquarzen+zur+W%C3%A4gung+d%C3%BCnner+Schichten+und+zur+Mikrow%C3%A4gung%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physik%22%5BJournal%5D)">Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung.</a> Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).</li>
<li>Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Hydrophobicity+on+Polyelectrolyte+Complexation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation.</a> Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).</li>
<li>Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+torsional+resonators+to+monitor+electroactive+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms.</a> Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).</li>
<li>Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRingberg%2C+J+%22Biolin+Scientific%22">Biolin Scientific</a>. , Stockholm, Sweden. (2017).</li>
<li>Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRingberg%2C+J+%22Biolin+Scientific%22">Biolin Scientific</a>. , Stockholm, Sweden. (2015).</li>
<li>Kern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Evolution+of+Silicon+Wafer+Cleaning+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology.</a> Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887(1990).</li>
<li>Sadman, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSadman%2C+K+%22sadmankazi%2FQCM-D-Analysis-GUI%3A+QCMD-Analyze%22">sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze</a>. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki adsorpcji kolagenu obejmują zakresy reżimu Sauerbreya oraz reżimu wiskoelastycznego. Po wykreśleniu przesunięć częstotliwości znormalizowanych względem odpowiedniego numeru harmonicznej obserwujemy, że granica Sauerbreya jest zachowana przez około pierwsze 2 h pomiaru. Jednak wraz ze wzrostem masy przylegającej do sensora, znormalizowane przesunięcia częstotliwości dla trzeciej i piątej harmonicznej zaczynają od siebie odbiegać (t &gt; 2 h), co wskazuje na możliwość określenia właściwości wiskoelastycznyc...

Mikrowaga kwarcowa (QCM) wykorzystuje efekt piezoelektryczny kryształu kwarcowego do monitorowania jego częstotliwości rezonansowej, która zależy od masy przyczepionej do powierzchni. Technika ta polega na porównaniu częstotliwości rezonansowej i szerokości pasma czujnika z kryształu kwarcowego o cięciu AT (zazwyczaj w zakresie 5 MHz)1 w powietrzu lub cieczy z częstotliwością i szerokością pasma czujnika po osadzeniu filmu. Wykorzystanie QCM do badania właściwości cienkich warstw i powierzchni styku niesie ze sobą szereg zalet, w tym wysoką czułość na masę oraz potencjalnie na zmiany właściwości wiskoelastycznych (w zależności od jednorodności i grubości próbki), możliwość prowadzenia badań in situ2 oraz zdolność do badania znacznie krótszych skal czasowych reologicznych niż w przypadku tradycyjnej reologii ścinania lub dynamicznej analizy mechanicznej (DMA). Analiza krótkiej skali czasowej reologicznej pozwala obserwować, jak odpowiedź w tej skali zmienia się zarówno w ekstremalnie krótkim (ms)3, jak i długim (lata) czasie4. Możliwość ta jest korzystna przy badaniu różnorodnych procesów kinetycznych i stanowi również przydatne rozszerzenie tradycyjnych technik reometrycznych5,6.
Wysoka czułość QCM doprowadziła również do jego szerokiego zastosowania w aplikacjach biologicznych służących do badania fundamentalnych oddziaływań niezwykle małych biomolekuł. Niepowlekana lub funkcjonalizowana powierzchnia czujnika może być wykorzystana do badania adsorpcji białek; ponadto, dzięki zmianom masy, można badać biosensing w kontekście złożonych zdarzeń wiązania między enzymami, przeciwciałami a aptamerami7,8,9. Na przykład technika ta została użyta do zrozumienia procesu przekształcania pęcherzyków w płaską dwuwarstwę lipidową jako dwufazowego procesu adsorpcji pęcherzyków zawierających ciecz do sztywnej struktury poprzez obserwację korelujących zmian częstotliwości i lepkosprężystości10. W ostatnich latach QCM stał się ponadto solidną platformą do monitorowania dostarczania leków za pomocą pęcherzyków lub nanocząstek1. Na styku inżynierii materiałowej oraz biologii molekularnej i komórkowej możemy wykorzystać QCM do wyjaśnienia kluczowych oddziaływań między materiałami a komponentami bioaktywnymi, takimi jak białka, kwasy nukleinowe, liposomy i komórki. Przykładowo, adsorpcja białek do biomateriału pośredniczy w późniejszych odpowiedziach komórkowych, takich jak stan zapalny, i jest często stosowana jako pozytywny wskaźnik biokompatybilności, podczas gdy w innych przypadkach przyleganie białek pozakomórkowych do powłok mających kontakt z krwią może indukować niebezpieczne krzepnięcie w naczyniach12,13. QCM może zatem służyć jako narzędzie do wyboru kandydatów optymalnych dla różnych potrzeb.
Dwie powszechne metody przeprowadzania eksperymentów QCM pozwalają na gromadzenie analogicznych danych: pierwsza metoda rejestruje przesunięcie częstotliwości oraz połowę szerokości pasma (Γ) piku przewodzenia. Druga metoda, QCM z pomiarem dyssypacji (QCM-D), rejestruje przesunięcie częstotliwości oraz czynnik dyssypacji, który jest bezpośrednio proporcjonalny do Γ zgodnie z równaniem 1,14
<img alt="Wzór matematyczny \( D_n = \frac{2\Gamma_n}{f_n} \) dla analizy dynamicznej, przedstawienie równania." src="/files/ftp_upload/60584/60584eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1)
gdzie D to czynnik strat, a ƒ to częstotliwość. Zarówno D, jak i Γ są powiązane z efektem tłumienia, jaki film wywiera na sensor, co daje wskazówkę co do sztywności filmu. Indeks n oznacza harmoniczną lub alikwot częstotliwości, która jest nieparzystą częstotliwością rezonansową sensora kwarcowego (n = 1, 3, 5, 7…). Dalszą dyskusję na temat modeli wykorzystujących wiele harmonicznych do wyznaczania masy i właściwości wiskoelastycznych filmu można znaleźć w przeglądzie autorstwa Johannsmanna14 oraz w poprzednich pracach grupy Shulla15,16,17,18.
Kluczową kwestią przy przygotowywaniu próbek do QCM jest sposób naniesienia cienkiej warstwy na powierzchnię sensora. Do najczęstszych metod należą spin coating, dip coating, drop coating lub adsorpcja filmu na powierzchni sensora w trakcie eksperymentu19,20. Wyróżnia się cztery obszary dla próbek QCM: granicę Sauerbreya, reżim wiskoelastyczny, reżim objętościowy (bulk) oraz reżim nadkrytycznego tłumienia (overdamped). W przypadku warstw dostatecznie cienkich obowiązuje granica Sauerbreya, w której przesunięcie częstotliwości (Δƒ) pozwala wyznaczyć gęstość powierzchniową masy filmu. W obrębie granicy Sauerbreya przesunięcie częstotliwości skaluje się liniowo z harmoniczną rezonansową, n, a zmiany współczynnika tłumienia (D lub Γ) są zazwyczaj niewielkie. W tym reżimie dostępne informacje są niewystarczające do jednoznacznego określenia właściwości reologicznych warstwy bez przyjęcia dodatkowych założeń. Dane z tego zakresu są wykorzystywane do obliczenia gęstości powierzchniowej masy (lub grubości, jeśli gęstość jest znana a priori) filmu. W reżimie objętościowym, gdy medium w kontakcie z kryształem jest dostatecznie grube, ewanescentna fala ścinania propaguje się w medium przed całkowitym wytłumieniem. W tym przypadku nie można uzyskać informacji o masie za pomocą Δƒ. Jednak w tym obszarze właściwości wiskoelastyczne są wiarygodnie wyznaczane przy użyciu kombinacji Δƒ i ΔΓ 15,18. W reżimie objętościowym, jeśli medium jest zbyt sztywne, film wytłumi rezonans sensora, co uniemożliwi zebranie jakichkolwiek wiarygodnych danych z QCM. Reżim wiskoelastyczny jest obszarem pośrednim, w którym film jest na tyle cienki, aby fala ścinania mogła w pełni przez niego propagować, a wartości współczynnika tłumienia były wiarygodne. Współczynnik tłumienia oraz Δƒ mogą być wówczas wykorzystane do określenia właściwości wiskoelastycznych filmu, a także jego masy. Tutaj właściwości wiskoelastyczne są opisane przez produkt gęstości i modułu kompleksowego ścinania |G*|p oraz kąt fazowy określony jako Φ = arctan(G" / G'). Gdy filmy są przygotowane w granicy Sauerbreya, masę na jednostkę powierzchni można obliczyć bezpośrednio na podstawie poniższego równania Sauerbreya21,
<img alt="Wzór matematyczny na zmianę częstotliwości; stosowany w detekcji masy i analizie rezonansowej." src="/files/ftp_upload/60584/60584eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> (2)
gdzie Δƒn oznacza zmianę częstotliwości rezonansowej, n to interesująca nas harmoniczna, ƒ1 jest częstotliwością rezonansową czujnika, Δm / A to masa filmu na jednostkę powierzchni, a Zq to impedancja akustyczna kwarcu, która dla kwarcu ciętego w kierunku AT wynosi Zq = 8.84 x 106 kg / m2s. Reżim wiskoelastyczny jest najodpowiedniejszy do badania filmów polimerowych, natomiast granica objętościowa jest użyteczna przy badaniu lepkich roztworów polimerów2 lub białek16. Różne reżimy zależą od właściwości badanego materiału, przy czym optymalna grubość dla pełnej charakterystyki wiskoelastycznej i masowej zazwyczaj rośnie wraz ze sztywnością filmu. Rysunek 1 opisuje cztery obszary w odniesieniu do gęstości powierzchniowej filmu, zespolonego modułu ścinania oraz kąta fazowego, przyjmując określoną zależność między kątem fazowym a sztywnością filmu, która okazała się istotna dla materiałów tego typu. Wiele filmów o znaczeniu praktycznym jest zbyt grubych do badania właściwości wiskoelastycznych za pomocą QCM, jak np. niektóre biofilmy, których grubość rzędu od dziesięciu do setek mikrometrów23. Tak grube filmy są zazwyczaj nieodpowiednie do badania za pomocą QCM, lecz mogą być mierzone przy użyciu rezonatorów o znacznie niższej częstotliwości (takich jak rezonatory skrętne)23, co pozwala fali ścinającej propagować się głębiej w głąb filmu.
Aby określić, który reżim jest właściwy dla danej próbki QCM, ważne jest zrozumienie parametru d / λn, który stanowi stosunek grubości filmu (d) do długości fali ścinającej mechanicznych oscylacji czujnika z kryształu kwarcu (λn)15,16,18. Idealny reżim wiskoelastyczny to d / λn = 0,05 - 0,218, gdzie wartości poniżej 0,05 mieszczą się w granicy Sauerbreya, a wartości powyżej 0,2 zbliżają się do reżimu objętościowego. Bardziej szczegółowy opis parametru d / λn przedstawiono w innym miejscu15,18, jednak jest to parametr ilościowy wyznaczający granicę Sauerbreya oraz granicę wiskoelastyczną. Programy analityczne wykorzystane poniżej dostarczają ten parametr bezpośrednio.
Istnieją pewne dodatkowe ograniczenia w analizie cienkich warstw za pomocą QCM. Obliczenia Sauerbreya i obliczenia wiskoelastyczne zakładają, że warstwa jest jednorodna zarówno w całej swojej grubości, jak i lateralnie w obrębie powierzchni elektrody QCM. Chociaż to założenie utrudnia badanie warstw zawierających pustki lub wypełniacze, przeprowadzono niektóre badania QCM nad warstwami składającymi się z przeszczepionych nanocząstek6. Jeśli heterogeniczności są małe w porównaniu do całkowitej grubości warstwy, nadal można uzyskać wiarygodne właściwości wiskoelastyczne systemu kompozytowego. W przypadku systemów bardziej heterogenicznych wartości uzyskane z analizy wiskoelastycznej należy zawsze traktować z dużą ostrożnością. Idealnie byłoby, gdyby wyniki uzyskane z systemów o nieznanej heterogeniczności zostały zwalidowane w odniesieniu do systemów, o których wiadomo, że są jednorodne. Takie podejście zastosowaliśmy w przykładzie systemu opisanego w niniejszej pracy.
Ważnym punktem, który ilustrujemy w niniejszej pracy, jest dokładna odpowiedniość między pomiarami QCM wykonanymi w dziedzinie częstotliwości (gdzie raportowane jest Γ) a eksperymentami w dziedzinie czasu (gdzie raportowane jest D). Opisano wyniki z dwóch różnych eksperymentów QCM, jednego w dziedzinie czasu i jednego w dziedzinie częstotliwości, z których każdy obejmuje inny, lecz koncepcyjnie powiązany system modelowy. Pierwszy system to prosty przykład przyłączania kolagenu do sensora, służący do zilustrowania reprezentatywnej kinetyki wiązania i równowagi adsorpcji w czasie podczas pomiaru w dziedzinie czasu (QCM-D). Kolagen jest najliczniejszym białkiem w organizmie, znanym z wszechstronności zachowań wiązania i morfologii. Roztwór kolagenu użyty w tym przypadku nie wymaga dodatkowej funkcjonalizacji złotej powierzchni sensora w celu wywołania adsorpcji9. Drugim systemem eksperymentalnym jest kompleks polielektrolitowy (PEC) składający się z anionowego polistyrenosulfonianu (PSS) i kationowego poli(diallyldimethylammonium) (PDADMA), przygotowany w taki sam sposób jak przez Sadmana i współpracowników2. Materiały te pęcznieją i stają się miękkie w roztworach soli (w tym przypadku KBr), stanowiąc prostą platformę do badania mechaniki polimerów przy użyciu podejścia w dziedzinie częstotliwości (QCM-Z). Dla każdego protokołu proces przygotowania, wykonania i analizy pomiaru przedstawiono na Rysunku 2. Schemat pokazuje, że główna różnica między podejściami QCM-Z i QCM-D polega na etapie zbierania danych oraz instrumentacji użytej w eksperymencie. Wszystkie wspomniane techniki przygotowania próbek są kompatybilne z obiema metodami, a każde z podejść pozwala na analizę próbek w trzech obszarach przedstawionych na Rysunku 1.
Nasze dane wykazują, że przygotowanie próbek, niezależnie od tego, czy powlekanie czujnika odbywa się przed pomiarem, czy w jego trakcie, determinuje możliwość wyznaczenia właściwości wiskoelastycznych układu. Dzięki odpowiedniemu zaprojektowaniu początkowych etapów eksperymentu możemy określić, jakie informacje jesteśmy w stanie precyzyjnie zebrać podczas etapu analizy.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Wodna sonda QCM</td><td>AWSensors</td><td>CLS 00050 A</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr><tr><td>Kolagen I Białko szczurze, ogon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EM3234</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu; ogólnie łatwe do zdobycia w laboratoriach badawczych, ale istnieje numer katalogowy na wypadek, gdyby nie był dostępny</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793175-1GA-PB</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr><tr><td>Gibco Fosforan buforowany solą fizjologiczną</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012-027</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań, 1-warstwowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr><tr><td>NP2K VNA</td><td>Instrumenty</td><td></td> Makarowa <td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr><tr><td>Chlorek poli(diallilodimetyloamoniowy), MW 200 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409022</td><td>Dla pęcznienia polielektrolitu; dla pełnej procedury syntezy patrz Sadman i wsp.</td></tr><tr><td>Sól sodowa poli(styrenosulfonianu) 30% masy w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>561967-500G</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu; pełna procedura syntezy patrz Sadman i wsp.</td></tr><tr><td>Bromek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793604-1KG</td><td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr><tr><td>QSense QCM Explorer System</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Octan sodu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Do adsorpcji kolagenu</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa, model WS-650MZ-23NPP</td><td>Technologie</td><td></td> laurowe <td>Do pęcznienia polielektrolitu</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

W tym badaniu prezentujemy różne przykłady tego, jak przygotowanie cienkiej warstwy do eksperymentów z mikrowagą kryształu kwarcu wpływa na odpowiednie modelowanie danych i określa, które właściwości folii można określić ilościowo. Mikrowaga kwarcowa stanowi wyjątkowo czułą platformę do pomiaru drobnych zmian masy i/lub właściwości mechanicznych nałożonej folii poprzez obserwację zmian rezonansu mechanicznego kryształu kwarcu oscylującego z wysoką częstotliwością. Do zalet tego podejścia należy jego wszechstronność eksperymentalna, możliwość badania zmian właściwości w szerokim zakresie czasu eksperymentu oraz wykorzystanie małych rozmiarów prób. Pokazujemy, że na podstawie grubości i modułu ścinania warstwy osadzonej na czujniku możemy uzyskać różne informacje z materiału. W tym przypadku koncepcja ta jest specjalnie wykorzystywana do wyświetlania parametrów eksperymentalnych skutkujących obliczeniami masy i lepkosprężystości zaadsorbowanego kolagenu na kompleksach złota i polielektrolitu podczas pęcznienia w funkcji stężenia soli.

Zmiany częstotliwości w czasie podczas adsorpcji białek wykazują charakterystyczną krzywą i plateau przedstawione na Rysunku 3A-B. Wstępne płukanie buforem 1x PBS na odsłoniętej powierzchni sensora wywołuje jedynie pomijalne zmiany częstotliwości, zapewniając stabilną linię bazową służącą jako punkt odniesienia dla przyszłych pomiarów. Wprowadzenie roztworu kolagenu inicjuje adsorpcję białek, co objawia się stałym spadkiem częstotliwości w czasie, aż gęstość przywartego kola...

Mikrowaga kryształu kwarcu może zapewnić dokładne właściwości masy i lepkosprężystości dla folii w zakresie mikronów lub submikronów, co jest istotne dla badań w zakresie czujników biomedycznych i środowiskowych, powłok i nauki o polimerach. Grubość próbki ma wpływ na to, jakie informacje można uzyskać z materiału mającego kontakt z czujnikiem.

Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...

Mikrowaga kwarcowa jest przydatna do wykrywania małych stężeń innego związku i może być stosowana do pytań dotyczących mechaniki miękkiej materii i układów biomateriałów. Główną zaletą jest to, że mikrowaga kwarcowa jest w stanie uzyskać bardzo dokładne informacje dla małych rozmiarów próbek. Podczas wydobywania informacji o właściwościach mechanicznych konieczna jest praca z foliami o odpowiedniej grubości.Badacze muszą zachować ostrożność, aby zastosować prawidłowe modelowanie filmu podczas analizy. Technika ta doskonale nadaje się do badania szerokiego zakresu systemów materiałowych oraz do zrozumienia, w jaki sposób właściwości mechaniczne materiałów polimerowych reagują na środowisko. Po włączeniu wszystkich niezbędnych urządzeń należy zdjąć moduł przepływowy z platformy studzienki i odkręcić duże skrzydełkowe, aby otworzyć moduł.Osusz O-ring na module przepływowym strumieniem gazowego azotu i sprawdź, czy O-ring leży płasko. Zamontuj czujnik na O-ringu, umieszczając czujnik powierzchnią czynną do dołu i elektrodą w kształcie kotwy skierowaną w stronę znacznika w module przepływu. Znajdź początkowe częstotliwości rezonansowe czujnika.Umieść rurkę pompy wlotowej w 1X PBS. Uruchom przepływ pompy zewnętrznej od 25 mikrolitrów na minutę i sprawdź wzrokowo rurkę, aby upewnić się, że płyn przepływa przez rurkę. Pozwól, aby przepływ płynu prawidłowo się zrównoważył przez co najmniej 15 minut.W oprogramowaniu naciśnij rozpocznij pomiar, aby rozpocząć pomiar i rozpocząć akwizycję danych. Monitoruj wartości częstotliwości i rozpraszania przez co najmniej pięć minut, aby zapewnić stabilną linię podstawową. Zatrzymaj pompę i przenieś rurkę wlotową do roztworu buforowego octanu kolagenu i wznów przepływ płynu.Zanotuj czas tego wydarzenia do późniejszej analizy. Pozwól, aby nowe wartości częstotliwości i rozpraszania równoważyły się przez osiem do 12 godzin do stabilnej wartości, a następnie zatrzymaj pompę, przesuń rurkę wlotową z powrotem do roztworu 1X PBS i wznów przepływ płynu. Zanotuj czas tego wydarzenia do późniejszej analizy.Ponownie pozwól, aby nowe wartości częstotliwości i rozpraszania równoważyły się przez 30 minut do stabilnej wartości. Zakończ pobieranie danych pomiaru, a następnie zapisz dane. Najpierw umieść nieizolowany czujnik kwarcowy w uchwycie na próbkę podłączonym do wektorowego analizatora sieci i komputera.Włącz analizator, aby przyłożyć napięcie oscylacyjne do czujnika i zbierz widmo przewodności odniesienia dla czujnika w powietrzu, a następnie zanurz uchwyt próbki w bezwargowej zlewce o pojemności 100 mililitrów wypełnionej wodą destylowaną i zbierz widmo przewodności odniesienia dla nieosłoniętego czujnika w wodzie. Włóż małą płytkę krzemową do 0,5-molowego roztworu bromku potasu pod kątem, aby utworzyć suwak dla czujnika kwarcowego podczas etapu wyżarzania, aby zapobiec schodzeniu folii z czujnika. Przygotuj się do nałożenia PEC na powierzchnię czujnika.Jeśli kompleks PEC jest dwufazowy, ostrożnie wlej do pipety około 0,5 mililitra fazy bogatej w polimery. Utrzymując ciśnienie na gruszce pipety, aby nie dopuścić do przedostania się fazy ubogiej w polimer do pipety, wyciągnij pipetę z roztworu. Wytrzyj zewnętrzną część pipety chusteczką chemiczną.Dodaj tyle roztworu, kroplami na powierzchnię czujnika kwarcowego, aby całkowicie pokryć powierzchnię. Upewnij się, że w roztworze na powierzchni czujnika nie ma widocznych pęcherzyków. Odwiruj próbkę PEC i natychmiast zanurz czujnik w 0,5-molowym roztworze bromku potasu, aby zapobiec krystalizacji soli na folii.Pozostaw folię do wyżarzania przez co najmniej 12 godzin. Przenieś czujnik do zlewki wypełnionej wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar bromku potasu z folii i tylnej części czujnika. Pozostaw czujnik w roztworze na 30 do 60 minut.Wykonaj pomiar folii nałożonej na powierzchnię czujnika w powietrzu odnoszącym się do nieosłoniętego czujnika w powietrzu. Poczekaj, aż dane filmu się zrównoważą. Następnie włóż wysuszony siarczan wapnia do 100-mililitrowej zlewki bez warg i zmierz grubość całkowicie suchej warstwy.Usunąć siarczan wapnia ze zlewki i przepłukać zlewkę wodą destylowaną. Napełnij 100-mililitrową zlewkę bez warg 30 mililitrami wody destylowanej. Włóż mieszadło, aby upewnić się, że woda krąży wokół folii.W odniesieniu do nieosłoniętego czujnika w wodzie, mierz film w wodzie przez około 30 do 45 minut lub do momentu, gdy dane filmu zostaną zrównoważone. Przygotuj 15 mililitrowy roztwór trzech molowych bromków potasu, odmierzając 5,35 grama bromku potasu do cylindra z podziałką i napełnij do 15 mililitrów wodą destylowaną. Wiruj, aż się rozpuści.Skieruj folię z dala od miejsca, w którym roztwór bromku potasu jest dodawany do wody, aby film się nie rozpuścił. Dodać roztwór bromku potasu do zlewki z wodą destylowaną w odstępach co 0,1 mola. Upewnij się, że system jest zrównoważony przed dodaniem kolejnego dodatku roztworu bromku potasu.Po zebraniu wszystkich danych usuń folię z uchwytu i umieść w zlewce z wodą destylowaną. Pozostaw sól na 30 do 60 minut i wysusz folię na powietrzu. W tym badaniu wprowadzenie roztworu kolagenu spowodowało rozpoczęcie wchłaniania białka, co zaobserwowano jako stały spadek częstotliwości i wzrost rozpraszania w czasie, aż gęstość przylegającego kolagenu osiągnie stabilną wartość wyjściową.Zmiany częstotliwości są skorelowane z masą filmu, a rozproszenie jest skorelowane z rozpraszaniem energii z folii. Do ilościowego uzyskania właściwości lepkosprężystych potrzebny jest model teoretyczny. Analiza lepkosprężysta kolagenu przy użyciu modelu prawa potęgowego pokazuje odpowiednio masę powietrzną, zespolony moduł ścinania i kąt fazy lepkosprężystej.Pierwsze 10 godzin wskazuje główny etap adsorpcji kolagenu na powierzchni czujnika, przy czym okres od 10 do 20 godzin pokazuje etap równowagi przed płukaniem buforu przeprowadzonym po 20 godzinach. Poniżej znajduje się wykres lepkosprężystego kąta fazowego i zespolonego modułu ścinania w ogólnym zakresie próbek mierzonych za pomocą QCM. Zielona linia wskazuje liniową zależność między tymi dwiema właściwościami.Wykres ten pokazuje, w jaki sposób PEC może wykazywać szeroki zakres właściwości mechanicznych w oparciu o stosunek polimeru, wody i soli w układzie. Przygotowanie próbki ma bezpośredni wpływ na wyniki eksperymentu QCM. Zrozumienie, jakie dane chcesz uzyskać z próbki, informuje o tym, jak gruba powinna być próbka.QCM jest bardzo przydatny do wykrywania procesów środowiskowych i biologicznych. Może również badać zachowanie reologiczne w reżimie wysokiej częstotliwości w celu scharakteryzowania lepkosprężystości materiałów.

sample-preparation-quartz-crystal-microbalance-measurements-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Ten film demonstruje technikę dyssypatywnej mikrograwimetrii do badania wiązania białek z dwuwarstwami lipidów. Małe pęcherzyki jednowarstwowe są dodawane w celu pokrycia powierzchni czujnika kwarcowego mikrowagi. Wykorzystując zależne od jonów wapnia wiązanie docelowego białka wiążącego fosfolipidy z dwuwarstwą, monitorowane są zmiany częstotliwości oscylacji czujnika i rozproszenie oscylacji w celu określenia charakteru wiązania dwuwarstwy białkowo-lipidowej.

Technika mikrograwimetrii dyssypatywnej do badania interakcji białkowo-lipidowej dwuwarstwowej

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Przedstawiono metodologię przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły tarcia dla szczotek stykowych: Dwie szczotki polimerowe, które są szczepione z (a) substratów i (b) sond koloidalnych, są przesuwane, aby pokazać, że dzięki zastosowaniu dwóch stykających się niemieszających się systemów szczotek, tarcie w stykach ślizgowych jest zmniejszone w porównaniu do mieszalnych systemów szczotek.

Pomiary preparatyki i mikroskopii siły tarcia niemieszających się, przeciwstawnych szczotek polimerowych

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół, który może być wykorzystany do określenia powinowactwa wiązania i sposobu interakcji bezznacznikowego białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z immobilizowanymi dwuwarstwami opartymi na ciele stałym (SLB) poprzez jednoczesny pomiar wychwytu masy i właściwości lepkosprężystych białka anektyny A2.

Mikrograwimetria dyssypatywna do badania dynamiki wiązania białka wiążącego fosfolipidy aneksyny A2 z dwuwarstwami lipidowymi na podłożu stałym za pomocą rezonatora kwarcowego

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Obecny protokół opisuje metody badania struktury i dynamiki dwóch modelowych białek, które odgrywają ważną rolę w zdrowiu człowieka. Technika ta łączy laboratoryjną charakterystykę biofizyczną ze spektroskopią echa spinowego neutronów, aby uzyskać dostęp do dynamiki w skalach czasu i długości istotnych dla ruchów międzydomenowych białek.

Badanie dynamiki białek za pomocą spektroskopii neutronowego echa spinowego

Naucz się przygotowywać próbki w mikrowadze kwarcowej QCM do pomiarów adsorpcji białek i mechaniki polimerów. Technika ta umożliwia dokładne badanie właściwości materiałów miękkich.

Przygotowanie próbki w mikrowadze kwarcowej Pomiary adsorpcji białek i mechaniki polimerów

Przeglądaj więcej filmów