Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

W polu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych brakowało genetycznie wykonalnego modelu bezkręgowców do badania sygnałów białkowych i RNA pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Protokół ten ustanawia metody uzyskiwania obfitych, czystych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z C.elegans. Jest to wystarczające do solidnego RNA-SEQ i analizy proteomicznej.

Kiedy zsynchronizowana hodowla C.elegans wyczerpie pokarm ze swojej normalnej płytki pożywki, użyj gumek, aby przymocować nasadkę filtra z nylonowej siatki o grubości pięciu mikrometrów na sterylnej butelce i rozpocznij próżnię. Wlej robaki L1 na filtr i przepuść równą objętość pożywki przez agregaty robaków. Po wirowaniu przenieś trzy 10-mikrolitrowe objętości zawiesiny robaków na pokrywę płytki do uprawy robaków i policz liczbę zwierząt w każdej kropli.

Dostosuj zawiesinę ślimaka do dwóch zwierząt na mikrolitr świeżej pożywki i ponownie zwiruj zawiesinę. Następnie dodaj dziewięć 10-mikrolitrowych kropli robaków na nową pokrywkę talerza i ręcznie policz liczbę zwierząt w każdej kropli. Następnie oblicz średnią i błąd standardowy średniej jako procent każdej populacji robaków i oblicz całkowitą liczbę zwierząt w każdej populacji.

Aby przygotować robaki do wytworzenia sekretomu, umyj robaki trzema pięciominutowymi płukaniami w 15 mililitrach sterylnego podłoża M9 z 50 mikrogramami na mililitr karbenicyliny na płytkę na pranie z delikatnym wirowaniem w celu usunięcia robaków, zbierając popłuczyny w stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów. Po ostatnim płukaniu rozcieńczyć robaki do jednego zwierzęcia na mikrolitr roztworu S-Basel uzupełnionego 2,5 mikrograma na mililitr cholesterolu i 50 mikromolowym stężeniem karbenicyliny. Następnie dodać do 400 mililitrów zawiesiny ślimakowej do sterylnej dwulitrowej kolby z przegrodą z dnem.

Umieścić kolbę na rotatorze kołowym w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 100 obrotach na minutę przez 24 godziny. W celu pobrania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenieś robaki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w celu odwirowania i zdekantuj supernatant przez filtr próżniowy o średnicy 0,22 mikrometra, aby usunąć wszelkie cząstki stałe. Po policzeniu umieść kroplę zawieszonych robaków na trawniku bakteryjnym i po 15 minutach oceń zwierzęta jako poruszające się, sparaliżowane lub martwe.

Następnie zagęścić przefiltrowany supernatant do 700 mikrolitrów za pomocą regenerowanego nitrocelulozy 10 kilodaltonowego filtra odcinającego masę cząsteczkową i dodać 150 mikrolitrów świeżego roztworu S-Basel do redukcji. Przefiltrować i zwirować otrzymany roztwór i powtórzyć redukcję i filtrację jeszcze dwa razy, jak pokazano. Po ostatniej filtracji odwirować supernatant w celu usunięcia wszelkich cząstek i zanieczyszczeń, które mogły nagromadzić się podczas obchodzenia się z nim, i dodać koktajl inhibitorów proteazy oraz EDTA zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby przygotować kolumnę wykluczającą rozmiar, należy zdekantować 15 mililitrów zawieszonej żywicy agarozowej do pustego wkładu kolumny przepływu grawitacyjnego. Po opróżnieniu kolumny dodaj roztwór S-Basel, aż złoże żywicy zostanie wypełnione w końcowej objętości 10 mililitrów. Zastąp bufor żywicy 40 mililitrami sterylnego, przefiltrowanego roztworu S-Basel, uważając, aby nie naruszyć żywicy i pozwolić, aby grawitacja spłynęła przez kolumnę.

Gdy górna część żywicy nie jest już zanurzona, zakryj spód wkładu, aby zatrzymać przepływ i umieść rurkę zbiorczą pod kolumną. Aby rozpocząć frakcjonowanie sekretomu, zdejmij nasadkę i natychmiast dodaj stężony roztwór sekretomu kroplami do górnej części łoża kolumny, a następnie dodaj kroplami jeden mililitr roztworu S-Basel. Umieść świeżą probówkę zbiorczą pod kolumną i powoli napełnij zbiornik górnej kolumny pięcioma mililitrami roztworu S-Basel.

Po zebraniu pierwszych dwóch mililitrów eluatu szybko zmień probówki, aby zebrać kolejne cztery mililitry. Użyj regenerowanego filtra spinowego nitrocelulozy o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów, aby zagęścić pęcherzyk zewnątrzkomórkowy zawierający eluat kolumnowy do 300 mikrolitrów i przenieś retentat filtra do probówki mikrowirówki o niskim poziomie wiązania. Następnie przemyć membranę filtracyjną dwa razy 100 mikrolitrami roztworu S-Basel w ciągu 20 sekund wirowania na pranie i połączyć popłuczyny z oryginalnym retentatem, aby uzyskać końcową objętość próbki 500 mikrolitrów.

Aby przygotować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe do oznaczania ilościowego za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej, dodaj 840 mikrolitrów roztworu S-Basel i 60 mikrolitrów oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do probówki mikrowirówkowej. Dodać 300 mikrolitrów próbki do dwóch dodatkowych probówek do mikrowirówek wraz z siedmioma mikrolitrami odpowiedniej sondy potencjometrycznej na probówkę. Dodaj siedem mikrolitrów 1% Triton X-100 do ostatniej probówki i wymieszaj wszystkie probówki przez wirowanie.

Umieść końcówkę sonikatora na środku rurki trzeciej próbki i pulsuj próbkę 10 razy przy 20% mocy i 30% cyklu pracy. Następnie dodaj 300 mikrolitrów roztworu S-Basel do dwóch kontrolnych probówek wirówek i dodaj siedem mikrolitrów sondy do probówki z samym barwnikiem. Oznacz drugą probówkę Tylko bufor.

Następnie inkubować wszystkie probówki przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem przed ich analizą za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby przeanalizować dane, otwórz pliki w odpowiednim oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej. Ustaw prostokątną bramę zaczynającą się na szczycie działki, rozciągającą się od poziomu rozproszenia światła pod małym kątem raz 10 do dwóch do jednego razy 10 do czterech i schodząc w dół, aż będzie zawierała około 2,5% wszystkich zdarzeń.

Nazwij bramkę na cześć sondy, a następnie skopiuj i wklej bramkę na pozostałe dwa wykresy danych próbki i kontroli. Następnie wyeksportuj analizę do arkusza kalkulacyjnego. Przedstawiono tu reprezentatywne wyniki z 10 powtórzeń biologicznych.

Zmienność między powtórzeniami nie jest znacząca, a typowy błąd standardowy średniej wielkości populacji wynosi nieco ponad 10%Przenoszenie zwierząt między płytkami powoduje około 10% strat zwierząt, podczas gdy około 20% zwierząt jest traconych na etapie flotacji sacharozy. Średnio 1000 młodych dorosłych zwierząt typu dzikiego wydziela do swojego środowiska jeden mikrogram białka większego niż 10 kilodaltonów. Gdy frakcja ta jest dalej rozdzielana za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, całkowity profil elucji białka wykazuje mały pik białka od dwóch do sześciu mililitrów i duży pik po ośmiu mililitrach.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe znajdują się w pierwszych pięciu mililitrach eluatu kolumny. W bezpośrednim porównaniu charakterystyki cytometrii przepływowej między C. elegans a ludzkimi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, histogram zdarzeń próbki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych C. elegans, posortowany według małego kąta rozproszenia światła, pokazuje, że wszystkie preparaty osiągają szczyt przy średniej intensywności fluorescencji około 1 razy 10 do trzeciej. Sonda potencjometryczna DI-8-ANEPPS solidnie znakuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe C.elegans, a obfitość oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych posortowanych przez ekspresję DI-8-ANEPPS nie różni się znacząco między C.elegans a preparatami pochodzącymi z kultur komórkowych.

Próbki przygotowane w tej procedurze są podatne na wszystkie typowe metody analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w tym RNA-SEQ, cytometrię przepływową, analizę śledzenia nanocząstek i analizę proteomiczną. Opracowanie metod oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych C.elegans pozwala naukowcom wykorzystać ten prosty model bezkręgowców do badania szlaków genetycznych i procesów fizjologicznych, które wpływają na skład ładunku pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.