Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych
28 stycznia 2020
Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.
Wszczepienie guzów na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka lub CAM można wykorzystać do badań rakotwórczości, skuteczności leczenia lub przesłuchu komórkowego. Metoda ta pozwala na efektywny kosztowo szybki wzrost guza w warunkach immunotolerancyjnych in vivo. Korzystając z modelu CAM, można szybko przetestować nowatorskie podejścia terapeutyczne przy użyciu linii komórkowych, a nawet próbek guzów pacjentów.
Najważniejszym aspektem tego protokołu jest zapewnienie prawidłowego tworzenia CAM i nie zakłócanie CAM lub układu krwionośnego podczas otwierania jaj. W siódmym lub ósmym dniu rozwoju, kiedy CAM jest w pełni rozwinięty, wyłącz rotator jaj i umieść około jednego do trzech jaj w stojaku na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przy zgaszonych światłach umieść świecznik do jajek przy skorupce jajka, aby zidentyfikować i zaznaczyć położenie komórki powietrznej jednego jajka, a następnie przesuń świecę po skorupce, aby znaleźć dużą sieć naczyń krwionośnych, obracając jajko w razie potrzeby.
Idealne unaczynienie rozgałęzi się w pobliżu środka jaja. Użyj markera, aby prześledzić naczynia krwionośne, które mają być użyte do implantacji. Po ponownym włączeniu światła w masce użyj bezprzewodowego narzędzia obrotowego wyposażonego w kamień szlifierski z węglika krzemu, aby wywiercić mały otwór w skorupie bezpośrednio nad środkiem komory powietrznej.
Gdy większość skorupy zostanie usunięta, ale z nienaruszoną białą błoną wewnętrzną, wywierć kolejny mały otwór, w którym okno naczyniowe zostanie otwarte, jak pokazano. Gdy drugi otwór jest gotowy, użyj igły o rozmiarze 18, aby delikatnie przebić białą błonę wewnętrzną nad komórką powietrzną i naczyniami krwionośnymi, uważając, aby biała błona wewnętrzna, ale nie CAM, została przerwana na całym wierconym obszarze. Przy ponownie wyłączonym świetle kaptura użyj świecznika do jajek, aby sprawdzić, czy komórka powietrzna została przeniesiona z końca jajka do obszaru nad naczyniami krwionośnymi.
W razie potrzeby umieść rurkę próżniową włożoną do kontrolera pipet wokół otworu nad oryginalną komórką powietrzną i delikatnie zasysaj w krótkich seriach, aby przesunąć komórkę powietrzną. Zaznacz kontur nowego położenia komory powietrznej około 0,5 centymetra wewnątrz granicy CAM powietrza i przymocuj kawałek taśmy pakowej na tyle duży, aby zakryć otwór nad nową komorą powietrzną. Po przygotowaniu pozostałych dwóch jaj, jak właśnie pokazano, należy umieścić jaja z powrotem w inkubatorze i otworzyć wszelkie dodatkowe jaja do eksperymentu w grupach od jednego do trzech, jak pokazano.
Po otwarciu wszystkich jaj przenieś od jednego do trzech jaj z przeniesionymi komórkami powietrznymi do stojaka na jajka w komorze bezpieczeństwa biologicznego i użyj bezprzewodowego narzędzia obrotowego wyposażonego w okrągłą tarczę tnącą, aby całkowicie przeciąć małą linię nad granicą komórek powietrznych przez komórkę bez zakłócania CAM lub układu krwionośnego. Za pomocą zakrzywionych nożyczek przeciąć pozostałą komórkę powietrzną, aby utworzyć okno w skorupie i sprawdzić żywotność zarodka. Zdolne do życia zarodki będą wykazywać rozległe unaczynienie, wyraźną albuminę, ruchy zarodka i/lub widoczne bicie serca.
U zarodków niezdolnych do życia CAM może wydawać się nieprzezroczysty z niewielką liczbą naczyń krwionośnych, jeśli w ogóle, a zarodki mogą być małe lub nieobecne, bez ruchu lub bicia serca. Za pomocą kleszczy Semkin wyciągnij małe kawałki bawełny ze sterylnego wacika i delikatnie osusz powierzchnię CAM żywotnych zarodków, aby usunąć kurz i zanieczyszczenia z muszli, a następnie przykryj otwór skorupy jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku z przezroczystej folii o wymiarach sześć na siedem centymetrów, nie dotykając CAM i włóż jaja z powrotem do inkubatora z otwartym oknem skierowanym do góry. Użyj kawałka stojaka na jajka, krawędzi rotatora do jaj lub innego odpowiedniego przedmiotu, aby podeprzeć jajka, które się toczą.
Aby przygotować zawiesinę komórek rakowych do przeszczepu, należy zebrać komórki z hodowli komórek rakowych, która jest przedmiotem zainteresowania, i rozprowadzić komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant i mechanicznie ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu. Umieścić zawiesinę komórek na lodzie i za pomocą pipety zmierzyć objętość komórek w podłożu.
Następnie ponownie zawieś komórki w stężeniu od jednego do dwóch milionów komórek w 20 do 100 mikrolitrach pożywki uzupełnionej 2,7 do 4 miligramów na mililitr macierzy zewnątrzkomórkowej i dowolnymi czynnikami wzrostu lub innymi dodatkami będącymi przedmiotem zainteresowania. W przypadku implantacji komórek rakowych, za pomocą nieprzywierającego pierścienia, umieść do sześciu jaj do zagnieżdżenia na stojaku na jajka i zwiń krawędzie przezroczystego opatrunku foliowego w kierunku otwartego okna, aby usunąć folię ze skorupek. Sprawdź, czy jaja są żywotne i zdrowe.
Idealne jaja będą miały duże naczynie z mniejszymi rozgałęzionymi naczyniami pośrodku otwartego obszaru. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki umieść sterylny nieprzywierający pierścień na CAM nad naczyniem, najlepiej nad punktem rozgałęzienia. Użyj sterylnego szklanego pręta do mieszania, aby delikatnie zetrzeć CAM i pipetować zawiesinę komórek rakowych do środka pierścienia.
Po dostarczeniu wszystkich komórek należy uszczelnić otwór jedną czwartą kawałka przezroczystego opatrunku foliowego o wymiarach sześć na siedem centymetrów i oznaczyć komórkę jajową odpowiednim oznaczeniem implantu. Następnie umieść jaja bezpiecznie w inkubatorze z otworem skorupki skierowanym do pionu. Aby wszczepić komórki rakowe bez użycia nieprzywierającego pierścienia, należy zassać zawiesinę komórek do odpowiedniej wielkości końcówki pipety i trzymając górną część końcówki, ostrożnie wysunąć końcówkę pipety i umieścić końcówkę poziomo w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej.
Po załadowaniu końcówek umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 30 minut, sprawdzając polimeryzację po 15 minutach. Niewielka ilość płynu zazwyczaj wycieka, gdy każda końcówka jest umieszczana w naczyniu. Użyj tej cieczy, aby oszacować zakres polimeryzacji w końcówce.
Gdy matryca jest gotowa, umieść jedną końcówkę na pipecie o odpowiedniej wielkości i naciśnij tłok, aby wcisnąć częściowo spolimeryzowaną zawiesinę komórek na CAM, idealnie nad rozgałęzionym punktem dużego, dobrze rozwiniętego naczynia. Stosując te metody, zarówno ludzkie, jak i mysie linie komórkowe raka jajnika oraz fragmenty guza pierwotnego doprowadziły do pomyślnego wszczepienia guzów o morfologii zgodnej z morfologią obserwowaną w innych modelach in vivo. Spośród badanych typów nowotworów wzrost raka jajnika był znacznie mniej wyraźny i zazwyczaj nie był widoczny bez pomocy obrazowania bioluminescencyjnego.
Za pomocą tych metod można również przetestować efekty dodania czynników wzrostu lub hormonów w momencie implantacji. W przypadku raka nerki implantacja komórek jasnokomórkowego raka nerki z ustalonych linii komórkowych lub fragmentów pierwotnych ludzkich guzów nerki powoduje szybkie, silne tworzenie guza. Co więcej, do ustalenia guzów przy użyciu tego modelu wykorzystano wiele ludzkich i mysich linii komórkowych raka prostaty oraz linie komórkowe ludzkiego raka pęcherza moczowego i fragmenty guza pierwotnego.
Bardzo ważne jest, aby nie zakłócać CAM i układu krwionośnego oraz upewnić się, że CAM nie przylega do skorupy podczas otwierania okna. Po udanym wszczepieniu model CAM może być wykorzystany do oceny skuteczności terapeutycznej terapii będących przedmiotem zainteresowania lub interakcji między różnymi typami komórek w obrębie guza.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Model błony chorioallantoicznej (CAM) kurczaka służy jako transplantowalny system in vivo do badania linii komórkowych nowotworów ginekologicznych i urologicznych oraz guzów pochodzących od pacjentów. Metoda ta umożliwia szybki wzrost nowotworu w środowisku immunotolerancyjnym, co ułatwia testowanie nowych podejść terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Biologia transplantacji
- Modele in vivo
Wstęp
- Model CAM stanowi efektywną kosztowo alternatywę dla przeszczepiania nowotworów.
- Umożliwia on prowadzenie badań nad tumorigenicznością oraz skutecznością leczenia.
- Model ten jest immunotolerancyjny, co pozwala na badania nad ludzkimi nowotworami.
- Prawidłowe uformowanie błony CAM jest kluczowe dla sukcesu przeszczepienia.
Cel badania
- Przedstawienie modelu CAM jako potencjalnej metody w badaniach nad rakiem.
- Umożliwienie szybkiego testowania strategii terapeutycznych.
- Ułatwienie badania oddziaływań komórkowych w guzach.
Zastosowane metody
- Przeszczepianie guzów na błonę Calleruve'a (CAM) embrionów kurzych.
- Identyfikacja sieci naczyń krwionośnych w celu optymalnego umiejscowienia guza.
- Monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na leczenie.
- Wykorzystanie próbek guzów pochodzących od pacjentów w eksperymentach.
Główne wyniki
- Model CAM umożliwia efektywny przeszczep guza.
- Szybki wzrost guza zaobserwowano w warunkach immunotolerancji.
- Nowe podejścia terapeutyczne mogą być testowane w sposób wydajny.
- Prawidłowa obsługa CAM jest niezbędna dla osiągnięcia pomyślnych wyników.
Wnioski
- Model CAM jest obiecującym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Stanowi on platformę do badania skuteczności leczenia.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do opracowania innowacyjnych terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model błony chorioallantoicznej (CAM) kurczaka stanowi kosztowo efektywny i szybki system in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych, umożliwiając testowanie terapii na wczesnym etapie bez konieczności stosowania immunokompromitowanych modeli mysich. Jego immunotolerancyjny charakter sprzyja wszczepianiu próbek guzów ludzkich i mysich, co ułatwia przedkliniczną ocenę ryzyka nowych związków. Model ten przyspiesza harmonogramy odkryć, umożliwiając bezpośrednią wizualizację oraz obrazowanie bioluminescencyjne wzrostu guza, inwazji i odpowiedzi terapeutycznej w ciągu zaledwie kilku dni.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie tumorigenności i potencjału przerzutowego w unaczynionym środowisku in vivo.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybką ocenę skuteczności terapeutycznej z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego do czułej detekcji nowotworów.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza zależność od modeli mysich, redukując koszty i czas walidacji celów w potokach badawczych onkologii.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia powtarzalną platformę do przeszczepiania różnorodnych typów nowotworów, w tym linii komórkowych i tkanek pierwotnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury implantacji nowotworów poprzez określone formulacje macierzy zewnątrzkomórkowej i pośrodka.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalne przesiewanie kandydatów terapeutycznych przy użyciu zestandaryzowanych protokołów implantacji i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań między guzem a zrąbkiem oraz odpowiedzi terapeutycznej w istotnym dla choroby kontekście in vivo.
- Wartość operacyjna: Pozwala na podłużny monitoring wzrostu guza i przerzutów za pomocą nieinwazyjnego obrazowania.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając danych prognostycznych na temat skuteczności i toksyczności leku w organizmie całego zwierzęcia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model CAM integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, stanowiąc pomost między badaniami przesiewowymi in vitro a przedklinicznymi badaniami na myszach, oferując szybki i kosztowo efektywny etap walidacji in vivo dla celów terapeutycznych w nowotworach ginekologicznych i urologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wzrostu, naciekania i przerzutowania nowotworów w środowisku unaczynionym i immunotolerancyjnym.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane i powtarzalne szczepienie nowotworów w celu spójnej oceny związków w różnych laboratoriach.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty bioluminescencji do oceny masy guza i odpowiedzi na leczenie w czasie.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od walidacji linii komórkowych po testy przedkliniczne poprzez modelowanie szczepienia ludzkich nowotworów bez modyfikacji genetycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku dla wielu typów nowotworów i modalności terapeutycznych w ramach portfeli onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez modelowanie wzrostu guza w fizjologicznie istotnym, unaczynionym systemie in vivo.
- Wartość operacyjna: Redukuje nakłady czasu i zasobów w porównaniu do modeli mysich, umożliwiając ocenę guza w ciągu 14 dni po wszczepieniu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka kandydatów terapeutycznych przed kosztownymi badaniami na myszach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację projektów onkologicznych w oparciu o korektę ryzyka dzięki szybkim danym o skuteczności in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach embrionologicznych oraz sterylnego obchodzenia się z zarodkami kurczymi.
- Zależne od specjalistycznego oprzyrządowania, w tym świecok do jaj, narzędzi obrotowych oraz pęset do manipulacji błonami.
- Wymaga standaryzowanych protokołów przygotowania zawiesiny nowotworowej i mieszania macierzy pozakomórkowej w celu zapewnienia spójności wszczepienia.
- Wymaga adaptacji w zależności od typu nowotworu ze względu na zmienną efektywność wszczepienia obserwowaną w raku jajnika, nerki, prostaty i pęcherza moczowego.
- Ograniczone krótkim oknem rozwojowym zarodków kurzych, co zawęża badania do około dwóch tygodni po wszczepieniu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Egg Opening
4:00
Cancer Cell Suspension Preparation
4:42
Non-Stick Ring Implantation
5:44
Implantation Without a Non-Stick Ring
6:40
Results: Representative Establishment of Cancer Cell Engraftment Using the CAM Model
7:40
Conclusion
