Name: Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy. Technika umożliwia wykrywanie interakcji białkowych w czasie rzeczywistym bez lizy komórkowej, wspierając odkrywanie nowych leków przeciwwirusowych przeciwko HPV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (#19H03430 i #17K09405 dla M.O., a #19J11829 dla K.S.), przez Grant-in-Aid na Badania Naukowe w Innowacyjnych Obszarach (#18H05024 do M.O.), przez Program Badawczy dotyczący Zapalenia Wątroby od Japońskiej Agencji Badań Medycznych i Rozwoju, AMED (do M.O., #JP19fk021005), w ramach programu Innowacyjnego Rozwoju i Zastosowania Nowych Leków na Wirusowe Zapalenie Wątroby typu B (#JP19fk0310102 do K.K.) od AMED, przez granty z Japońskiej Fundacji Enzymologii Stosowanej i z Fundacji Kobayashi na rzecz Badań nad Rakiem (dla M.O.), przez GSK Japan Research Grant 2018 (dla K.S.) oraz przez grant z Miyakawa Memorial Research Foundation (dla K.S.).

UWAGA: Schematyczne przedstawienie testu rozszczepionej lucyferazy jest pokazane w Rysunek 1A, a proces testu jest opisany w Rysunek 1B. Dynamika interakcji może być mierzona w czasie rzeczywistym bez lizy komórek.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowane komórki HEK293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1x penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C w 20%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Wysiewać 5 x 106 komórek do naczynia o średnicy 100 mm z 10 ml DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Przejściowo transfekować 1 μg HBx i DDB1 z rozszczepionymi lucyferazy do komórek zgodnie z następującą metodą. 
	UWAGA: Ilość transfekowanego plazmidowego DNA może zależeć od użytego regenta transfekcji. Należy wcześniej określić optymalną pozycję rozszczepionej lucyferazy połączonej z białkiem docelowym. W tym przypadku HBx połączony z LgBit na C-końcu HBx (HBx-LgBit) i DDB1 połączony z SmBit na N-końcu DDB1 (SmBit-DDB1) zapewniły najlepsze wyniki (tj. Najjaśniejsze sygnały lucyferazy). Proces ten został już wcześniej szczegółowo opisany7.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 μg plazmidu DNA wykazującego ekspresję HBx-LgBit i 1 μg plazmidu DNA wykazującego ekspresję SmBit-DDB1 (tabela materiałów) w buforze kondensacyjnym DNA (tabela materiałów) do całkowitej objętości 300 μl.</li>
		<li>Dodać 16 μl roztworu wzmacniacza (tabela materiałów) i mieszać przez wirowanie przez 1 s.</li>
		<li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 60 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) do próbki i mieszać przez wirowanie przez 10 s.</li>
		<li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 8 minut.</li>
		<li>Podczas inkubacji należy odessać pożywkę hodowlaną z naczynia (przygotowanego w kroku 1.2) i przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć PBS przez aspirację i dodać 7 ml DMEM.</li>
		<li>Dodać 3 ml DMEM do probówki zawierającej kompleksy transfekcji. Wymieszać pipetując i dodać kompleksy transfekcji na komórkę w naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 przez 10 godzin.</li>
	<li>Ponownie zasiać komórki na białej 96-dołkowej płytce przy 5 x 104 komórki/basenik w 50 μl pożywki/basenik zgodnie z następującą metodą.
	<ol>
		<li>Usunąć zużytą pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć komórki 5 ml PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS przez aspirację, dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek.</li>
		<li>Dodać 4 ml DMEM i rozproszyć pożywkę, kilkakrotnie pipetując powierzchnię warstwy komórkowej. Przenieść zawiesinę komórek do probówki.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozcieńczyć osad komórkowy buforowaną pożywką do hodowli komórkowych (tabela materiałów) uzupełnioną 10% FBS do gęstości wysiewu 1,0 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 przez 10 godzin.</li>
</ol>
2. Badanie przesiewowe złożone
<ol>
	<li>Podczas inkubacji rozcieńczyć związki przesiewowe (tabela materiałów) i rozpuszczalnik (dimetylosulfotlenek [DMSO]) przy stężeniu 13,5x. Na przykład, jeśli podstawa wynosi 10 mM, a stężenie przesiewowe wynosi 10 μM, dodać 1 μl roztworu podstawowego do 73,1 μl buforowanej pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodać 12,5 μl podłoża luminescencyjnego (tabela materiałów) do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Jako kontrole ujemne, studzienki na obu końcach płytki (tj. kolumny 1 i 12) nie powinny zawierać podłoża luminescencyjnego.</li>
	<li>Zmierz luminescencję linii bazowej za pomocą luminometru (tabela materiałów).</li>
	<li>Natychmiast po wstępnym pomiarze dodać 5 μl związków i kontrolować DMSO rozcieńczony w kroku 2.1 do każdej studzienki. 
	UWAGA: Końcowe stężenie wyniesie 10 μM.</li>
	<li>Mierz wartości luminescencji co 30 minut przez 2 h. 
	UWAGA: Płytkę należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obliczyć efekty hamujące przez porównanie z kontrolnym leczeniem DMSO po normalizacji do sygnałów wyjściowych. 
	UWAGA: Przesiewanie każdego związku w duplikatach lub trzech egzemplarzach może zmniejszyć zmienność.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy wygodną metodę badań przesiewowych przy użyciu testu rozszczepionej lucyferazy w celu znalezienia inhibitorów wiązania HBx-DDB1. Dynamika interakcji może być wykrywana w czasie rzeczywistym w żywych komórkach bez konieczności lizy komórek. Hamowanie interakcji HBx-DDB1 prowadzi do przywrócenia Smc5/6, co skutkuje zahamowaniem transkrypcji wirusa, ekspresji białka i produkcji cccDNA7. Ten nowy mechanizm działania przeciwwirusowego może przezwyciężyć niedoskonałości obecnych terapii HB...

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, z rocznymi szacunkami 240 milionów ludzi przewlekle zakażonych HBV i 90 000 zgonów z powodu powikłań infekcji, w tym marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)1. Chociaż obecne leki przeciw HBV, analogi nukleozydów, wystarczająco hamują odwrotną transkrypcję wirusa, rzadko osiągają eliminację białek wirusowych, co jest długoterminowym celem klinicznym. Ich słaby wpływ na eliminację białek wirusowych wynika z braku bezpośredniego wpływu na transkrypcję wirusa z episomalnych wirusowych indeksów kowalencyjnie zamkniętych kolistych DNA (cccDNA) w jądrze hepatocytów2.
Transkrypcja HBV jest aktywowana przez białko regulatorowe HBV X (HBx)3. Ostatnie badania wykazały, że HBx degraduje strukturalne utrzymanie chromosomów 5/6 (Smc5/6), czynnika ograniczającego gospodarza, który blokuje transkrypcję HBV z cccDNA, poprzez przejęcie kompleksu ligazy ubikwityny DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Dlatego uważa się, że kluczowym krokiem w promowaniu transkrypcji wirusa z cccDNA jest interakcja HBx-DDB1. Związki zdolne do hamowania wiązania między HBx i DDB1 mogą blokować transkrypcję wirusa, a nitazoksanid został zidentyfikowany jako inhibitor interakcji HBx-DDB1 za pomocą systemu przesiewowego opracowanego w naszym laboratorium7.
Tutaj prezentujemy nasz wygodny system przesiewowy używany do identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1, który wykorzystuje podzielony test komplementarny lucyferazy7,8. Rozdzielone podjednostki lucyferazy są połączone z HBx i DDB1, a interakcja HBx-DDB1 zbliża podjednostki do siebie, tworząc funkcjonalny enzym, który generuje jasny sygnał luminescencyjny. Ponieważ interakcja między podjednostkami jest odwracalna, system ten może wykrywać szybko dysocjujące białka HBx-DDB1 (ryc. 1). Korzystając z tego systemu, można łatwo przeprowadzić badania przesiewowe dużej biblioteki związków, co może skutkować odkryciem nowych związków zdolnych do skutecznego hamowania interakcji HBx-DDB1.

<table><tbody><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 dołków, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Zawiera bufor kondensacyjny DNA, roztwór wzmacniający i odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td><td></td><td></td>175012</tr><tr><td>Luminometr mikropłytkowy GloMax 96</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&ndash; Plazmid DNA z ekspresją LgBit</td><td>Nasze laboratorium</td><td></td><td>Dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Systemy startowe NanoBiT PPI</td><td>Promega</td><td>N2015</td><td>Zawiera odczynnik Nano-Glo Live Cell</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>Opisany w manuskrypcie jako "buforowane podłoże do hodowli komórek"</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Screen-Well Zatwierdzona przez FDA biblioteka leków V2 wersja 1.0</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841</td><td>Stosowane tutaj związki były następujące: mequinol, hydrat merkaptopuryny, mesna, mestranol, hemissiarczan metaproterenolu, dwuwinian metaraminolu, metaksam, chlorek metacholiny, metazolamid, metazolamid, hipurynian metenaminy, metokarbamol, metotreksat, metoksalen, bromek metskopolaminy, metsuksymid, metylotaliozyd, aminolewulinian metylu i middot; HCl, maleinian metyloergonowiny, metolazon, metyrapon, meksyletyna i middot; HCl, mikafungina, mikonazol, midodryna i middot; HCl, miglitol, milnacipran i middot; HCl, mirtazapina, mitotan i moexipril i middot; HCl, furoinian mometazonu, mupirocyna, nadolol, nafcylina i middot; Na, naftifine&middot; HCl, naratryptan i middot; HCl, natamycyna, nebiwołol i middot; HCl, nelarabina, nepafenak, newirapina, niacyna, nikotyna, nilotynib, nilutamid, nitazoksanid, nityzynon, nitrofurantoina, nizatydyna, nortryptylina i middot; HCl, olsalazyna i middot; Na, orlistat, oksaprozyna, okstrifilina, chlorek oksybutyniny, oksytetracyklina i middot; HCl, paliperydon, palonosetron i middot; HCl, siarczan paromomycyny, pazopanib i middot; HCl, disód pemetreksedu, pemirolast potasu, penicylamina, penicylina G potasu, izetynian pentamidyny, pentostatyna, perindopryl erbumina, permetryna, perfenazyna, siarczan fenelzyny, fenylefryna, fitonadynon, pimekrolimus, pitawastatyna wapń i podofilox</td></tr><tr><td>SmBit&ndash; Plazmid DNA z ekspresją DDB1</td><td>Nasze laboratorium</td><td></td><td>Dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja inhibitorów interakcji hbx-ddb1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe środki terapeutyczne na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). Chociaż obecnie dostępne analogi nukleo(t)ide silnie hamują replikację wirusa, nie mają bezpośredniego wpływu na ekspresję białek wirusowych transkrybowanych z wirusowego kowalencyjnie zamkniętego kolistego DNA (cccDNA). Ponieważ wysokie miano antygenu wirusa może odgrywać rolę w tej przewlekłej i związanej z HBV kancerogenezie, celem leczenia HBV jest wyeliminowanie białek wirusowych. Białko regulatorowe X (HBx) HBV wiąże się z białkiem białka 1 wiążącego uszkodzenie DNA gospodarza (DDB1) w celu degradacji strukturalnego utrzymania chromosomów 5/6 (Smc5/6), co powoduje aktywację transkrypcji wirusa z cccDNA. Tutaj, korzystając z systemu testów komplementacji podzielonej lucyferazy, przedstawiamy kompleksowy system badań przesiewowych związków w celu identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1. Nasz protokół umożliwia łatwe wykrywanie dynamiki interakcji w czasie rzeczywistym w żywych komórkach. Technika ta może stać się kluczowym testem do odkrycia nowych środków terapeutycznych w leczeniu zakażenia HBV.

Reprezentatywne wyniki po zastosowaniu niniejszego protokołu przedstawiono na Ryc. 2A,B. Stosunek sygnału do tła był większy niż 80, a współczynnik Z'9 (złoty standard indeksu jakości dla przesiewania wysokoprzepustowego) był większy niż 0,5, co wskazuje, że ten system analizy był dopuszczalny do przesiewania wysokoprzepustowego. Przy ustaleniu progu na poziomie &gt;40% inhibicji w porównaniu z kontrolą (sam DMSO), zid...

Tutaj prezentujemy metodę badania przesiewowego czynników przeciwwirusowych zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1 za pomocą systemu testów z podziałem lucyferazy. System ten pozwala na łatwe wykrywanie oddziaływań białko-białko i nadaje się do identyfikacji inhibitorów takich interakcji.

Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Interakcja HBX-DDB1 jest kluczowym krokiem w promowaniu transkrypcji HPV z cccDNA, więc protokół ten może stać się kluczowym atutem w odkrywaniu nowych środków terapeutycznych do funkcjonalnego leczenia HPV. Nasza procedura jest prosta i wymaga tylko krótkiego czasu na przesiewanie. Interakcja, którą mieszam, może być wykryta w czasie rzeczywistym bez konieczności lizy komórek.Co więcej, jakość ekranu jest zadowalająca z wysoką oceną Z prime. Hamowanie interakcji HBX-DDB1 prowadzi do przywrócenia Smc5/6, co skutkuje supresją transkrypcji HPV, ekspresji białek i produkcji cccDNA. Ten nowy mechanizm działania przeciwwirusowego może przezwyciężyć niedoskonałości obecnych terapii HPV.Interakcje białko-białko są ważną klasą celów leków. Opisany tutaj kwas na bazie rozszczepionej lucyferazy, który jest ukierunkowany na interakcje między białkami wirusa i hasS, może zapewnić nową strategię opracowywania leków na inne choroby zakaźne. Chociaż nasz protokół jest prosty i łatwy do zrozumienia, niektóre kroki mogą być trudne do odtworzenia bez wizualnej demonstracji.Dlatego demonstracja wizualna będzie bardzo pomocna w zrozumieniu naszego protokołu. Zacznij od wysiewu komórek pięć razy od 10 do 5 HEK293T do 100-milimetrowego naczynia z 10 mililitrami DMEM i inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć po jednym mikrogramie plazmidów DNA wykazujących ekspresję HBx-LgBit i SmBit-DDB1 oraz buforu kondensacyjnego DNA do uzyskania łącznej objętości 300 mikrolitrów.Dodaj 16 mikrolitrów roztworu wzmacniacza i mieszaj probówki, wirując przez jedną sekundę. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie dodać 60 mikrolitrów odczynnika do transfekcji. Wirować probówkę przez 10 sekund i inkubować próbkę przez kolejne osiem minut.W międzyczasie odessaj pożywkę z naczynia z komórkami i umyj je pięcioma mililitrami PVS. Odessać PVS i dodać siedem mililitrów DMEM. Dodaj trzy mililitry DMEM do probówki z kompleksami transfekcyjnymi, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać, i dodaj mieszaninę do komórek.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla przez 10 godzin. Po inkubacji usuń zużytą pożywkę hodowlaną i umyj komórki pięcioma mililitrami PVS. Usuń PVS w jednym mililitrze 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby je odłączyć.Następnie dodaj cztery mililitry DMEM i rozproszyć pożywkę, odpipetowując ją kilkakrotnie po powierzchni warstwy komórek, a następnie przenieś zawiesinę do probówki. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut, następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze PVS. Powtórzyć cetrifugację i odrzucić supernatant.Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforowanej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 10% FBS do gęstości wysiewu miliona komórek na mililitr. Odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 godzin. Podczas inkubacji komórek rozcieńczyć związki przesiewowe i rozpuszczalnik do stężenia 13,5 X.Dodaj 12,5 mikrolitra podłoża luminescencyjnego do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zmierz luminescencję linii bazowej za pomocą luminometru i natychmiast po tym dodaj pięć mikrolitrów związków i kontrolowanego DMSO do każdej studzienki. Mierz luminescencję co 30 minut przez dwie godziny, a następnie oblicz działanie hamujące związków w porównaniu z leczeniem DMSO.Zmierzono wyjściowe sygnały luminescencji, a stosunek sygnału do tła obliczono jako większy niż 80. Liczba pierwsza Z była większa niż 0,5, co wskazuje, że ten system testów jest akceptowalny dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Ustalając próg na poziomie większym niż 40% inhibicji w porównaniu z kontrolą stosowaną wyłącznie przez DMSO, nitazoksanid został zidentyfikowany jako potencjalny lek.Wcześniej zidentyfikowaliśmy nitazoksanid jako inhibitor interakcji HBX-DDB1 poprzez badanie przesiewowe biblioteki związków reaktywnych na małą skalę za pomocą tej metody. Stosując nitazoksanid, potwierdzamy to hamowanie interakcji HBX-DDB1, zmniejszenie transkrypcji wirusa i późniejsze poziomy produktu wirusowego. Optymalna porcja rozszczepionej lucyferazy połączonej z białkiem docelowym musi być wcześniej określona.W tym przypadku HPX połączony z dużym bitem na końcu C HPX i DDB1 połączony z małym bitem na końcu DDB1 zapewnił najlepsze wyniki.

identifying-inhibitors-hbx-ddb1-interaction-using-split-luciferase

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Ten film demonstruje test komplementacji rozszczepionej lucyferazy w celu wykrycia interakcji białko-białko. W tym teście interesujące białka są oznaczane do małych i dużych fragmentów enzymu lucyferazy. Kiedy białka wchodzą w interakcję, duże i małe fragmenty łączą się, tworząc aktywny kompleks enzymatyczny, który w obecności określonego substratu uwalnia jasną luminescencję, którą można zmierzyć.

Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy. Technika umożliwia wykrywanie interakcji białkowych w czasie rzeczywistym bez lizy komórkowej, wspierając odkrywanie nowych leków przeciwwirusowych przeciwko HPV.

Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów