Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy
21 grudnia 2019
Tutaj prezentujemy metodę badania przesiewowego czynników przeciwwirusowych zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1 za pomocą systemu testów z podziałem lucyferazy. System ten pozwala na łatwe wykrywanie oddziaływań białko-białko i nadaje się do identyfikacji inhibitorów takich interakcji.
Interakcja HBX-DDB1 jest kluczowym krokiem w promowaniu transkrypcji HPV z cccDNA, więc protokół ten może stać się kluczowym atutem w odkrywaniu nowych środków terapeutycznych do funkcjonalnego leczenia HPV. Nasza procedura jest prosta i wymaga tylko krótkiego czasu na przesiewanie. Interakcja, którą mieszam, może być wykryta w czasie rzeczywistym bez konieczności lizy komórek.
Co więcej, jakość ekranu jest zadowalająca z wysoką oceną Z prime. Hamowanie interakcji HBX-DDB1 prowadzi do przywrócenia Smc5/6, co skutkuje supresją transkrypcji HPV, ekspresji białek i produkcji cccDNA. Ten nowy mechanizm działania przeciwwirusowego może przezwyciężyć niedoskonałości obecnych terapii HPV.
Interakcje białko-białko są ważną klasą celów leków. Opisany tutaj kwas na bazie rozszczepionej lucyferazy, który jest ukierunkowany na interakcje między białkami wirusa i hasS, może zapewnić nową strategię opracowywania leków na inne choroby zakaźne. Chociaż nasz protokół jest prosty i łatwy do zrozumienia, niektóre kroki mogą być trudne do odtworzenia bez wizualnej demonstracji.
Dlatego demonstracja wizualna będzie bardzo pomocna w zrozumieniu naszego protokołu. Zacznij od wysiewu komórek pięć razy od 10 do 5 HEK293T do 100-milimetrowego naczynia z 10 mililitrami DMEM i inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć po jednym mikrogramie plazmidów DNA wykazujących ekspresję HBx-LgBit i SmBit-DDB1 oraz buforu kondensacyjnego DNA do uzyskania łącznej objętości 300 mikrolitrów.
Dodaj 16 mikrolitrów roztworu wzmacniacza i mieszaj probówki, wirując przez jedną sekundę. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie dodać 60 mikrolitrów odczynnika do transfekcji. Wirować probówkę przez 10 sekund i inkubować próbkę przez kolejne osiem minut.
W międzyczasie odessaj pożywkę z naczynia z komórkami i umyj je pięcioma mililitrami PVS. Odessać PVS i dodać siedem mililitrów DMEM. Dodaj trzy mililitry DMEM do probówki z kompleksami transfekcyjnymi, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać, i dodaj mieszaninę do komórek.
Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla przez 10 godzin. Po inkubacji usuń zużytą pożywkę hodowlaną i umyj komórki pięcioma mililitrami PVS. Usuń PVS w jednym mililitrze 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby je odłączyć.
Następnie dodaj cztery mililitry DMEM i rozproszyć pożywkę, odpipetowując ją kilkakrotnie po powierzchni warstwy komórek, a następnie przenieś zawiesinę do probówki. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut, następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze PVS. Powtórzyć cetrifugację i odrzucić supernatant.
Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforowanej pożywki do hodowli komórkowej uzupełnionej 10% FBS do gęstości wysiewu miliona komórek na mililitr. Odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 godzin. Podczas inkubacji komórek rozcieńczyć związki przesiewowe i rozpuszczalnik do stężenia 13,5 X.
Dodaj 12,5 mikrolitra podłoża luminescencyjnego do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zmierz luminescencję linii bazowej za pomocą luminometru i natychmiast po tym dodaj pięć mikrolitrów związków i kontrolowanego DMSO do każdej studzienki. Mierz luminescencję co 30 minut przez dwie godziny, a następnie oblicz działanie hamujące związków w porównaniu z leczeniem DMSO.
Zmierzono wyjściowe sygnały luminescencji, a stosunek sygnału do tła obliczono jako większy niż 80. Liczba pierwsza Z była większa niż 0,5, co wskazuje, że ten system testów jest akceptowalny dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Ustalając próg na poziomie większym niż 40% inhibicji w porównaniu z kontrolą stosowaną wyłącznie przez DMSO, nitazoksanid został zidentyfikowany jako potencjalny lek.
Wcześniej zidentyfikowaliśmy nitazoksanid jako inhibitor interakcji HBX-DDB1 poprzez badanie przesiewowe biblioteki związków reaktywnych na małą skalę za pomocą tej metody. Stosując nitazoksanid, potwierdzamy to hamowanie interakcji HBX-DDB1, zmniejszenie transkrypcji wirusa i późniejsze poziomy produktu wirusowego. Optymalna porcja rozszczepionej lucyferazy połączonej z białkiem docelowym musi być wcześniej określona.
W tym przypadku HPX połączony z dużym bitem na końcu C HPX i DDB1 połączony z małym bitem na końcu DDB1 zapewnił najlepsze wyniki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę wykrywania środków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1, wykorzystując system testu z rozdzielną luciferase. Protokół umożliwia wykrywanie interakcji białko-białko w czasie rzeczywistym bez lizy komórkowej, ułatwiając odkrycie nowych środków terapeutycznych dla funkcjonalnego wyleczenia HPV.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Wirusologia
- Farmakologia
Tło
- Interakcja HBX-DDB1 jest niezbędna dla transkrypcji HPV z cccDNA.
- Obecne terapie HPV mają niedoskonałości, które ta metoda ma na celu rozwiązać.
- Przywrócenie Smc5/6 poprzez hamowanie HBX-DDB1 może tłumić transkrypcję HPV.
- System testu z rozdzielną luciferase zapewnia wysoki wynik Z prime dla jakości przesiewowej.
Cel badania
- Opracowanie metody identyfikacji inhibitorów interakcji HBX-DDB1.
- Ułatwienie odkrycia nowych środków terapeutycznych przeciwko HPV.
- Poprawa efektywności i jakości przesiewu w badaniach przeciwwirusowych.
Stosowane metody
- System testu z rozdzielną luciferase do wykrywania interakcji białko-białko.
- Monitorowanie interakcji w czasie rzeczywistym bez lizy komórkowej.
- Ocena jakości przesiewu przy użyciu wyniku Z prime.
- Ocena mechanizmów przeciwwirusowych ukierunkowanych na HBX-DDB1.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem wykrywa interakcję HBX-DDB1 w czasie rzeczywistym.
- Hamowanie HBX-DDB1 prowadzi do przywrócenia Smc5/6.
- Obserwowano tłumienie transkrypcji HPV i produkcji cccDNA.
- Podejście to może zapewnić nowy mechanizm działania przeciwwirusowego.
Wnioski
- Ta metoda oferuje obiecującą ścieżkę odkrywania nowych terapii przeciwko HPV.
- Adresuje ograniczenia istniejących leczeń poprzez ukierunkowanie na HBX-DDB1.
- Test z rozdzielną luciferase jest cennym narzędziem dla przyszłych badań przeciwwirusowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
