Name: Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Naucz się przygotowywać rozprzestrzeniające się chromosomy mejotyczne z spermatocytów Danio rerio. Ta metoda umożliwia wizualizację architektury chromosomów podczas profazy I przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Trentowi Newmanowi i Masudzie Sharifi za komentarze do manuskryptu oraz An Nguyenowi za pomoc w optymalizacji metod rozprzestrzeniania i barwienia chromosomów z mejocytów danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez NIH R01 GM079115 przyznany SMB.

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+Pairing%2C+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li>
<li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks%2C+synapsis%2C+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).</li>
<li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li>
<li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+recombination+in+human+males%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li>
<li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+studies+of+human+meiosis%3A+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at%2C+or+prior+to%2C+establishment+of+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075(2013).</li>
<li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442(2014).</li>
<li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+by+breaking+and+repairing%3A+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Journal%22%5BJournal%5D)">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li>
<li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li>
<li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).</li>
<li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+chiasmata+and+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li>
<li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li>
<li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy metody badania lokalizacji telomerów i białek związanych z chromosomami w rozprzestrzenianiu się powierzchni jądrowej ze spermatocytów wyizolowanych z jąder danio pręgowanego. Spodziewamy się, że metody te będą miały zastosowanie do analizy spermatocytów u innych gatunków teleostów z dostosowaniem do wielkości jądra.
Chociaż tylko kilka przeciwciał zostało podniesionych do białek mejotycznych danio pręgowanego, odnieśliśmy sukces przy użyciu następujących przeciwciał po...

Rozmnażanie płciowe przebiega poprzez połączenie dwóch haploidalnych gamet, z których każda zawiera połowę chromosomu komórki somatycznej. Mejoza to wyspecjalizowany podział komórki, który wytwarza haploidalne gamety poprzez jedną rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. W profazie I chromosomy homologiczne (homologi) muszą przejść parowanie, rekombinację i synapsę, z których ta ostatnia charakteryzuje się tworzeniem kompleksu synaptonemalnego, który składa się z dwóch osi homologu połączonych poprzecznym włóknem Sycp1 (ryc. 1A, B). Niewłaściwe wykonanie tych procesów może prowadzić do produkcji gamet aneuploidalnych, które są główną przyczyną poronień u ludzi1. Nasza wiedza na temat koordynacji między parowaniem, rekombinacją i synapsą została ułatwiona dzięki badaniom na szerokiej gamie organizmów, takich jak między innymi drożdże, C. elegans, myszy i Drosophila2. Podczas gdy ogólny proces parowania chromosomów homologicznych, po którym następuje segregacja, jest dobrze zachowany, jego zależność od rekombinacji i synapsy oraz kolejność tych zdarzeń są różne.
Powstawanie dwuniciowego pęknięcia mejotycznego (DSB), które inicjuje rekombinację homologiczną, występuje w pobliżu telomerów skupionych w bukiecie podczas leptotenu, a synapsa następuje wkrótce potem3,4. Ta konfiguracja tworzenia DSB i inicjacji synapsy jest również charakterystyczna dla męskiej mejozy u ludzi, ale nie u myszy5,6,7,8, co sugeruje, że danio pręgowany może służyć jako model ludzkiej spermatogenezy. Istnieje również kilka praktycznych zalet badania mejozy danio pręgowanego. Zarówno samce, jak i samice przechodzą gametogenezę przez całe dorosłe życie, ich gonady są łatwo dostępne, a z jednej krzyżówki powstają setki potomstwa. Dodatkowo zarodki są przezroczyste i rozwijają się zewnętrznie, co ułatwia wczesne wykrycie aberracji w rozwoju embrionalnym spowodowanych aneuploidalnymi gametami3,9. Wadą stosowania danio pręgowanego jest to, że powoli osiągają dojrzałość płciową (~60 dni), a ilość materiału potrzebnego do rozprzestrzeniania się na powierzchni jądrowej należy zebrać od ~10-20 dorosłych zwierząt, w zależności od ich wielkości.
Preparaty do rozprzestrzeniania się chromosomów mejotycznych są niezbędnym narzędziem do badania dynamiki chromosomów we wszystkich organizmach modelowych, ponieważ można badać kluczowe sygnatury dynamiki chromosomów mejotycznych. U danio pręgowanego kluczowe aspekty postępu programu mejotycznego i organizacji jądrowej zostały przeanalizowane poprzez sondowanie rozprzestrzeniania się powierzchni jądrowej, określane tutaj jako rozprzestrzenianie się chromosomów, z przeciwciałami do immunofluorescencyjnego wykrywania białek i/lub kwasów nukleinowych przez FISH3,4,9,10,11,12. Rzeczywiście, spolaryzowana lokalizacja skupionych telomerów w bukiecie może być zachowana w preparacie do smarowania (ryc. 1C). Ostatnio wykorzystaliśmy rozprzestrzenianie się chromosomów spermatocytów danio pręgowanego wraz z metodami wykrywania fluorescencji i mikroskopią superrozdzielczą, aby wyjaśnić szczegółową progresję dynamiki telomerów danio pręgowanego, homologicznego parowania chromosomów, lokalizacji pęknięć dwuniciowych i synapsy w kluczowych przejściach mejotycznych3. W tym miejscu przedstawiamy metody przygotowania rozsiewów chromosomowych ze spermatocytów jąder danio pręgowanego, a następnie barwienia ich sondami fluorescencyjnego peptydu z kwasami nukleinowymi (PNA) do powtarzania sekwencji telomerów i wykrywania immunofluorescencji białek związanych z chromosomami.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml Dostępnych</td><td></td><td></td><td>jest kilka marek komercyjnych</td></tr><tr><td>Stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Dostępnych</td><td></td><td></td>jest kilka marek komercyjnych</tr><tr><td>16% formaldehydu, bez metanolu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 ml</td> Dostępnych <td></td><td></td>jest <td>kilka marek komercyjnych</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 50 mm</td><td>Corning</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>VWR International</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>363696</td><td></td></tr><tr><td>Torba do autoklawu</td><td>Dostępnych</td><td></td> jest kilka marek komercyjnych <td>Służy do produkcji plastikowych szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe, 100 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M koza anty-kurczak IgY (H + L), wysoce adsorbowany krzyżowo</td><td>Biotium</td><td>203775-500uL</td><td>Użyj w 1:1000</td></tr><tr><td>Kurczak anty-zfSycp1</td><td>Generowany przez laboratorium Burgess</td><td>Nie</td><td>dotyczy Użyj w 1:100</td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Słoik Coplin</td><td>Kilka dostępne</td><td></td><td></td>marki handlowe</tr><tr><td>DNaza I, stopień II z trzustki bydlęcej</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Do preparowania jąder wymagane są dwa.</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf, 5 ml</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-kurczaka IgY (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>Stosować w stosunku 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe przeciw kurczakom IgY (H+L) kozie, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>Stosować w 1:1000</td></tr><tr><td>Kozia anty-hDMC1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8973</td><td>Nie działa w naszych rękach</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>Użyj w 1:1000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L), Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>Użyj w 1:1000</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>Piec hybrydowy</td><td>VWR International</td><td>230401V (model 5420)</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model Classic C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Używany do komory wilgotnościowej</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td></td> Dostępnych <td></td><td>jest kilka marek komercyjnych</td><td>Każdy standardowy mikroskop zdolny do powiększenia co najmniej ~1,65X jest wystarczający.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-chomikSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Nie działa w naszych rękach</td></tr><tr><td>Mysz anty-hMLH1</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>Nie działa w naszych rękach</td></tr><tr><td>Mysz anty-hRPA</td><td>Sigma-Alrich</td><td>MABE285</td><td>Nie działa w naszych rękach</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &middot; 7 H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>roztwór Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe</td><td>Dostępnych</td><td></td><td></td>jest kilka marek komercyjnych</tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>Przygotuj zgodnie z wymaganiami producenta s instrukcje.</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>Przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Anti-Fade</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>ProLong, Diamond, Anti-Fade, Mountant z DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-hRPA</td><td>Bethyl</td><td>A300-244A</td><td>Użyj w 1:300</td></tr><tr><td>Królik anty-hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>Użyj w 1:200</td></tr><tr><td>Królik anty-hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>Użyj o 1:300</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Nożyczki Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Supercut, kąt 30&, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-353</td><td>Można również użyć dowolnej pary małych nożyczek.</td></tr><tr><td>Zestaw</td><td>Sylgard Fisher Scientific</td><td>NC9897184</td><td>Przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Triton X-100 tworzy osad po rozcieńczeniu w wodzie; Osad rozpuszcza się w ciągu nocy.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003708</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td>Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - 4 mm (mikronożyczki)</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Mejoza jest kluczowym procesem komórkowym wymaganym do tworzenia haploidalnych gamet do rozmnażania płciowego. Organizmy modelowe odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu zdarzeń chromosomowych, które zachodzą podczas profazy mejotycznej, w tym zdarzeń parowania, synapsy i rekombinacji, które zapewniają prawidłową segregację chromosomów. Chociaż mysz była ważnym modelem dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów, nie wszystkie zdarzenia mejotyczne w tym systemie są analogiczne do mejozy u ludzi. Niedawno zademonstrowaliśmy ekscytujący potencjał danio pręgowanego jako modelu ludzkiej spermatogenezy. Tutaj szczegółowo opisujemy nasze metody wizualizacji chromosomów mejotycznych i związanych z nimi białek w preparatach do rozprzestrzeniania chromosomów. Preparaty te mają tę zaletę, że umożliwiają analizę struktur chromosomowych w wysokiej rozdzielczości. Najpierw opisujemy procedurę preparowania jąder od dorosłego danio pręgowanego, a następnie dysocjacji komórek, lizy i rozprzestrzeniania chromosomów. Następnie opisujemy procedurę wykrywania lokalizacji mejotycznych białek chromosomowych przez detekcję immunofluorescencyjną i sekwencje kwasów nukleinowych przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Techniki te stanowią użyteczny zestaw narzędzi do cytologicznej analizy architektury chromatyny mejotycznej w systemie danio pręgowanego. Naukowcy zajmujący się społecznością danio pręgowanego powinni być w stanie szybko opanować te techniki i włączyć je do swoich standardowych analiz funkcji rozrodczych.

Opisaliśmy metodę przygotowania i wizualizacji preparatów rozproszonych spermatocytów ryby zebrafish. Prawidłowo przeprowadzona procedura pozwala uzyskać dobrze rozproszone, nienakładające się jądra komórkowe. Aby odzyskać takie jądra, istotne jest zastosowanie odpowiedniej ilości materiału wyjściowego (tj. jąder), poddanie jąder działaniu trypsyny przez wystarczająco długi czas oraz przeprowadzenie odpowiedniej liczby inkubacji z DNaza I. Takie preparaty rozproszone mogą być następnie ba...

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Danio pręgowany staje się doskonałym modelem kręgowców do badania zdarzeń chromosomowych mejozy, w tym parowania chromosomów homologicznych, synapsy i rekombinacji. Ten protokół rozprzestrzeniania się powierzchni jądrowej umożliwił nam wizualizację kluczowych cech architektury chromosomów mejotycznych za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Naukowcy mogą spodziewać się setek dobrze rozrzuconych jąder na szkiełku z mniejszą ilością zanieczyszczeń niż w przypadku innych protokołów rozprzestrzeniania się danio pręgowanego.Najtrudniejszą technicznie częścią tej procedury jest sekcja jąder danio pręgowanego, ponieważ znajduje się on w bliskiej odległości od skóry i jest również przyczepiony do innych narządów. Wizualizacja procedury preparacji pozwoli naukowcom wiedzieć, czego się spodziewać, gdy zobaczą gonadę osadzoną w tkance zwierzęcia. Po eutanazji samców danio pręgowanego odcinaj głowę jednej ryby na raz małymi nożyczkami, a następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, aby odsłonić jamę ciała.Umieść rybę na pokrytej silikonem szalce Petriego i przykryj płytką kałużą 1X PBS. Pod mikroskopem przy powiększeniu 1,65x wypreparuj jądra za pomocą

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-zebrafish-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku...

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Opisano protokół przygotowania wysokiej jakości rozsiewów mitotycznych chromosomów roślinnych metodą szybkiego upuszczania na sucho, odpowiednią do wykrywania FISH pojedynczych i wysokokopijnych sond DNA.

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Naucz się przygotowywać rozprzestrzeniające się chromosomy mejotyczne z spermatocytów Danio rerio. Ta metoda umożliwia wizualizację architektury chromosomów podczas profazy I przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów