Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych
7 maja 2020
Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.
Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodologię przygotowania i postępowania z tkanką mięśniową w warunkach przedklinicznych i badaniach klinicznych, co jest ważne dla uzyskania wiarygodnych wyników w dziedzinie DMD. Techniki te są istotne dla prób pomijania eksonów w przypadku DMD. Główną zaletą jest to, że są one dobrze ugruntowane i powtarzalne, jeśli są przeprowadzane wspólnie.
Techniki te koncentrują się głównie na pomijaniu eksonów w DMD, ale po zmianie starterów te same techniki można zastosować do innych chorób leczonych terapiami splicingowymi. Metody te można wykorzystać do osiągnięcia wydajności pomijania eksonów zarówno RNA, jak i białka. Aby przygotować próbkę do analizy, najpierw wymieszaj równe objętości gumy tragakantowej i wody, aż guma stanie się miękka i lepka.
Załaduj tę mieszaninę do 25-mililitrowych strzykawek i dozuj od 0,5 do jednego centymetra gumy na poszczególne krążki korkowe. Oznacz krążki po przeciwnej stronie i umieść pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie, aż część płynu zamarznie. Umieść każdą próbkę w gumie tragakantowej na krążkach z osią podłużną każdego mięśnia prostopadłą do korka.
Umieść gumę na dnie każdego mięśnia, aby pomóc utrzymać mięsień na miejscu, i użyj pęsety, aby zamrozić próbki w zimnym izopentanie. Przesuwaj próbki w sposób ciągły przez jedną minutę lub do całkowitego zamrożenia przed tymczasowym umieszczeniem ich na suchym lodzie. Następnie umieść próbki w szklanych fiolkach do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Aby przeciąć zamrożoną tkankę mięśniową do analizy, ustaw kriostat na temperaturę roboczą 25 stopni Celsjusza i zamontuj blok mięśniowy na uchwycie. Przytnij blok tkanki, aż uzyskasz płaskie sekcje. W przypadku PCR z odwrotną transkryptazą i analizy Western blot należy uzyskać plastry o grubości 10 mikrometrów.
Do analizy immunohistochemicznej należy uzyskać plastry o grubości od sześciu do ośmiu mikrometrów, a do barwienia hematoksyliną i eozyną należy uzyskać plastry o grubości od 10 do 12 mikrometrów. Po ich nabyciu umieść pokrojone kawałki w dwóch mililitrowych tubkach. Przechowuj próbki do PCR i western blot w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Pokazano tu system elektroforezy mikroczipowej, żelowe obrazy reakcji PCR z odwrotną transkryptazą oraz wyniki sekwencjonowania pominiętego pasma od dwóch pacjentów przed i po leczeniu oligonukleotydem antysensownym w pierwszej fazie badania ze zwiększaniem dawki. U obu pacjentów występują delecje. Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem obaj pacjenci nie wykazywali przeskakiwania i można było uwidocznić tylko niepominiętą opaskę.
Po 12 tygodniach leczenia u drugiego pacjenta uwidoczniono wyraźne pominięte dolne pasmo, jednak nadal trudno było wykryć jakikolwiek pominięty produkt u pierwszego pacjenta. Wyniki sekwencjonowania wykazały konkatenację eksonów 47 i 54 u drugiego pacjenta oraz eksonów 44 i 54 u pierwszego pacjenta. Aby obliczyć procent pominiętych pasm, stężenie molowe dla pominiętego pasma zostało podzielone przez pominięte i niepominięte pasma.
Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem Western blot nie wykryto pasma dystrofiny. Po leczeniu wykryto prążek u drugiego pacjenta o mniejszej masie cząsteczkowej w porównaniu z obserwowaną u zdrowej grupy kontrolnej. Pierwszy pacjent nie wykazywał jednak wykrywalnych poziomów dystrofiny po leczeniu.
Bardzo ważne jest, aby prawidłowo obchodzić się z tkanką mięśniową i konsekwentnie umieszczać każdą próbkę na gumie tragakantowej. Skrawki tkanek mogą być analizowane na wiele różnych sposobów, w tym sztucznie do PCR, cyfrowego PCR, Western blot, immunohistochemii i z różnymi rodzajami omiki. Techniki te mogą być przyspieszone, rozwój, dodatkowe leki pomijające eksony ukierunkowane na różne eksony i mogą być stosowane do rozwoju opartych na wirusach i ponownie w edycji DMD.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowaną metodologię przygotowania i obróbki tkanki mięśniowej w badaniach klinicznych związanych z dystrofią mięśniową Duchenne'a (DMD). Koncentracja została położona na technikach pomijania egzonów, które mają kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych terapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania kliniczne
Wstęp
- Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężką chorobą prowadzącą do zaniku mięśni.
- Pomijanie eksonów jest obiecującym podejściem terapeutycznym w leczeniu DMD.
- Niezawodne obchodzenie się z tkankami jest niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników eksperymentalnych.
- Ustandaryzowane metody mogą zwiększyć powtarzalność badań.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego protokołu przygotowania tkanki mięśniowej.
- Ułatwienie prób pomijania eksonów w przypadku DMD.
- Zapewnienie ram metodycznych możliwych do zastosowania w innych chorobach leczonych terapiami splicingowymi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie tkanki mięśniowej z wykorzystaniem gumy tragakantowej i izopentanu.
- Mrożenie i krojenie próbek mięśni do analizy.
- RT-PCR i Western blotting w celu wykrycia ekspresji dystrofiny.
- Sekwencjonowanie w celu analizy wydajności pomijania eksonów.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja pominiętych prążków u pacjentów poddanych leczeniu.
- Wykrycie dystrofiny u jednego pacjenta po leczeniu.
- Zmienność odpowiedzi na leczenie pomiędzy pacjentami.
- Podkreślenie znaczenia spójnej obróbki tkanek dla uzyskania dokładnych wyników.
Wnioski
- Znormalizowane metody są kluczowe dla rozwoju terapii DMD.
- Pomijanie eksonów wykazuje potencjał, lecz wymaga dalszej optymalizacji.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Przemysłowe znaczenie praktyczne
Niniejszy protokół ustanawia standaryzowany schemat oceny wydajności pomijania eksonów w próbkach pochodzących od pacjentów z DMD, co bezpośrednio wspiera walidację celu w procesie opracowywania oligosunukleotydów antysensownych. Umożliwiając ilościowy pomiar przywrócenia funkcji molekularnej, pozwala on na mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku terapii pomijania eksonu 53, takich jak viltolarsen. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w translacji z fazy przedklinicznej do klinicznej poprzez powiązanie odczytów biochemicznych z mechanizmem terapeutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie pomijania eksonów za pomocą oligonukleotydów antysensownych jako hipotezy terapeutycznej w próbkach pochodzących od pacjentów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne metody sekwencjonowania metodą Sangera, RT-PCR oraz Western blot w celu potwierdzenia docelowej aktywności molekularnej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wyznaczenie ilościowych stosunków pasm pominiętych do całkowitych w celu oceny zależności dawka-odpowiedź w kontekście efektywności pomijania eksonów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły przygotowania i krojenia tkanek, aby zapewnić powtarzalność analizy w zestawach próbek przedklinicznych i klinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera analizę systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez charakteryzację przywrócenia dystrofiny w rzeczywistych biopsjach mięśni pacjentów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki zastosowaniu spójnych odczytów molekularnych w różnych systemach modelowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – zapewniając molekularne potwierdzenie mechanizmu przed testami skuteczności funkcjonalnej.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza korekcję splicingu eksonów w celowanych obszarach w próbkach pacjentów, wspierając walidację hipotez dotyczących oligonukleotydów antysensownych.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe wartości procentowe pominięcia eksonów za pomocą obrazowania żeli i sekwencjonowania, umożliwiając porównanie związków.
- Analityka: Zapewnia kwantyfikację pasm pominiętych w oparciu o stężenie molowe dla analiz porównawczych pomiędzy różnymi dawkami i pacjentami.
- Badania translacyjne: Łączy molekularne pominięcie eksonu z detekcją białka dystrofiny, łącząc mechanizm na poziomie RNA z wynikiem na poziomie białka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku schemat przygotowania i analizy tkanek, który można zastosować w przypadku wielu celów eksonowych i terapii splicingu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez bezpośrednią wizualizację pomijania eksonów i przywrócenia dystrofiny w tkance ludzkiej.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane zatapianie w gumie tragakantowej i kriosekcjonowanie zapewniają spójność próbek i redukują zmienność.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając dowodów molekularnych na zaangażowanie celu przed osiągnięciem punktów końcowych funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację oligonukleotydów antysensownych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efektywność pomijania eksonów w odpowiednich genotypach pacjentów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach biologii molekularnej, w tym RT-PCR, Western blotting oraz sekwencjonowania metodą Sangera.
- Zależne od dostępności kriostatu do przygotowywania skrawków tkanek oraz ciekłego azotu/izopentanu do szybkiego mrożenia.
- Wymaga stosowania ustandaryzowanych protokołów postępowania z tkanką w celu zachowania integralności próbek w różnych ośrodkach lub punktach czasowych.
- Przy projektowaniu starterów do wykrywania pomijania eksonów należy uwzględnić zmienność mutacji specyficznych dla pacjentów.
- Ograniczone przez półilościowy charakter metod opartych na elektroforezie żelowej bez walidacji za pomocą cyfrowego PCR lub elektroforezy kapilarnej.
