Name: Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj standaryzowaną metodologię przygotowania tkanki mięśniowej w badaniach klinicznych DMD. Techniki pomijania eksonów umożliwiają analizę ekspresji dystrofiny metodami PCR i Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Dr Takashi Saito, Dr Tetsuya Nagata, Panu Satoshi Masuda i Dr Eri Takeshita za naukową dyskusję.

<ol><li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy%2C+part+2%3A+implementation+of+multidisciplinary+care%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li>
<li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li>
<li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li>
<li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients%3A+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li>
<li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug%3A+Implications+for+FDA+Policy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li>
<li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065%2FNCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li>
<li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+%28Pre-%29Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).</li>
<li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).</li>
</ol>

Badania kliniczne nad DMD przyniosły zarówno sukcesy, jak i porażki w ciągu ostatnich kilku lat. Zarówno RT-PCR, jak i western blot są powszechnymi technikami oceny skuteczności pomijania generowanej przez związki pomijające egzony podawane pacjentom. Stwierdzono jednak, że RT-PCR przeszacowuje skuteczność pomijania w porównaniu z cyfrowym PCR15. Chociaż wynika to z wielu powodów, jest to spowodowane przede wszystkim bardziej efektywną amplifikacją mniejszych, pominiętych fragmentów podczas cykli PCR. Wydaje się, że RT-PCR zastosowany w tym badaniu klinicznym generował również wyższą skuteczność pomijania w porównaniu z ekspresją białka oszacowaną przez western blotting. Według FDA jest to bardziej wiarygodny sposób ilościowego określenia odbudowy dystrofiny12. W związku z tym należy zachować ostrożność podczas interpretacji wyników pomijania RT-PCR; Próbki można jednak nadal porównywać. Próbki wykazujące wyższą skuteczność pomijania na podstawie wyników RT-PCR często wykazują wyższe poziomy ekspresji białka w analizach western blot.
Ponieważ nie wszyscy pacjenci w badaniach klinicznych z DMD mają ten sam wzorzec delecji, zaprojektowanie starterów i sond, które są odpowiednio specyficzne do przeprowadzenia digital lub qPCR na wszystkich próbkach, może być trudne. W związku z tym RT-PCR jest nadal dobrą alternatywą dla pierwszej oceny skuteczności pomijania. Przed rozpoczęciem badania klinicznego NS-065/NCNP-01 ocena skuteczności pomijania dla każdego pacjenta in vitro była żmudna, ponieważ biopsja mięśni lub skóry była obowiązkowa w celu wytworzenia mioblastów specyficznych dla pacjenta. Jednak niedawno opublikowaliśmy nową technikę generowania specyficznych dla pacjenta komórek pochodzących z moczu (UDC) przekształconych w MYOD1 jako nowego modelu komórek mięśniowych DMD16. W związku z tym do wytworzenia mioblastów wymagany jest tylko mocz pobrany od pacjenta i nie jest konieczna żadna inwazyjna procedura. Uważamy, że ta metoda może być stosowana do badań przesiewowych różnych AON w komórkach specyficznych dla pacjenta. Co więcej, różne startery i sondy mogą być testowane przed rozpoczęciem przez pacjenta jakiegokolwiek badania klinicznego. Może to ułatwić w przyszłości stosowanie qPCR lub digital PCR do pomiaru z pominięciem eksonów w badaniach klinicznych DMD.
Do przeprowadzenia analizy western blot w tym badaniu klinicznym użyto pojedynczego przeciwciała przeciwko dystrofinie, a jako próbkę referencyjną użyto tylko jednej zdrowej grupy kontrolnej. W związku z tym swoistość przeciwciała nie została odpowiednio zwalidowana. To, wraz z faktem, że przeciwciało rozpoznaje tylko C-końcową domenę dystrofiny, jest ograniczeniem protokołu. W przyszłości wskazane są zdrowsze grupy kontrolne i przeciwciała skierowane przeciwko różnym domenom cząsteczki dystrofiny.
Tutaj podsumowaliśmy protokoły, które zostały użyte w niedawnym badaniu eksploracyjnym zainicjowanym przez badaczy, pierwszym badaniu NS-065 / NCNP-01 na ludziach. NS-065/NCNP-01 ma potencjalnie zastosowanie do 10,1% pacjentów z DMD.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, powodującą postępującą utratę masy mięśniowej, niewydolność oddechową i kardiomiopatię, która prowadzi do przedwczesnej śmierci1. Choroba jest spowodowana brakiem dużego strukturalnego białka mięśniowego dystrofiny2. Mutacje w genie DMD na chromosomie X są recesywne, a choroba dotyka 1 na 3500-5000 nowonarodzonych mężczyzn3,4,5. Mutacje są często dużymi delecjami w obszarze hotspotu między eksonami 44 i 55, które prowadzą do zniekształconej ramki odczytu i przedwczesnych kodonów stop, powodując rozpad za pośrednictwem nonsensu i prawie całkowity brak białka dystrofiny6,7,8. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów i przywracają ramkę odczytu, częściowo przywracając ekspresję dystrofiny i opóźniając postęp choroby9,10,11. Morfolino AON eteplirsen, który został niedawno zatwierdzony przez Federalną Agencję Leków (FDA), indukuje pomijanie eksonu 51 i może przywrócić ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 5212,13. Jednak pomijanie eksonu 53 przywraca ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52 i może potencjalnie leczyć około 10% pacjentów z DMD14. Wykazano, że lek morpholino AON NS-065/NCNP-01 indukuje przeskakiwanie eksonu 53 w komórkach ludzkich, a ostatnio podaliśmy NS-065/NCNP-01 pacjentom z DMD w otwartym badaniu klinicznym fazy 1 ze zwiększaniem dawki (zwanym dalej "badaniem") (zarejestrowanym jako UMIN: 000010964 i ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Badanie wykazało zależny od dawki wzrost pomijania eksonu 53 w oparciu o RT-PCR i poziomy białka dystrofiny w oparciu o western blotting, a także nie zaobserwowano żadnych poważnych zdarzeń niepożądanych ani rezygnacji z leczenia14.
We wszystkich badaniach klinicznych analiza wyników ma ogromne znaczenie. W przypadku badań klinicznych nad DMD nadal trwa debata na temat najlepszej metody wykazania korzyści z leczenia. Testy kliniczne, takie jak test 6-minutowego marszu, mają pewne wady. Molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny można przeprowadzić przy użyciu kilku metod, takich jak RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting i immunohistochemia. Jednak zakres przywrócenia ekspresji białek, który jest wymagany do uzyskania korzyści klinicznych, pozostaje niejasny. W tym artykule szczegółowo opisujemy metody RT-PCR i western blot stosowane do określania odpowiednio pomijania eksonów i poziomów białka w badaniu fazy 1 leku z pominięciem AON NS-065/NCNP-0114.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Takara</td><td>3407A</td><td>Roztwór markerowy do</td></tr><tr><td>roztworu buforowego MultiNA 1mol / l-Tris-HCl (pH 7,6)</td> <td>Nacalai</td><td>35436-01</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Nacalai</td><td>21418-42</td><td></td></tr><tr><td>2-metylobutan (izopentan)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>15-2220</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6 i razy; Bufor ładujący</td><td>Takara</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza ME</td><td>Iwai chemiczny</td><td>50013R</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 3730 Analizator DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>A41046</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cyklu</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej rozwiązanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Nacalai</td><td>05808-61</td><td></td></tr><tr><td>Centri-Sep 96-dołkowe płytki</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367819</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący ECL Prime</td><td>GE opieka zdrowotna</td><td>RPN418</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania blottingu ECL Prime Medyczny</td><td></td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>GE Endo-Porter</td><td>GeneTools</td><td>2922498000</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automatyczna stacja elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>7007010</td><td>System elektroforezy mikroprocesorowej Zestaw</td></tr> do <tr><td>analizy DNA 1K Experion na 10 chipów</td><td>Bio-Rad</td><td>7007107JA</td><td></td></tr><tr><td>Experion Stacja zalewania</td><td>Bio-Rad</td><td>7007030</td><td></td></tr><tr><td>Experion Vortex Station II</td><td>Bio-Rad</td><td>7007043</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna o bardzo grubej plamie</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>EzBlot</td><td>Atto</td><td>AE-1460</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Żel z kwasami nukleinowymi Bejca</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>szklana fiolka</td><td>Iwaki</td><td>1880 SV20</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Nacalai</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Histofine Prosta plama MAX PO</td><td>Nichirei</td><td>424151</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrana transferowa</td><td>Millipore</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>ITS Płynny suplement mediów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>SHIMADZU</td><td>MCE-202</td><td>System elektroforezy mikrochipowej B</td></tr><tr><td>Wielopłytkowe 96-dołkowe płytki do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>mlp9601</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektrofotometr UV-Vis z mikroobjętością Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne Dystrofina (C-koniec)</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-DYS2</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM Liofilizowane mysie przeciwciało monoklonalne Spectrin</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-SPEC1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 3-8% tris-acetatowe żele białkowe</td><td>Invitrogen</td><td>EA03785BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Przeciwutleniacz</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Próbka Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki</td><td>Invitrogen</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Bufor do biegania</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>Wilga Fluorescencyjny barwnik żelowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1610496</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizowany</td> <td>roztwór penicyliny-streptomycynySigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Physcotron Poręczny mikrohomogenizator</td><td>MICROTEC</td><td>NS-310E3</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia jodku propidium</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN OneStep Zestaw RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini zestaw do tkanek włóknistych</td><td>Qiagen</td><td>74704</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Nacalai</td><td>31606-75</td><td></td></tr><tr><td>Półsucha maszyna transferowa</td><td>Bio Craft</td><td>41-1293</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasami nukleinowymi</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td> do buforu <td>MultiNA</td></tr><tr><td>TAE</td><td>Nacalai</td><td>35430-61</td><td></td></tr><tr><td>Guma tragakantowa</td><td>Wako</td><td>200-02245</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Bufor</td><td>Nippon Gen</td><td>316-90025</td><td>dla MultiNA</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Nacalai</td><td>35907-15</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Żel i system czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z dmd w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest chorobą zwyrodnieniową mięśni, która powoduje postępującą utratę masy mięśniowej, prowadząc do przedwczesnej śmierci. Mutacje często powodują zniekształconą ramkę odczytu i przedwczesne kodony stop, co skutkuje prawie całkowitym brakiem białka dystrofiny. Ramkę odczytu można skorygować za pomocą oligonukleotydów antysensownych (AON), które indukują przeskakiwanie eksonów. Wykazano, że morpholino AON viltolarsen (nazwa kodowa: NS-065/NCNP-01) indukuje przeskakiwanie eksonu 53, przywracając ramkę odczytu u pacjentów z delecjami eksonu 52. Niedawno podaliśmy NS-065 / NCNP-01 dożylnie pacjentom z DMD w eksploracyjnym badaniu NS-065 / NCNP-01 zainicjowanym przez badacza, pierwszym na ludziach. W tym artykule przedstawiono molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny przy użyciu sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blotting w badaniu klinicznym. Charakterystyka ekspresji dystrofiny miała zasadnicze znaczenie w badaniu dla wykazania skuteczności, ponieważ nie przeprowadzono żadnych funkcjonalnych testów wyników.

W celu wykrycia pomijania eksonów za pomocą RT-PCR zaprojektowano i oceniono primery znajdujące się po obu stronach eksonu, który ma zostać pominięty, tak aby uzyskiwały one wyłącznie specyficzne prążki (schemat pomijania eksonów i położenia primerów przedstawiono na Ryc. 2). Primery powinny generować produkty, które można łatwo rozróżnić pod względem wielkości w systemie MCE lub za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym, jeśli MCE jest niedostępne. Na Ryc. 3a przedstawiono obrazy żeli z systemu MCE dla reakcji RT-PCR oraz wyniki sekwencjonowania prążka pominiętego u pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu preparatem NS-065/NCNP-01 w fazie 1 badania z eskalacją dawki. Pacjenci NS-03 i NS-07 posiadają delecje obejmujące odpowiednio eksony 45-52 oraz 48-52. Pacjent NS-03 otrzymywał 5 mg/kg, a pacjent NS-07 20 mg/kg NS-065/NCNP-01 raz w tygodniu przez 12 tygodni. Zgodnie z przewidywaniami, przed leczeniem u obu pacjentów nie stwierdzono pomijania, a widoczny był jedynie prążek niepominięty. Po 12 tygodniach leczenia u pacjenta NS-07 zaobserwowano wyraźny, niższy prążek pominięty. Jednak w przypadku pacjenta NS-03 nadal trudno było wykryć jakikolwiek produkt pominięty. Wyniki sekwencjonowania wykazały konkatenację eksonów 47 i 54 dla NS-07 oraz eksonów 44 i 54 dla NS-03. Zgodnie z sekwencją, mogłoby to teoretycznie prowadzić do powstania funkcjonalnej, ale skróconej izoformy dystrofiny. Aby obliczyć procent pomijania przedstawiony na Ryc. 3b, stężenie molowe prążka pominiętego podzielono przez sumę stężeń prążka pominiętego i niepominiętego. Dla pacjenta NS-07 odsetek po leczeniu wyniósł 72%, a dla NS-03 3,4%. Dane z analizy Western blot (wykonanej w trzech powtórzeniach) dla pacjentów NS-03, NS-07 oraz zdrowej kontroli przedstawiono na Ryc. 4a. Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem nie wykryto prążka dystrofiny. Po leczeniu u pacjenta NS-07 wykryto prążek o niższej masie cząsteczkowej w porównaniu do zdrowej kontroli (dystrofina typu dzikiego ma masę cząsteczkową 427 kDa, natomiast dystrofina u pacjenta NS-07 ma masę cząsteczkową 389 kDa). Ze względu na delecję i pomijanie eksonów, izoforma dystrofiny u pacjenta NS-07 była pozbawiona kilku eksonów, co skutkowało spodziewaną niższą masą cząsteczkową. U pacjenta NS-03 po leczeniu nie stwierdzono wykrywalnych poziomów dystrofiny. Na Ryc. 4b przedstawiono ilość dystrofiny u pacjenta NS-07 w porównaniu do zdrowej kontroli. Miejsca, w których mierzono intensywność sygnału w celu obliczenia stopnia przywrócenia dystrofiny, zaznaczono niebieskimi kwadratami. Do obliczenia ilości dystrofiny w stosunku do zdrowej kontroli wykorzystano stosunek dystrofiny do spektryny. W tym celu sygnał z dystrofiny pomniejszony o tło podzielono przez sumę dwóch izoform spektryny (długiej i krótkiej) pomniejszoną o tło (patrz krok 8.6.5). Stosunek dla zdrowej kontroli ustalono na 100%. Ilość dystrofiny u pacjenta NS-07 po leczeniu w porównaniu do zdrowej kontroli wyniosła 9,1%. Jednak w przypadku pacjenta NS-03 nie można było obliczyć wartości procentowej ze względu na słaby prążek dystrofiny, podobny do tych uzyskanych w próbkach sprzed leczenia dla obu pacjentów.
<img alt="Równowaga statyczna; schemat układu do transferu na membranę PVDF; analiza transferu białek; elektroforeza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny rysunek układu transferowego do analizy western blot. Przedstawiono montaż układu transferowego western blot: na dole znajduje się papier do transferu nasączony buforem do transferu A, następnie papier do transferu nasączony buforem do transferu B, membrana PVDF, żel Tris-Acetate 3-8%, a na górze dwa papiery do transferu nasączone buforem do transferu C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces pomijania eksonu 53, schemat PCR, konwersja pre-mRNA do mRNA, analiza genetyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat pomijania eksonu 53 u pacjenta z delecją eksonów 45-52 w genie DMD. Na przykład pacjent NS-03 w badaniu klinicznym z eskalacją dawki posiadał tę delecję. Jeśli ekson 53 zostanie zachowany, mRNA będzie miało przesuniętą ramkę odczytu, ponieważ złącze ekson-ekson między eksonem 44 a 53 zaburza ramkę odczytu, co powoduje powstanie kodonu stop w eksonie 53. Ramka odczytu zostaje przywrócona, gdy ekson 53 zostanie pominięty, co prowadzi do produkcji krótszej izoformy dystrofiny. Aby wykryć pominięcie eksonu 53 za pomocą RT-PCR, stosuje się primery w eksonie 44 i 54, tak aby produkt PCR mRNA z pominiętym i niepominiętym eksonem można było łatwo rozróżnić. FWD: primer forward, REV: primer reverse, PMO: oligomer fosforodiamidatowy morfolino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki RT-PCR i sekwencja mRNA; wykres przedstawia pominięcie eksonu w próbkach traktowanych i nietraktowanych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Efektywność pominięcia dla pacjentów NS-03 i NS-07 w próbkach z biopsji mięśnia piszczelowego przedniego. a) Obraz żelu uzyskany za pomocą systemu elektroforezy A dla próbek RT-PCR z tkanek nietraktowanych i traktowanych pacjentów NS-03 i NS-07. Panel górny przedstawia pacjenta NS-03, a panel dolny pacjenta NS-07 w trzech powtórzeniach. Dla NS-03 prążek bez pominięcia ma wielkość 422 bp, a prążek z pominięciem 212 bp. Dla NS-07 prążki mają odpowiednio 836 bp i 624 bp. Analiza sekwencji wykazała połączenie eksonu 44 z eksonem 54 dla NS-03 oraz eksonu 47 z eksonem 54 dla NS-07. b) Efektywność pominięcia przed i po leczeniu dla pacjentów NS-03 i NS-07, obliczona na podstawie stężenia molowego dwóch prążków podanego przez system A jako prążek z pominięciem/(prążek z pominięciem + prążek bez pominięcia) x 100. Efektywność pominięcia dla NS-03 po leczeniu była bardzo niska; dla NS-07 efektywność pominięcia przekroczyła 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy, prążki białkowe, pacjent w porównaniu z kontrolą zdrową, analiza dystrofiny, obraz żelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilościowe oznaczenie białka izoform dystrofiny przed i po terapii pomijania eksonów. a) Ilościowe oznaczenie białka izoform dystrofiny przed i po terapii pomijania eksonów. Western blot biopsji mięśnia piszczelowego przedniego od pacjentów NS-03 i NS-07 przed i po leczeniu oraz od zdrowej kontroli w trzech powtórzeniach. Dystrofinę można zaobserwować przy 427 kDa dla zdrowej kontroli i przy 389 kDa dla pacjenta NS-07 po leczeniu. U żadnego z pacjentów przed leczeniem nie wykryto dystrofiny, podobnie jak u pacjenta NS-03 po leczeniu. Obszar w czarnej ramce przedstawiono na Rycynie 4b. Po lewej stronie każdego blotu widoczny jest marker. b) Ilość przywróconej dystrofiny po leczeniu u pacjenta NS-07. Przywrócenie dystrofiny obliczono na podstawie intensywności prążków dla dystrofiny, tła oraz długiej i krótkiej izoformy spektryny według wzoru: (dystrofina - tło)/(spektryna L - tło) + (spektryna S - tło), gdzie stosunek dla zdrowej kontroli ustalono na 100%. Intensywność każdego prążka mierzono wewnątrz niebieskich ramek przedstawionych na rycinie. Przywrócenie dystrofiny dla NS-07 po leczeniu wyniosło 9,1%. Sygnał dystrofiny w próbkach nieleczonych był zbyt słaby, aby go zmierzyć. Wielkości markerów podano w kilodaltonach. Dys: dystrofina, BG: tło, SL: długa izoforma spektryny, SS: krótka izoforma spektryny, My: miozyna typu 1. Wielkości markerów podano w kilodaltonach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Objętość/Reakcja (μl)</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od RNaz (dołączona)</td>
			<td>Zmienna</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x bufor QIAGEN OneStep RT-PCR</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina dNTP (zawierająca 10 mM każdego dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 μM każdego dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter bezpośredni (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter odwrotny (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka enzymów QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inhibitor RNazy (opcjonalnie)</td>
			<td>Zmienna</td>
			<td>5–10 j./reakcję</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA matrycowe</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Odczynniki do RT-PCR. Związki niezbędne do przeprowadzenia jednej reakcji RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter</td>
			<td>Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Lista starterów. Sekwencje starterów użytych w niniejszym badaniu. F: Forward (przedni), R: Reverse (odwrócony).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 cykl</td>
			<td>odwrotna transkrypcja</td>
			<td>30 min</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cykl</td>
			<td>Wstępny etap aktywacji PCR</td>
			<td>15 min</td>
			<td>95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">35 cykli</td>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>1 min</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyżarzanie</td>
			<td>1 min</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozszerzenie</td>
			<td>1 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 cykl</td>
			<td>Ostateczne przedłużenie</td>
			<td>7 min</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przytrzymać</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Zastosowane warunki PCR. Przedstawiono warunki PCR dla reakcji RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór</td>
			<td>Objętość/Reakcja (μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td>Zmienna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gotowa mieszanina reakcyjna BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter bezpośredni/Starter odwrotny (3.2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA matrycowe</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Odczynniki niezbędne do reakcji sekwencjonowania. W przygotowaniu zestawu należy użyć startera Forward lub Reverse, nie obu jednocześnie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >1 cykl</td >
			<td >1 min</td >
			<td >96 °C</td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="3">25 cykli</td >
			<td >10 s</td >
			<td >96 °C</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5 s</td >
			<td >50 °C</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4 min</td >
			<td >60 °C</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Podtrzymanie</td >
			<td>∞</td >
			<td >4 °C</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 5: Warunki PCR dla sekwencjonowania metodą Sangera.

Tutaj prezentujemy molekularną charakterystykę ekspresji dystrofiny 38 za pomocą sekwencjonowania Sangera, RT-PCR i western blottingu w badaniu klinicznym.

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodologię przygotowania i postępowania z tkanką mięśniową w warunkach przedklinicznych i badaniach klinicznych, co jest ważne dla uzyskania wiarygodnych wyników w dziedzinie DMD. Techniki te są istotne dla prób pomijania eksonów w przypadku DMD. Główną zaletą jest to, że są one dobrze ugruntowane i powtarzalne, jeśli są przeprowadzane wspólnie.Techniki te koncentrują się głównie na pomijaniu eksonów w DMD, ale po zmianie starterów te same techniki można zastosować do innych chorób leczonych terapiami splicingowymi. Metody te można wykorzystać do osiągnięcia wydajności pomijania eksonów zarówno RNA, jak i białka. Aby przygotować próbkę do analizy, najpierw wymieszaj równe objętości gumy tragakantowej i wody, aż guma stanie się miękka i lepka.Załaduj tę mieszaninę do 25-mililitrowych strzykawek i dozuj od 0,5 do jednego centymetra gumy na poszczególne krążki korkowe. Oznacz krążki po przeciwnej stronie i umieść pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie, aż część płynu zamarznie. Umieść każdą próbkę w gumie tragakantowej na krążkach z osią podłużną każdego mięśnia prostopadłą do korka.Umieść gumę na dnie każdego mięśnia, aby pomóc utrzymać mięsień na miejscu, i użyj pęsety, aby zamrozić próbki w zimnym izopentanie. Przesuwaj próbki w sposób ciągły przez jedną minutę lub do całkowitego zamrożenia przed tymczasowym umieszczeniem ich na suchym lodzie. Następnie umieść próbki w szklanych fiolkach do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Aby przeciąć zamrożoną tkankę mięśniową do analizy, ustaw kriostat na temperaturę roboczą 25 stopni Celsjusza i zamontuj blok mięśniowy na uchwycie. Przytnij blok tkanki, aż uzyskasz płaskie sekcje. W przypadku PCR z odwrotną transkryptazą i analizy Western blot należy uzyskać plastry o grubości 10 mikrometrów.Do analizy immunohistochemicznej należy uzyskać plastry o grubości od sześciu do ośmiu mikrometrów, a do barwienia hematoksyliną i eozyną należy uzyskać plastry o grubości od 10 do 12 mikrometrów. Po ich nabyciu umieść pokrojone kawałki w dwóch mililitrowych tubkach. Przechowuj próbki do PCR i western blot w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Pokazano tu system elektroforezy mikroczipowej, żelowe obrazy reakcji PCR z odwrotną transkryptazą oraz wyniki sekwencjonowania pominiętego pasma od dwóch pacjentów przed i po leczeniu oligonukleotydem antysensownym w pierwszej fazie badania ze zwiększaniem dawki. U obu pacjentów występują delecje. Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem obaj pacjenci nie wykazywali przeskakiwania i można było uwidocznić tylko niepominiętą opaskę.Po 12 tygodniach leczenia u drugiego pacjenta uwidoczniono wyraźne pominięte dolne pasmo, jednak nadal trudno było wykryć jakikolwiek pominięty produkt u pierwszego pacjenta. Wyniki sekwencjonowania wykazały konkatenację eksonów 47 i 54 u drugiego pacjenta oraz eksonów 44 i 54 u pierwszego pacjenta. Aby obliczyć procent pominiętych pasm, stężenie molowe dla pominiętego pasma zostało podzielone przez pominięte i niepominięte pasma.Zgodnie z oczekiwaniami, przed leczeniem Western blot nie wykryto pasma dystrofiny. Po leczeniu wykryto prążek u drugiego pacjenta o mniejszej masie cząsteczkowej w porównaniu z obserwowaną u zdrowej grupy kontrolnej. Pierwszy pacjent nie wykazywał jednak wykrywalnych poziomów dystrofiny po leczeniu.Bardzo ważne jest, aby prawidłowo obchodzić się z tkanką mięśniową i konsekwentnie umieszczać każdą próbkę na gumie tragakantowej. Skrawki tkanek mogą być analizowane na wiele różnych sposobów, w tym sztucznie do PCR, cyfrowego PCR, Western blot, immunohistochemii i z różnymi rodzajami omiki. Techniki te mogą być przyspieszone, rozwój, dodatkowe leki pomijające eksony ukierunkowane na różne eksony i mogą być stosowane do rozwoju opartych na wirusach i ponownie w edycji DMD.

characterizing-exon-skipping-efficiency-dmd-patient-samples-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pomijanie eksonów jest obecnie najbardziej obiecującą opcją terapeutyczną dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Aby rozszerzyć możliwości zastosowania u pacjentów z DMD i zoptymalizować stabilność/funkcję powstałych skróconych białek dystrofiny, opracowano podejście z pominięciem wielu eksonów przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych i zademonstrowaliśmy ogólnoustrojowe ratowanie dystrofiny w modelu psów.

Przeskakiwanie wieloeksonowe przy użyciu koktajlowych oligonukleotydów antysensownych w dystrofii mięśniowej sprzężonej z chromosomem X u psów

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Wykazano, że różne oligonukleotydy antysensowne (AON) indukują inkluzję eksonów (modulacja splicingu) i ratują ekspresję SMN w rdzeniowym zaniku mięśni (SMA). W tym miejscu opisujemy protokół lipotransfekcji AON w celu indukcji inkluzji eksonu w genie SMN2 oraz metody oceny w celu określenia skuteczności w fibroblastach pacjentów z SMA.

Ocena inkluzji eksonów indukowanej przez oligonukleotydy antysensowne przełączające splicing w fibroblastach pacjentów z SMA

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do przeprowadzenia in vivo edycji genów serca u myszy przy użyciu rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) za pośrednictwem CRISPR. Protokół ten oferuje obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii dystroficznej w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i może być stosowany do generowania specyficznego dla serca nokautu u myszy po urodzeniu.

Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół efektywnego modelowania mięśni dystrofii mięśniowej Duchenne'a przy użyciu komórek pochodzących z moczu przekształconych w MYOD1 w celu oceny przywrócenia poziomu mRNA dystrofiny i białka po pominięciu eksonu.

Przeskakiwanie eksonów w bezpośrednio przeprogramowanych miotubach uzyskanych z ludzkich komórek pochodzących z moczu

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Alternatywny splicing (AS) i alternatywna poliadenylacja (APA) rozszerzają różnorodność izoform transkryptu i ich produktów. W tym miejscu opisujemy protokoły bioinformatyczne do analizy masowych testów sekwencjonowania RNA i sekwencjonowania końca 3' w celu wykrycia i wizualizacji AS i APA różniących się w różnych warunkach eksperymentalnych.

Identyfikacja alternatywnego splicingu i poliadenylacji w danych sekwencyjnych RNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak Elvax 40W może być używany jako metoda o powolnym uwalnianiu do dostarczania leku do siatkówki dorosłego szczura. Opisano protokół przygotowania, ładowania i dostarczania kompleksu lek-żywica do oka.

Dostarczanie leku o powolnym uwalnianiu przez Elvax 40W do siatkówki szczura: implikacje dla leczenia chorób przewlekłych

Poznaj standaryzowaną metodologię przygotowania tkanki mięśniowej w badaniach klinicznych DMD. Techniki pomijania eksonów umożliwiają analizę ekspresji dystrofiny metodami PCR i Western blot.

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka skuteczności pomijania eksonów w próbkach pacjentów z DMD w badaniach klinicznych oligonukleotydów antysensownych

Przeglądaj więcej filmów