Name: Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj izolację tętniczek i naczyń włosowatych z hipokampa myszy do badań myografii ciśnieniowej. Ta metoda umożliwia analizę sygnalizacji naczyniowej bez zakłóceń z otaczających tkanek mózgowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Julesowi Morinowi za wnikliwe komentarze na temat rękopisu. Badania te zostały sfinansowane z nagród organizacji non-profit CADASIL Together We Have Hope, Center for Women's Health and Research oraz NHLBI R01HL136636 (FD).

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado, Kampusu Medycznego Anschutz i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Rozwiązania
<ol>
	<li>Do rozbioru należy użyć soli fizjologicznej buforowanej MOPS, a próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed ich użyciem. Nie gazować roztworu. Przygotować buforowaną sól fizjologiczną MOPS o następującym składzie: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glukozy, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM pirogronian, 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, pH 7,3 w 4 °C.</li>
	<li>Stosować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jako roztwór do kąpieli i roztwór do pipetowania. Gaz zarówno aCSF, jak i Ca2+ wolny od aCSF z 5% równowagą CO2 , 20% O2 i N2. Przygotuj roztwór o następującym składzie: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM glukozy, 2 mM CaCl2, pH 7,3 (z napowietrzeniem 5% CO2, 20% równowagi O2 i N2).</li>
	<li>Uzyskać maksymalną dylatację w nominalnie wolnym od Ca2+ aCSF (0 mM [Ca2+]o, 5 mM EGTA).</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory organowej
<ol>
	<li>Włóż kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna = 1,2 mm; średnica wewnętrzna = 0,69 mm; długość = 10 cm) do ściągacza do szkła. Pociągnij kapilarę, aby utworzyć długą, cienką końcówkę na jednym końcu.</li>
	<li>Po jednej stronie komory dodaj kaniulę, która może połączyć się z miniaturową pompą perystaltyczną w celu uzyskania ciśnienia świetlnego w naczyniu. Pod mikroskopem preparacyjnym złamij końcówkę kaniuli tak, aby była wystarczająco mała, aby zmieścić się w interesującym naczyniu, ale wystarczająco duża, aby umożliwić przepływ roztworów przez końcówkę. Upewnij się, że końcówka ma średnicę około 10-15 μm.</li>
	<li>Napełnij kaniulę za pomocą strzykawki z dołączonym filtrem 0,22 μm z natlenionym aCSF. Upewnij się, że w kaniuli nie ma pęcherzyków powietrza ani zanieczyszczeń.</li>
	<li>Dodaj jeszcze dwie kaniule po przeciwnej stronie komory. Nie łam ich końcówek.</li>
</ol>
3. Sekcja i izolacja hipokampa
<ol>
	<li>Uśpij i odetnij głowę myszy. W tym eksperymencie użyj 8-tygodniowej myszy C57BL6/J, aby porównać różnice między samcami i samicami. Wstrzyknij myszy pentobarbital i odetnij głowę nożyczkami chirurgicznymi.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych przetnij skórę wzdłuż linii środkowej na czubku głowy. Odsuń skórę na boki.</li>
	<li>Zaczynając od ogonowej strony czaszki, przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej, aż dojdziesz do opuszki węchowej. Usuń części czaszki, aż mózg zostanie odsłonięty.</li>
	<li>Powoli usuń mózg, zaczynając w pobliżu nosa myszy. Oddziel mózg od opuszki węchowej, nerwów czaszkowych i rdzenia kręgowego, przecinając struktury małymi nożyczkami do preparacji.</li>
	<li>Umieść mózg na płytce preparacyjnej z wystarczającą ilością roztworu MOPS, aby całkowicie go zanurzyć. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego umieść mózg na środku płytki preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną w dół.</li>
	<li>Za pomocą żyletki przetnij mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny. Przytrzymaj ostrze tak, aby ostra krawędź była równoległa do dolnej części płytki preparucyjnej. Wciśnij ostrze przez mózg jednym pociągnięciem. Przesuń jedną półkulę na bok talerza.</li>
	<li>Wykonaj następujące czynności dla każdej półkuli osobno lub równolegle.
	<ol>
		<li>Umieść jedną półkulę na środku talerza tak, aby linia środkowa była skierowana w dół. Następnie użyj żyletki, aby przeciąć wzdłuż poprzecznej szczeliny, aby usunąć móżdżek i pień mózgu. Wepchnij ostrze prosto przez chusteczkę.</li>
		<li>Obróć półkulę tak, aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Użyj jednej szpatułki, aby przytrzymać mózg na miejscu. Za pomocą drugiej szpatułki włóż końcówkę poniżej ciała modzelowatego i zgarnij pod spód, aby usunąć wzgórze, przegrodę i podwzgórze, zakrywając hipokamp (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Upewnij się, że hipokamp jest teraz widoczny jako zakrzywiona struktura w pobliżu tylnej strony mózgu. Używając jednej szpatułki do przytrzymania mózgu na miejscu, użyj drugiej szpatułki, aby zgarnąć hipokamp z mózgu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś hipokampy na nową płytkę preparacyjną wypełnioną mniej więcej do połowy roztworem MOPS. Odrzuć resztę mózgu.</li>
</ol>
4. Izolacja tętniczki hipokampa
<ol>
	<li>Wykonaj następujące kroki dla każdego hipokampa.
	<ol>
		<li>Przygnij jeden z hipokampów za pomocą małych szpilek na każdym końcu sekcji. Tętnica hipokampa jest skierowana do góry.</li>
		<li>Za pomocą bardzo ostrych kleszczy delikatnie rozciągnij małe odcinki hipokampa. Spowoduje to rozluźnienie tkanki otaczającej tętniczki, ułatwiając ich rozwarstwienie.</li>
		<li>Przeszukaj grzbietową tkankę hipokampa, aby zidentyfikować tętnicę poprzeczną zewnętrzną (Rysunek 1C)16,27.</li>
		<li>Delikatnie chwyć zewnętrzną tętnicę poprzeczną i powoli odciągnij ją od tkanki, aby zebrać tętniczki i naczynia włosowate perfundujące region CA3 hipokampa.</li>
		<li>Gdy nie ma już naczyń do usunięcia z tkanki, wyrzuć hipokampy. Trzymaj naczynia na lodzie w talerzach, gdy nie są używane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kaniulacja tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa
<ol>
	<li>Znajdź tętniczkę z odgałęzieniem, które kończy się naczyniami włosowatymi. Przenieś go do komory organowej. Upewnij się, że tętniczka ma około 15-30 μm po pełnym rozszerzeniu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Ostrożnie zamontuj naczynie krwionośne, przepychając końcówkę kaniuli przez ścianę tętniczki poniżej obszaru docelowego. Ostrożnie wsuń naczynie na kaniulę, aż będzie wystarczająco dużo tkanki, aby założyć opaskę.</li>
	<li>Wykonaj luźny węzeł z nylonowymi szwami 12-0, tak aby pasował do naczynia krwionośnego i kaniuli. Użyj węzła półzaczepowego, aby zabezpieczyć wiązania. Następnie pociągnij za końce, aby zacisnąć węzeł i przymocuj tętniczkę do kaniuli. Usuń wszelkie obce gałęzie naczyń poniżej krawata, delikatnie pociągając je kleszczami.</li>
	<li>Zrób kolejny krawat i zabezpiecz go na drugim końcu tętniczki, aby go uszczelnić.</li>
	<li>Opuść kaniulę z dołączonym naczyniem, aż będzie płasko przylegać do szkiełka nakrywkowego na dnie komory. Uważaj, aby nie obniżyć kaniuli zbyt mocno, bo pęknie.</li>
	<li>Za pomocą jednej kaniuli po przeciwnej stronie komory opuść ją tak, aby jej czubek przygniótł opaskę na końcu tętniczki.</li>
	<li>Użyj trzeciej kaniuli, aby przypiąć gałąź kapilarną do szkiełka nakrywkowego. Umieść końcówkę blisko końca gałęzi, pozostawiając końce naczyń włosowatych odsłonięte (nie pod kaniulą).</li>
</ol>
6. Miografia ciśnieniowa
<ol>
	<li>Przenieś komorę z lunety preparacyjnej do mikroskopu za pomocą oprogramowania rejestrującego.</li>
	<li>Podłącz rurkę doprowadzającą i odpływową do komory w celu perfuzji. Rozpocząć perfuzję za pomocą podgrzanego płynu CSF (37 °C) przy natężeniu przepływu 4 ml/min.</li>
	<li>Podłącz kaniulę ciśnieniową do pompy perystaltycznej połączonej z przetwornikiem ciśnienia i doprowadź ciśnienie wewnętrzne do 20 mm Hg.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do nagrywania. Dostosuj ustawienia mikroskopu i obrazowania, aby uzyskać możliwie najwyraźniejszy obraz. Rozpocznij nagrywanie po zoptymalizowaniu ustawień dla oprogramowania wykrywającego.</li>
	<li>Zwiększ ciśnienie w naczyniu do 40 mm Hg, jednocześnie rejestrując średnicę tętnicy za pomocą oprogramowania do wykrywania krawędzi.</li>
	<li>Odczekaj ~15-20 minut, aby wypłukać roztwór MOPS z komory z aCSF i pozwolić, aby preparat HiCaPA zrównoważył się i rozwinął ton miogenny.</li>
	<li>Aby przetestować żywotność naczynia, nałóż 1 μM roztwór NS309 na perfuzję kąpieli (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A,B i sekcja Reprezentatywne wyniki). Segment tętniczki musi się rozszerzyć, wykazując około 30-40% tonu miogennego, jak opisano wcześniej3,14,20.</li>
</ol>
7. Ogniskowa stymulacja końców naczyń włosowatych
<ol>
	<li>Po ustaleniu wyjściowego tonu tętniczki i ocenie funkcji śródbłonka należy przetestować odpowiedź na stymulację naczyń włosowatych.</li>
	<li>Za pomocą ściągacza do szkła wykonaj kaniule tak, aby na jednym końcu znajdował się cienki punkt. Oderwij końcówkę od kaniuli, aby testowany lek mógł płynnie przepływać przez końcówkę przy 5 psi.</li>
	<li>Napełnij kaniulę roztworem interesującego Cię leku i dodaj go do 3-osiowego mikromanipulatora dołączonego do mikroskopu. Podłącz rurkę z systemu wyrzutu ciśnienia do kaniuli.</li>
	<li>Powoli opuść kaniulę do kąpieli w pobliżu naczyń włosowatych, uważając, aby nie uderzyć w żadną część naczynia lub sprzętu w komorze. Manewruj końcówką kaniuli obok końców naczyń włosowatych, nie dotykając ich. Trzymaj końcówkę kaniuli tuż przy szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec stymulacji naczynia w przypadku nieszczelności kaniuli.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do stymulacji naczyń włosowatych, opuść kaniulę do szkiełka nakrywkowego i tuż obok naczyń włosowatych. Aktywuj system wyrzutu ciśnienia z żądanym czasem wyrzutu (tutaj 20 s). Po zakończeniu stymulacji lekko podnieś kaniulę, aby uniknąć dalszej stymulacji.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz stymulację. Zmień kaniulę systemu wyrzutu ciśnienia, aby przetestować różne związki leków.</li>
	<li>Aby upewnić się, że stymulowane są tylko naczynia włosowate, napełnij kaniulę roztworem 1 μM NS309 i powtórz powyższe kroki. 
	UWAGA: Komórki śródbłonka naczyń włosowatych nie wykazują ekspresji kanałów K+ aktywowanych przez NS309, więc tętniczka nie może reagować na stymulację. Jeśli tętniczka rozszerza się, kaniula będzie musiała zostać przesunięta lub średnica otworu będzie musiała być mniejsza (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A, B i sekcja Reprezentatywne wyniki).</li>
</ol>

<ol><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li>
<li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+and+IKCa+Channels%2C+Myogenic+Tone%2C+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles%3A+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li>
<li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li>
<li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries%3A+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li>
<li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging%3A+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li>
<li>Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoide%2C+M+%22Microcirculation+%28New+York%2C+N.Y.%3A1994%29%22">Microcirculation (New York, N.Y.:1994)</a>. 25 (1), (2018).</li>
<li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+endfoot+Ca2%2B+and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2%2C+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent%2C+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li>
<li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K%2B+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li>
<li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li>
<li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+TRPV3+channel+Ca2%2B+influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li>
<li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia%3A+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li>
<li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).</li>
<li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age%3A+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li>
<li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li>
<li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+K%2B-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li>
<li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351(2018).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li>
<li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li>
<li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li>
<li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li>
<li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+the+K%28ir%292+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe%3A+the+discovery%2C+SAR%2C+and+pharmacological+characterization+of+ML133%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li>
<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Preparat HiCaPA (tętniczka kapilarno-miąższowa hipokampa) opisany w niniejszym manuskrypcie jest rozszerzeniem naszej dobrze uznanej procedury izolacji, zwiększania ciśnienia i badania tętniczek miąższowych29. Niedawno informowaliśmy, że kanały Kir2.1 w komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu wyczuwają wzrost [K+] o związany z aktywacją neuronalną i generują rosnący sygnał hiperpolaryzacyjny, który rozszerza tętniczkiw górę 20. Ujawnienie tej wcz...

Krążenie pialne na powierzchni mózgu było przedmiotem wielu badań, częściowo ze względu na jego eksperymentalną dostępność. Jednak topologia układu naczyniowego mózgu tworzy odrębne regiony. W przeciwieństwie do solidnej sieci pial bogatej w zespolenia o znacznej zdolności do przekierowywania przepływu krwi, tętniczki miąższowe śródmózgowe (PA) wykazują ograniczoną podaż poboczną, a każda z nich perfunduje dyskretną objętość tkanki nerwowej1,2. Powoduje to efekt wąskiego gardła w przepływie krwi, który w połączeniu z unikalnymi cechami fizjologicznymi3,4,5,6,7,8, sprawia, że tętniczki śródmózgowe są kluczowym miejscem regulacji przepływu krwi w mózgu (CBF)9,10. Pomimo wyzwań technicznych związanych z izolacją i kaniulacją PA, w ostatniej dekadzie odnotowano wzrost zainteresowania badaniami funkcjonalnymi ex vivo z wykorzystaniem naczyń ciśnieniowych11,12,13,14,15,16,17. Jednym z powodów tego zwiększonego zainteresowania jest znaczny wysiłek badawczy prowadzony nad sprzężeniem nerwowo-naczyniowym (NVC), mechanizmem podtrzymującym przekrwienie czynnościowe mózgu18.
Regionalnie, CBF może gwałtownie wzrosnąć po lokalnej aktywacji neuronowej19. Mechanizmy komórkowe i właściwości sygnalizacyjne kontrolujące NVC nie są w pełni poznane. Zidentyfikowaliśmy jednak wcześniej nieprzewidzianą rolę naczyń włosowatych mózgu podczas NVC w wykrywaniu aktywności neuronalnej i przekształcaniu jej w hiperpolaryzujący sygnał elektryczny w celu rozszerzenia tętniczek znajdujących się w górnym strumieniu20,21,22. Potencjały czynnościowe23,24 i otwarcie kanałów K+ (BK) aktywowanych przez Ca2+ o dużej przewodności na końcach astrocytów25,26 zwiększają stężenie międzywęzłowych jonów potasu [K+]o, co powoduje aktywację silnego prostownika wewnętrznego K+ (Kir) kanały w śródbłonku naczyń włosowatych naczyń włosowatych. Kanał ten jest aktywowany przez zewnętrzne K+, ale także przez samą hiperpolaryzację. Rozprzestrzeniając się przez połączenia szczelinowe, prąd hiperpolaryzacyjny regeneruje się następnie w sąsiednich komórkach śródbłonka naczyń włosowatych aż do tętniczki, gdzie powoduje relaksację miocytów i wzrost CBF20,21. Badania nad tym mechanizmem doprowadziły nas do opracowania ciśnieniowego preparatu do tętniczki kapilarno-miąższowej (CaPA) do pomiaru średnicy tętniczki podczas stymulacji naczyń włosowatych środkami wazoaktywnymi. Preparat CaPA składa się z kaniulowanego odcinka tętniczki śródmózgowej z nienaruszonym, dolnym rozgałęzieniem kapilarnym. Końce kapilarne są dociskane do szklanego dna komory za pomocą mikropipety, która zamyka i stabilizuje całą formację naczyniową20,21.
Wcześniej dokonaliśmy instrumentalnych innowacji, obrazując preparaty CaPA z kory myszy20,21 i tętniczki z ciała migdałowatego szczura13 i hippocampus16,17. Ponieważ unaczynieniu hipokampa poświęca się więcej uwagi ze względu na jego podatność na stany patologiczne, tutaj przedstawiamy metodę przygotowania CaPA krok po kroku z mysiego hipokampa (HiCaPA), która może być stosowana nie tylko w funkcjonalnych badaniach NVC, ale także w biologii molekularnej, immunochemii i elektrofizjologii.

<table><tbody><tr><td>0,22 i mikro; m Filtry strzykawkowe</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm)</td><td>Microsurgery Instruments, Inc</td> Automatyczny regulator temperatury <td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Średnica zewnętrzna szkła borokrzemianowego: 1,2 mm, średnica wewnętrzna: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Luneta preparcyjna</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash; kompletna pompa z napędem i głowicą pompy MS/CA 4-12</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Wbudowany podgrzewacz wody</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Miltex & handel; Kleszcze do tkanek</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Bezwodny</td><td>mikromanipulator Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 chlorowodorek</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji, 2-kanałowe</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia z pompą perystaltyczną</td><td>Oprzyrządowanie Living Systems</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Super drobne kleszcze</td><td>Nożyczki chirurgiczne Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Od subtelnych zmian w zachowaniu do późnego stadium demencji, naczyniowe upośledzenie funkcji poznawczych zazwyczaj rozwija się po niedokrwieniu mózgu. Udar mózgu i zatrzymanie akcji serca są niezwykle dymorficznymi chorobami płciowymi i oba wywołują niedokrwienie mózgu. Jednak postęp w zrozumieniu naczyniowych zaburzeń poznawczych, a następnie opracowanie metod leczenia specyficznych dla płci, został częściowo ograniczony przez wyzwania związane z badaniem mikrokrążenia mózgowego na podstawie modeli mysich w badaniach funkcjonalnych. W tym miejscu przedstawiamy podejście do badania sygnalizacji między naczyniami włosowatymi a tętniczkami w preparacie ex vivo tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa (HiCaPA) z mózgu myszy. Opisujemy, jak izolować, kaniulować i zwiększać ciśnienie w mikrokrążeniu, aby zmierzyć średnicę tętniczki w odpowiedzi na stymulację naczyń włosowatych. Pokazujemy, które odpowiednie kontrole funkcjonalne można zastosować do walidacji integralności preparatu HiCaPA i wyświetlania typowych wyników, w tym badania potasu jako czynnika sprzęgającego nerwowo-naczyniowe oraz wpływu niedawno scharakteryzowanego inhibitora rodziny kanałów potasowych Kir2 do wewnętrznej rektyfikacji, ML133. Ponadto porównujemy odpowiedzi w preparatach uzyskanych od samców i samic myszy. Chociaż dane te odzwierciedlają badania funkcjonalne, nasze podejście może być również stosowane w badaniach biologii molekularnej, immunochemii i elektrofizjologii.

Śródbłonkowe kanały potasowe o małym przewodnictwie (SK) i średnim przewodnictwie (IK) Ca2+wrażliwy na K+ kanały wywierają wpływ rozszerzający na średnicę tętnic płucnych. Aplikacja kąpielowa 1 µM NS309, syntetyczny agonista kanałów IK i SK, wywołał niemal maksymalne rozszerzenie (Rycina 2A,B). Jednakże komórki śródbłonka naczyń włosowatych nie posiadają kanałów IK i SK i nie uległy hiperpolaryzacji w odpowiedzi na NS309...

Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje, jak izolować tętniczki i naczynia włosowate hipokampa od mózgu myszy oraz jak zwiększać w nich ciśnienie do miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badań molekularnych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Nasza metoda pozwala na badanie naczyń krwionośnych zlokalizowanych w strukturach, które w innym przypadku byłyby trudne do zobrazowania in vivo, takich jak hipokamp. Ponieważ naczynia krwionośne są usuwane z tkanki mózgowej, sygnalizacja między naczyniami włosowatymi a tętniczką może być badana bez niepożądanego wpływu na otaczającą tkankę. Aby odizolować hipokamp, użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej na czubku głowy myszy i przesuń skórę na boki.Zaczynając od ogonowej strony czaszki, przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej, aż dojdziesz do opuszki węchowej i usuń części czaszki, aż mózg zostanie odsłonięty. Zaczynając w pobliżu nosa myszy, powoli usuń mózg, używając nożyczek, aby przeciąć opuszki węchowe, nerwy czaszkowe i rdzeń kręgowy. Zanurz mózg brzuszną stroną w wodzie w buforowanej soli fizjologicznej MOPS w środku płytki preparacyjnej i umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym.Trzymając ostrą krawędź równolegle do dna naczynia, użyj żyletki, aby przeciąć mózg na pół wzdłuż podłużnej szczeliny za jednym pociągnięciem. Umieść jedną półkulę na środku płytki linią środkową skierowaną w dół i wepchnij żyletkę prosto przez tkankę wzdłuż poprzecznej szczeliny, aby usunąć móżdżek i pień mózgu. Obróć półkulę tak, aby strona przyśrodkowa była skierowana do góry i użyj szpatułki, aby utrzymać mózg na miejscu.Włóż końcówkę drugiej szpatułki poniżej ciała modzelowatego, zgarniając pod tkankę, aby usunąć wzgórze, przegrodę i podwzgórze z hipokampa. Hipokamp powinien być teraz widoczny jako zakrzywiona struktura w pobliżu tylnej strony mózgu. Używając jednej szpatułki, aby przytrzymać mózg na miejscu, użyj drugiej szpatułki, aby zgarnąć hipokamp z mózgu.Następnie przenieś hipokampy na nową płytkę preparacyjną, wypełnioną mniej więcej do połowy świeżym roztworem MOP. W celu izolacji tętniczki hipokampa umieść małe szpilki na każdym końcu jednego hipokampa, aby zabezpieczyć próbkę tętnicy hipokampa stroną do góry. Za pomocą bardzo ostrych kleszczy delikatnie rozciągnij małe odcinki hipokampa, aby rozluźnić tkankę otaczającą tętniczki.I przeszukaj grzbietowe tkanki hipokampa, aby zidentyfikować zewnętrzne tętnice poprzeczne. Po zlokalizowaniu tętnicy chwyć zewnętrzną tętnicę poprzeczną z hipokampa i powoli odciągnij ją od tkanki, aby zebrać tętniczki i naczynia włosowate. Tętnica z każdego hipokampa jest usuwana osobno.Gdy nie ma już naczyń do usunięcia, umieść próbki na lodzie i wyrzuć pozostałą tkankę hipokampa. W celu kaniulacji tętniczek zlokalizuj i tętniczkę z odgałęzieniem, które kończy się naczyniami włosowatymi i umieść tętniczkę w komorze narządu. Ostrożnie wepchnij końcówkę kaniuli przez ścianę tętniczki poniżej obszaru docelowego, aby zamontować naczynie krwionośne.Następnie ostrożnie wsuń naczynie na kaniulę, aż będzie wystarczająco dużo tkanki, na której można umieścić opaskę. Użyj nylonowych szwów 12-0, aby zrobić luźny węzeł, który będzie pasował do naczynia krwionośnego i kaniuli, a następnie użyj węzła pół zaczepu, aby zabezpieczyć opaski, pociągnij końce, aby zacisnąć węzeł, aby przymocować tętniczkę do kaniuli. Zabezpiecz kolejny krawat na drugim końcu tętniczki, aby ją uszczelnić.Po przeciwnej stronie komory opuść drugą kaniulę, aż punkt kaniuli przygwoździ krawat na końcu tętniczki. Następnie użyj trzeciej kaniuli, aby przypiąć gałąź kapilary do szkiełka nakrywkowego, umieszczając końcówkę blisko końca gałęzi, pozostawiając odsłonięte końce naczyń włosowatych. Ponieważ mikrokrążenie mózgowe jest wyjątkowo delikatne, należy zminimalizować rozciąganie i manipulowanie naczyniami podczas procedury kaniulacji, aby zapewnić przeżycie tętniczek.W celu analizy miografii ciśnieniowej przenieś komorę na stolik mikroskopu świetlnego z oprogramowaniem rejestrującym i podłącz rurki doprowadzające i odpływowe do komory w celu uzyskania obfitości. Rozpocznij obfitowanie sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy natężeniu przepływu czterech mililitrów na minutę i podłącz kaniulę ciśnieniową do pompy perystaltycznej w połączeniu z przetwornikiem ciśnienia. Doprowadź ciśnienie wewnętrzne do 20 milimetrów słupa rtęci i uruchom oprogramowanie do nagrywania.Dostosuj ustawienia mikroskopu i obrazu, aby uzyskać możliwie najwyraźniejszy obraz. Użyj oprogramowania Edge Detection, aby sprawdzić, czy tętniczka ma średnicę około 15 do 30 mikrometrów, gdy jest w pełni rozszerzona. Po zoptymalizowaniu ustawień rozpocznij rejestrację i zwiększ ciśnienie wewnątrznaczyniowe w naczyniu do 40 milimetrów słupa rtęci, jednocześnie rejestrując średnicę tętniczki za pomocą oprogramowania Edge Detection.Następnie obficie przelej komorę przez 15 do 20 minut, aby wypłukać roztwór MOP. Aby przetestować żywotność naczynia, nałóż jeden mikromolowy roztwór NS309 na obfitość kąpieli, segment tętniczki powinien się rozszerzyć, wykazując 30 do 40% tonu miogennego. Po ustaleniu wyjściowego tonu tętniczki użyj ściągacza do szkła, aby wykonać kaniule z cienkim punktem na jednym końcu i użyj kleszczyków, aby złamać końcówkę każdej kaniuli, tak aby interesujący lek mógł płynnie przepływać przez końcówkę przy ciśnieniu pięciu funtów na cal kwadratowy.Napełnij kaniulę interesującym Cię lekiem. I załaduj kaniulę na trójosiowy mikromanipulator przymocowany do mikroskopu. Podłącz rurkę z systemu wyrzutu ciśnienia do kaniuli i powoli opuść kaniulę do kąpieli w pobliżu naczyń włosowatych, uważając, aby nie uderzyć w żadną część naczynia lub komory.Aby pobudzić naczynia włosowate, opuść kaniulę do szkiełka nakrywkowego tuż obok naczyń włosowatych i aktywuj system wyrzutu ciśnienia z żądanym czasem wyrzutu. Pod koniec stymulacji lekko unieś kaniulę, aby uniknąć dalszej stymulacji. Aby potwierdzić, że stymulowane są tylko naczynia włosowate, napełnij nową kaniulę jednym mikromolem roztworu NS309 i stymuluj naczynia włosowate, jak pokazano.Następnie uzyskaj maksymalne rozszerzenie naczyń krwionośnych poprzez kąpiel preparatu w roztworze bezwapniowym. Zastosowanie w kąpieli jednomikromolowego NS309 powoduje prawie maksymalne rozszerzenie tętniczki z powodu wrażliwych na wapń kanałów potasowych w śródbłonku. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych nie mają jednak pośrednich i małych kanałów przewodnictwa i nie ulegają hiperpolaryzacji w odpowiedzi na agonistę, w wyniku czego stymulacja końców naczyń włosowatych za pomocą NS309 nie powoduje rozszerzenia tętniczek w górę, co oznacza, że NS309 nie dotarł do tętniczki i może być stosowany jako kontrola dostępu do ograniczenia przestrzennego związku nakładanego na naczynia włosowate przez wyrzut ciśnieniowy.Stosując preparat do tętniczki miąższowej włośniczki w hipokampie, jak pokazano, zastosowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego uzupełnionego 10 milimolowym potasem na końce naczyń włosowatych powoduje rozszerzenie tętniczki w górę, które nie różni się między preparatami samców i samic myszy. Co więcej, dodanie inhibitora Kir2 ML 133 praktycznie znosi indukowane naczyniami włosowatymi rozszerzenie tętniczek w odpowiedzi na 10-milimolowy potas w preparatach zarówno samców, jak i samic myszy. Podczas montażu naczynia krwionośnego ogranicz bezpośrednie interakcje z naczyniem krwionośnym, aby zminimalizować uszkodzenie i zwiększyć żywotność naczynia.Po wyizolowaniu naczynia krwionośnego można przetestować różne związki lecznicze lub naczynie krwionośne można dalej przetwarzać do badań biologii ocznej, immunochemii lub elektrofizjologii.

ex-vivo-pressurized-hippocampal-capillary-parenchymal-arteriole

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ten manuskrypt opisuje prosty i powtarzalny protokół izolacji tętniczek śródmózgowych (grupa naczyń krwionośnych obejmujących tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne) od myszy, do wykorzystania w miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badaniach molekularnych.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Prezentujemy metodę, która może dostarczyć dalszych informacji na temat wczesnych zdarzeń leżących u podstaw neurodegeneracji i opiera się na uznanej technice mózgu ex-vivo, łącząc zalety eksperymentów in vivo i in vitro. Co więcej, jest to wyjątkowa okazja do bezpośredniego porównania grupy leczonej i nieleczonej na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Protokół tutaj zapewnia szczegółowe, dynamiczne pobieranie próbek płynu zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym z hipokampa obudzonych szczurów za pomocą systemu mikrodializy.

Dynamiczne pobieranie w czasie rzeczywistym płynu zewnątrzkomórkowego hipokampa od przytomnych szczurów za pomocą systemu mikrodializy

Poznaj izolację tętniczek i naczyń włosowatych z hipokampa myszy do badań myografii ciśnieniowej. Ta metoda umożliwia analizę sygnalizacji naczyniowej bez zakłóceń z otaczających tkanek mózgowych.

Przygotowanie tętniczki kapilarno-miąższowej hipokampa pod ciśnieniem do badania funkcjonalnego

Przeglądaj więcej filmów