Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Metoda ta łączy w sobie zdolność do barwienia białka błonowego przy jednoczesnym zachowaniu integralności błony i architektury subkomórkowej. Jest więc naprawdę potężny w precyzyjnym lokalizowaniu białka związanego z błoną. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona w sobie zastosowanie solidnego, genetycznie klonowalnego znacznika, APEX2, z najnowocześniejszymi metodami konserwacji komórek w mikroskopii elektronowej, w tym kriofiksacją i substytucją przez zamrożenie.

Razem umożliwiają one precyzyjną lokalizację białka w dobrze zachowanej komórce. Protokół ten może być używany do analizowania mechanizmów, za pomocą których wirusy replikują się wewnątrz komórki gospodarza. Wirusy często przejmują kontrolę nad białkami gospodarza podczas schematu infekcji.

Wirusy to małe genomy, które wykorzystują do replikacji w komórkach gospodarza. Ostatnio udało nam się oznaczyć te białka za pomocą tej technologii na podstawie niepublikowanych danych, aby zrozumieć, w jaki sposób wirusy się replikują. Technika ta okazała się bardzo istotna w niedawnym wspólnym badaniu nad toksyną bakteryjną, która powoduje rozpad Golgiego.

Korzystając z cryoAPEX, byliśmy w stanie precyzyjnie zlokalizować toksynę za pomocą rozdrobnionych kawałków Golgiego, co było naprawdę trudne do zobaczenia w inny sposób przy użyciu normalnych technik immunofluorescencji. Technikę tę zademonstrują Elaine Mihelc, doktorantka, i pracownik naukowy, Stephanie Angel, z naszych laboratoriów. Po wysianiu komórek HEK293 w naczyniu, transfekować komórki plazmidami ekspresyjnymi ssaków oznaczonymi APEX2 za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie ze wskazówkami producenta.

Po 12-15 godzinach od transfekcji przemyj komórki raz PBS. Następnie zmyj komórki PBS z naczynia do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 500 x g przez pięć minut.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach 2% aldehydu glutarowego i 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu o pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Umieścić próbkę na lodzie w celu inkubacji przez 30 minut. Następnie osadzać próbkę w masie 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przemyć osad trzy razy przez pięć minut, każdy z dwoma mililitrami 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu, odwirowując w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Aby przeprowadzić reakcję peroksydazy, przemyj osad przez ponowne zawieszenie w trzech mililitrach roztworu DAB, a następnie granulowanie w ilości 500 x g przez pięć minut.

Następnie ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach roztworu DAB z 5,88 milimolowym nadtlenkiem wodoru. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Osad staje się widocznie brązowy, co wskazuje na obecność nierozpuszczalnego produktu reakcji DAB.

Po ponownym przemyciu buforem kakodylanu sodu w DMEM, zgodnie z manuskryptem, ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach roztworu krioprotektantu DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 15% albuminy surowicy bydlęcej. Przenieś zawiesinę komórek do 0,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Ponownie osad, nieznacznie zwiększając prędkość wirówki z 500 x g.

Wyrzucić większość supernatantu, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby osad nie wyschł. Odchować pozostały płyn z osadu komórkowego za pomocą rogu chusteczki laboratoryjnej lub ręcznika papierowego. Pozostaw wystarczającą ilość płynu, aby granulka utworzyła pastę o konsystencji podobnej do pasty do zębów.

Odessać od dwóch do trzech mikrolitrów osadu komórkowego i umieścić go na nośniku membranowym. Całkowicie napełnij studzienkę nośnika membrany, tak aby napięcie powierzchniowe utworzyło lekką kopułę na górze. Wsuń nośnik membrany do wkładu i zabezpiecz.

Umieść wkład w urządzeniu HPF, które zostało przygotowane i zagruntowane, a następnie naciśnij przycisk Start, aby zamrozić. Trzymając wkłady zanurzone w ciekłym azocie, wyjmij nośnik membrany z wkładu. Umieść w plastikowej kapsułce i umieść plastikową kapsułkę w Cryovial pełnym ciekłego azotu.

W kapturze chemicznym przygotuj jeden mililitr na próbkę roztworu 0,2% wagowo kwasu garbnikowego i 5% wody DI w acetonie w Cryovialu. Umieść je w ciekłym azocie do zamrożenia. Umieścić jedną fiolkę z mieszanką do substytucji przez zamrożenie i kriowiale zawierające granulki zamrożonych komórek w komorze na próbki jednostek do substytucji przez zamrożenie.

Przenieść kapsułkę wewnętrzną zawierającą nośnik membranowy z fiolki z ciekłym azotem do odpowiedniej fiolki zawierającej mieszaninę z substytucją przez zamrożenie. Rozpocznij protokół substytucji zamrażania w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach wstrzymać substytucję przez zamrażanie i przemyć próbki trzykrotnie przez pięć minut acetonem schłodzonym do 90 stopni Celsjusza.

Następnie w kapturze chemicznym przygotuj jeden mililitr na próbkę roztworu 1% tetratlenku osmu, 0,2% octanu uranylu i 5% wody DI w acetonie w Cryovial i umieść je w ciekłym azocie do zamrożenia. Umieścić Cryovials z substytucją zamrażania, wymieszać dwie w jednostce substytucji zamrażania i przenieść kapsułki z trzeciego płukania acetonem do wymieszania przez zamrożenie dwóch fiolek. Inkubuj je i zamrażaj substytucję, mieszaj dwa przez 72 godziny w temperaturze 90 stopni Celsjusza, a następnie stopniowo podgrzewaj do zera stopni Celsjusza przez 12-18 godzin.

Utrzymuj temperaturę na poziomie zero stopni Celsjusza i dodaj wstępnie schłodzony aceton do fiolek, aby umyć je trzy razy przez 10 minut każda. Przygotuj wybraną mieszaninę żywicy w plastikowej zlewce zgodnie ze wskazówkami producenta i dodaj 2%4%i 8%żywicy do fiolek, aby zanurzyć kapsułki. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze zero stopni Celsjusza.

Następnie inkubuj w 15%30%60%90% i 100% składnikach żywicy A, B i D tylko przez cztery godziny każdy w temperaturze pokojowej. Po upływie 20 godzin przygotować mieszaninę składników żywicznych A, B, C i D i inkubować przez cztery godziny. Umieść nośniki membrany stroną z granulkami komórkowymi do góry w płaskich foremkach do zatapiania i wypełnij mieszaniną żywicy A, B, C i D. Umieść je w piekarniku do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24-36 godzin.

Po polimeryzacji wyjmij bloki z formy i umieść próbkę w pionowym uchwycie ultramikrotomu, gdzie można ją uwidocznić w powiększeniu. Oddziel nośnik membrany od bloku poprzez połączenie wklepywania ciekłego azotu w nośnik membrany w celu oddzielenia metalu od tworzywa sztucznego i użycia żyletki do odłupywania żywicy wokół nośnika membrany. Po oddzieleniu delikatnie podnieś nośnik membrany, pozostawiając kopułę granulki ogniw na powierzchni bloku.

Umieść blok z odsłoniętymi granulkami komórkowymi skierowanymi do góry w płaskiej formie do zatapiania, która jest nieco głębsza niż pierwsza forma i wypełnij składnikami żywicy A, B, C i D. Polimeryzuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24-36 godzin. Przytnij blok wokół kulki komórkowej za pomocą żyletki. Następnie umieść blok w uchwycie na próbkę na ramieniu sekcyjnym ultramikrotomu.

Za pomocą noża szklanego lub diamentowego przytnij blok do kształtu trapezu ściśle otaczającego granulkę komórki. Uzyskaj 90-nanometrowe ultracienkie odcinki granulki komórkowej za pomocą noża szklanego lub diamentowego. Podnieś wstążkę sekcji na siatce TEM.

Osusz siatkę, osuszając krawędź na kawałku bibuły filtracyjnej i przechowuj ją w pudełku do przechowywania siatki TEM. Zamontuj siatkę na uchwycie TEM i umieść uchwyt w mikroskopie. Użyj Tecnai T12 o napięciu 80 kilowoltów do przesiewania próbek cryoAPEX.

Uzyskuj obrazy komórek i struktur subkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania dzięki znakowaniu APEX2. W tym badaniu przygotowanie próbki tradycyjnymi metodami APEX skutkowało wyraźnym oznakowaniem zorganizowanych, gładkich struktur retikulum endoplazmatycznego. Przy dużym powiększeniu ułożone w stos błony wydawały się pofałdowane, a między koncentrycznymi gęstościami błon występowały niejednolite przerwy, co wskazuje na słabą konserwację błony i ekstrakcję lipidów.

Próbka przygotowana przez cryoAPEX miała również wyraźnie zdefiniowane znakowanie zorganizowanych, gładkich struktur retikulum endoplazmatycznego, jednak błony były gładkie i równoległe, a ekstrakcja lipidów była niewielka lub żadna. Analiza TEM cienkich odcinków o grubości 90 nanometrów wykazała, że białko E oddziałujące z drożdżami Huntingtona było obecne w obwodowej retikulum endoplazmatycznym, a także w otoczce jądrowej. Dodatkowo, gęstość białka E oddziałującego z drożdżami Huntingtona została rozłożona na regularnie rozmieszczone ogniska wzdłuż błony retikulum endoplazmatycznego światła.

Dystrybucja i ogniska białka E oddziałujące z drożdżami Huntingtona były również widoczne w próbce przygotowanej za pomocą tradycyjnego utrwalania i odwadniania. Wystąpiło jednak znaczne rozerwanie błony i ekstrakcja, co sprawiło, że próbka nie była optymalna. Znakowanie APEX2 przeprowadzono przy użyciu trzech markerów komórkowych, z których mito-V5-APEX2 zapewniał specyficzne barwienie tylko mitochondriów, a CAAX-APEX2 powodował wyraźne barwienie tylko błony komórkowej.

Nie zaobserwowano znakowania w organellach wewnątrzkomórkowych. Barwienie światła Golgiego oceniano również przy użyciu markera Alpha MAN2-APEX2, jak opisano w naszym oryginalnym manuskrypcie Sengupta i wsp. Po tej procedurze można wykonać metody trójwymiarowe, takie jak tomografia elektronowa lub skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów, w celu zbadania rozkładu 3D białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Wiele substancji chemicznych użytych w tym protokole jest toksycznych, dlatego przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki, aby upewnić się, że chemikalia są obsługiwane przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.