Name: Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj metodę cryoAPEX do lokalizacji białek błonowych w komórkach HEK293 przy zachowaniu ultrastruktury. Technika łączy znacznik APEX2 z krioelektronową mikroskopią transmisyjną, umożliwiając precyzyjne badanie replikacji wirusów i mechanizmów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany tutaj protokół pochodzi z publikacji Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Praca ta jest wspierana przez granty R01GM10092 (dla S.M.) i AI081077 (R.V.S.) z National Institutes of Health, CTSI-106564 (do SM) z Indiana Clinical and Translational Sciences Institute oraz PI4D-209263 (dla S.M.) z Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Komórki HEK-293T należy wysiać na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm lub większej i osiągnąć konfluencję 60%–90% w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Komórki transfekcyjne z plazmidami ekspresyjnymi ssaków znakowanymi APEX2 przy użyciu odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów) zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
	<li>Po 12–15 godzinach od transfekcji przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń komórki z naczynia, delikatnie myjąc PBS. Można użyć odczynnika dysocjacyjnego, takiego jak trypsyna, jeśli jest to wymagane dla danego typu komórki. Wirować przy 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad.</li>
</ol>
2. Wiązanie chemiczne i reakcja peroksydazy
<ol>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad w 2 ml 2% aldehydu glutarowego (v/v) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Umieścić próbkę na lodzie i inkubować przez 30 minut. Osadzać próbkę w masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Od tego punktu aż do etapu 2.3.3 należy utrzymywać próbkę i roztwory na lodzie i przeprowadzić odwirowanie w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zarówno aldehyd glutarowy, jak i bufor kakodylanu sodu (zawierający arsen) są toksyczne. Podczas obchodzenia się z produktem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej. Roztwory zawierające aldehyd glutarowy i/lub bufor kakodylanu sodu należy usuwać jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
	<li>Przemyć osad 3x przez 5 minut 2 ml 0,1 M buforu kakodylanu sodu. W przypadku tych i kolejnych płukań delikatnie zawiesić osad komórkowy w wymaganym roztworze, a następnie odwirować przez 5 minut przy 500 x g i ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Należy zachować ostrożność przy powtarzaniu etapów granulowania i ponownego zawieszania, aby zminimalizować utratę próbki.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję peroksydazy
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór zawierający 1 mg/ml tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Rozpuść DAB przez energiczne wirowanie przez 5–10 min. 
		UWAGA: DAB jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy i należy się z nim obchodzić z zachowaniem odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Roztwory zawierające DAB należy traktować jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
		<li>Przemyć granulki przez ponowne wymieszanie w 3 ml roztworu DAB, a następnie granulować w ilości 500 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml roztworu DAB, do którego dodano nadtlenek wodoru, aby osiągnąć końcowe stężenie 5,88 mM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Osad staje się widocznie brązowy, co wskazuje na obecność nierozpuszczalnego produktu reakcji DAB. 
		UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji DAB dla każdej próbki. Zmianę koloru można monitorować pod mikroskopem świetlnym. Z naszego doświadczenia wynika, że 15-45 minutowa inkubacja jest wystarczająca dla większości białek. Nadtlenek wodoru powinien być uzyskany ze świeżo otwartej butelki lub takiej, która po otwarciu była dobrze szczelnie zamknięta.</li>
		<li>Osadzać komórki, a następnie przemywać 2x przez 5 minut 0,1 M buforem kakodylanu sodu, a następnie jedno płukanie w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco lub wybranej pożywce komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl krioprotekcyjnego roztworu DMEM (lub innego wybranego podłoża komórkowego) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 15% albuminy surowicy bydlęcej. Ponownie osadzać, nieznacznie zwiększając prędkość wirówki z 500 x g, jeśli jest to wymagane, aby uzyskać osad w gęstym roztworze krioprotekcyjnym. Wyrzucić większość supernatantu, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby osad nie wyschł. Przetransportować granulat komórkowy do wysokociśnieniowego przyrządu do zamrażania.</li>
</ol>
3. Zamrażanie pod wysokim ciśnieniem
<ol>
	<li>Napełnij wysokociśnieniowy zbiornik zamrażarki ciekłym azotem (LN2) i uruchom pompę, aby napełnić komorę próbki LN2. 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej. 
	UWAGA: Te kroki są specyficzne dla zamrażarki wysokociśnieniowej Leica EMPACT2.</li>
	<li>Odchować pozostały płyn z osadu komórkowego za pomocą rogu chusteczki laboratoryjnej lub ręcznika papierowego. Powinna pozostać wystarczająca ilość płynu, aby granulka utworzyła pastę o konsystencji podobnej do pasty do zębów. Powinna być na tyle cienka, aby można ją było zassać do końcówki pipety o pojemności 20 μl.</li>
	<li>Odessać 2–3 μl osadu komórkowego i umieścić go na nośniku membranowym. Całkowicie napełnij studzienkę nośnika membrany, tak aby napięcie powierzchniowe utworzyło lekką kopułę na górze, ale ciecz nie ze studzienki. Nie powinno być pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wsuń nośnik membrany do wkładu i zabezpiecz. Umieść wkład w urządzeniu HPF, które zostało przygotowane i zagruntowane, a następnie naciśnij Start, aby zamrozić.</li>
	<li>Sprawdź wykresy temperatury w funkcji czasu i ciśnienia w funkcji czasu, aby sprawdzić, czy ciśnienie osiągnęło 2100 barów, a temperatura osiągnęła -196 °C w ciągu 200 ms, a oba parametry pozostały stabilne przez 600 ms pomiaru.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 3.3 do 3.5 aż do momentu, gdy zostanie zużyta osadka z komórek lub zamrożona zostanie żądana liczba próbek.</li>
	<li>Trzymając wkłady zanurzone w LN2, wyjmij każdy nośnik membrany z wkładu, umieść go w plastikowej kapsułce i umieść plastikową kapsułkę w kriofiolce pełnej LN2. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Kriofiolki z próbkami mogą być przechowywane w LN2 dewar w krio-kanistrach lub krio-pudełkach.</li>
</ol>
4. Zamrożenie podstawiania
UWAGA: Używaj odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej podczas pracy z ciekłym azotem. Ponadto wiele substancji chemicznych użytych w kroku 4 jest toksycznych, w tym kwas garbnikowy, tetratlenek osmu i octan uranylu. Z tymi chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
<ol>
	<li>Napełnij automatyczną jednostkę do substytucji zamrażania LN2. Doprowadzić temperaturę do -90 °C.</li>
	<li>Przygotuj FS Mix 1 i rozpocznij FS.
	<ol>
		<li>W kapturze chemicznym przygotować roztwór 0,2% kwasu garbnikowego (w/v) i 5% wody demineralizowanej w acetonie i podwielokrotności 1 ml na próbkę do fiolek kriogenicznych. Umieść w LN2 do zamrożenia.</li>
		<li>Umieścić fiolki FS Mix 1 i kriofiolki zawierające granulki zamrożonych komórek w komorze na próbki jednostki FS. Przenieść kapsułkę wewnętrzną zawierającą nośnik membranowy z fiolki LN2 do odpowiedniej fiolki zawierającej FS Mix 1.</li>
		<li>Rozpocznij protokół FS od jego pierwszego kroku to 24 godziny w temperaturze -90°C. Po upływie 24 godzin należy wstrzymać FS i przemywać próbki 3 razy przez 5 minut acetonem schłodzonym do temperatury -90 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj FS Mix 2 i kompletny FS 
	UWAGA: Tetroksynek osmu jest wysoce toksyczną i utleniającą substancją chemiczną, z którą powinny obchodzić się wyłącznie przeszkolone osoby zgodnie z ustalonymi protokołami bezpieczeństwa. Należy przestrzegać protokołów przechowywania i usuwania roztworów zawierających osm, a także oznakowania obszarów laboratoryjnych, w których stosuje się tetratlenek osmu. Z tetratlenkiem osmu należy obchodzić się w kapturze chemicznym z osobistym wyposażeniem ochronnym, w tym ochroną oczu, fartuchem laboratoryjnym zapewniającym pełną ochronę ramion, podwójnymi rękawicami nitrylowymi i opcjonalnym respiratorem.
	<ol>
		<li>W okapie chemicznym przygotuj roztwór 1% tetratlenku osmu, 0,2% octanu uranylu i 5% wody DI w acetonie. Podwielokrotność 1 ml na próbkę przelać do fiolek kriogenicznych i umieścić w LN2 do zamrożenia. 
		UWAGA: Roztwory podstawowe kwasu garbnikowego (10% w/v w acetonie), tetratlenku osmu (10% w/v w acetonie) i octanu uranylu (8% w/v w metanolu) mogą być przygotowywane i przechowywane w kriofiolkach w LN2 dewara w celu ułatwienia przygotowania mieszanek FS.</li>
		<li>Umieścić kriofiolki z FS Mix 2 w jednostce FS i przenieść kapsułki z trzeciego płukania acetonem do fiolek FS Mix 2. Inkubować w FS Mix 2 przez 72 godziny w temperaturze -90 °C, a następnie stopniowo podgrzewać do 0 °C przez 12-18 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę 0 °C i myj 3x przez 30 min schłodzonym acetonem ze świeżo otwartej butelki.</li>
</ol>
5. Infiltracja i osadzanie żywicy
UWAGA: Żywica użyta tutaj (zobacz Tabelę Materiałów) jest toksyczna przed polimeryzacją i powinna być traktowana z zachowaniem odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Każdą niespolimeryzowaną żywicę należy zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
<ol>
	<li>Naciekać próbki rosnącym stężeniem żywicy rozpuszczonej w acetonie z nowo otwartej butelki. Przygotować mieszaninę składników żywicy A, B i D w plastikowej zlewce zgodnie ze wskazówkami producenta i inkubować próbki w następujących stężeniach żywicy: 2%, 4% i 8% przez 2 godziny każda w temperaturze 0 °C. Inkubować w 15%, 30%, 60%, 90% i 100% żywicy przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 4 godziny w mieszaninie składników A, B, C i D.</li>
	<li>Umieść nośniki membrany granulkami komórkowymi do góry w płaskich foremkach do zatapiania i wypełnij żywicą (A, B, C i D). W tym czasie do studzienek można dodać papierowe etykiety na próbki.</li>
	<li>Polimeryzować w piecu w temperaturze 60 °C przez 24-36 h. 
	UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po polimeryzacji.</li>
	<li>Wyjmij bloki z formy i ostudź. Aby usunąć nośnik membrany, najpierw umieść próbkę w pionowym uchwycie ultramikrotomu, gdzie można ją uwidocznić w powiększeniu. Oddziel nośnik membrany od bloku poprzez połączenie wklepywania ciekłego azotu w nośnik membrany w celu oddzielenia metalu od tworzywa sztucznego i użycia żyletki do odłupywania żywicy wokół nośnika membrany. Po oddzieleniu delikatnie podnieś nośnik membrany, pozostawiając kopułę granulki ogniw na powierzchni bloku.</li>
	<li>Umieść blok z odsłoniętymi granulkami komórkowymi skierowanymi do góry w płaskiej formie do zatapiania, która jest nieco głębsza niż pierwsza forma, i wypełnij żywicą. Polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 24–36 h. 
	UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po polimeryzacji.</li>
</ol>
6. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Przytnij blok wokół kulki komórkowej za pomocą żyletki. Następnie umieść blok w uchwycie na próbkę na ramieniu sekcyjnym ultramikrotomu. Za pomocą noża szklanego lub diamentowego przytnij blok do kształtu trapezu ściśle otaczającego granulkę komórki.</li>
	<li>Uzyskać ultracienkie sekcje granulki ogniw o długości fali 90 nm za pomocą noża szklanego lub diamentowego.</li>
	<li>Podnieś wstążkę sekcji na siatce TEM. Siatki szczelinowe z miedzi powlekane formvarem (1 x 2 mm2 szczeliny) są przydatne do obrazowania sekcji szeregowych. Wysuszyć siatkę, osuszając krawędź na kawałku bibuły filtracyjnej i przechowywać w pudełku do przechowywania siatki TEM. 
	UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po przecięciu na sekcje.</li>
</ol>
7. Obrazowanie TEM
<ol>
	<li>Zamontuj siatkę na uchwycie TEM i umieść w mikroskopie. Rutynowo używamy Tecnai T12 przy napięciu 80 kV do badań przesiewowych próbek cryoAPEX. Uzyskuj obrazy komórek i struktur subkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania dzięki znakowaniu APEX2.</li>
	<li>W razie potrzeby uzyskaj dodatkowy kontrast membrany poprzez zastosowanie ołowianego barwienia po wybarwieniu. Zobacz Rysunek 2 dla porównania próbek niebarwionych po barwieniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I–K) i ołowianych próbek po barwieniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A–H).
	<ol>
		<li>Unosić suche kratki przekrojem do dołu na kropli rozcieńczonego roztworu chlorku sodu (~1,5 mM), 2x po 1 min, a następnie 1x przez 10 min.</li>
		<li>Spławiać kratki na kropli roztworu ołowiu firmy Sato przez 1 min. Myć unosząc się na roztworze chlorku sodu 3x przez 1 min, a następnie na wodzie DI 3x przez 1 min. Nadmiar płynu zetrzeć z rusztów i przechowywać w pojemniku na siatkę. 
		UWAGA: Ołów jest toksyczną substancją chemiczną i należy się z nim obchodzić przy zachowaniu odpowiednich procedur bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej. Roztwory zawierające ołów należy utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obraz próbek po barwieniu na TEM. 
	UWAGA: W tradycyjnym przygotowaniu próbki do TEM etap kontrastowania ołowiu jest wykonywany przed obrazowaniem TEM. Zaleca się jednak, aby w przypadku próbek cryoAPEX obrazowanie przeprowadzać najpierw na próbkach niekontrastowych. Gwarantuje to, że sygnał z tagu może być łatwo zlokalizowany dzięki jego silnemu kontrastowi z jaśniej zabarwionymi strukturami komórkowymi. W przypadku wielu próbek nie będzie wymagane dalsze barwienie; Jeśli jednak pożądany jest dodatkowy kontrast membranowy, można przeprowadzić barwienie ołowiowe (krok 7.2) i ponownie zobrazować próbkę.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół cryoAPEX zapewnia solidną metodę charakteryzowania lokalizacji białek błonowych w środowisku komórkowym. Nie tylko zastosowanie genetycznie kodowanego znacznika APEX2 zapewnia precyzyjną lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale zastosowanie kriofiksacji i odwodnienia w niskiej temperaturze zapewnia doskonałe zachowanie i barwienie otaczającej ultrastruktury komórkowej. W połączeniu podejścia te są potężnym narzędziem do lokalizacji białka z dużą precyzją w jego subkomórkow...

Badania biologiczne często obejmują kwestie rozwiązania lokalizacji białek subkomórkowych w komórkach i organellach. Mikroskopia immunofluorescencyjna dostarcza użytecznego obrazu lokalizacji białek w niskiej rozdzielczości, a ostatnie postępy w obrazowaniu superrozdzielczym przesuwają granice rozdzielczości dla białek znakowanych fluorescencyjnie1,2,3. Jednak mikroskopia elektronowa (EM) pozostaje złotym standardem w obrazowaniu ultrastruktury komórkowej o wysokiej rozdzielczości, chociaż znakowanie białek jest wyzwaniem.
Historycznie, kilka metod EM było używanych do podejścia do kwestii lokalizacji białek ultrastrukturalnych. Jedną z najczęściej stosowanych metod jest mikroskopia immunoelektronowa (IEM), w której do wykrycia białka stosuje się przeciwciała pierwotne specyficzne dla antygenu. Sygnał EM jest generowany przez zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z cząstkami o dużej gęstości elektronów, najczęściej złotem koloidalnym4,5. Alternatywnie, przeciwciała sprzężone z enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanu (HRP), mogą być używane do wytwarzania osadu o dużej gęstości elektronów6,7,8. Istnieją dwa główne podejścia do IEM, nazywane etykietowaniem przed osadzaniem i po osadzaniu. W przypadku wstępnego osadzania IEM przeciwciała są wprowadzane bezpośrednio do komórek, co wymaga utrwalenia światła i przepuszczalności komórek9,10,11. Oba kroki mogą uszkodzić ultrastructure12,13. Opracowanie istotnie mniejszych przeciwciał składających się z fragmentu przeciwciała Fab sprzężonego z nanozłotem o długości 1,4 nm pozwala na zastosowanie bardzo łagodnych warunków przenikania; jednak nanozłoto jest zbyt małe, aby można je było bezpośrednio zobrazować w ramach TEM i wymaga dodatkowych kroków wzmacniających, aby stało się widoczne14,15,16. W IEM po zatopieniu, przeciwciała są nakładane na cienkie odcinki komórek, które zostały w pełni przetworzone przez utrwalenie, odwodnienie i zatopienie w żywicy17. Chociaż takie podejście pozwala uniknąć etapu przepuszczalności, zachowanie interesującego epitopu podczas przygotowywania próbki jest trudne18,19,20. Metoda Tokuyasu polegająca na utrwalaniu światła, a następnie zamrażaniu, kriosekcji i wykrywaniu przeciwciał zapewnia lepsze zachowanie epitopów21,22. Jednak wymagania techniczne krioultramikrotomii, a także nieoptymalny kontrast osiągany w komórce, są wadami23.
Użycie genetycznie kodowanych znaczników eliminuje wiele trudności związanych z IEM związanych z wykrywaniem interesującego białka. Dostępne są różne tagi, w tym HRP, ferrytyna, ReAsH, miniSOG i metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Każda z nich ma zalety w porównaniu z poprzednimi metodami, ale każda ma również wady uniemożliwiające powszechne stosowanie. Wady te wahają się od braku aktywności HRP w cytozolu do dużego rozmiaru znacznika ferrytyny, wrażliwości ReAsH na światło oraz małego rozmiaru i braku kompatybilności z barwieniem komórkowym metalotioneiny. Ostatnio białko pochodzące z peroksydazy askorbinianowej zostało zaprojektowane jako znacznik EM o nazwie APEX233,34. Jako peroksydaza, APEX2 może katalizować utlenianie 3,3' diaminobenzydyny (DAB), wytwarzając osad, który reaguje z tetratlenkiem osmu, zapewniając lokalny kontrast EM przy minimalnej dyfuzji z białka będącego przedmiotem zainteresowania (mniej niż 25 nm)33,35. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod opartych na HRP, APEX2 jest niezwykle stabilny i pozostaje aktywny we wszystkich przedziałach komórkowych33. Próbki mogą być przetwarzane do TEM przy użyciu tradycyjnego barwienia próbek EM i metod, które pozwalają na dobrą wizualizację otaczających struktur33,34,36. Ze względu na niewielkie rozmiary, stabilność i wszechstronność, APEX2 stał się znacznikiem EM o dużym potencjale.
Wiele z omówionych powyżej podejść nie może być lub jeszcze nie zostało połączonych z obecnym stanem techniki w zakresie konserwacji ultrastrukturalnej, kriofiksacji i niskotemperaturowego substytucji zamrażania. W związku z tym cierpią z powodu braku konserwacji błony i/lub barwienia komórek w celu określenia dokładnej lokalizacji białka. To z konieczności ogranicza rozdzielczość i interpretację danych, które można uzyskać. Kriofiksacja przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) polega na szybkim zamrażaniu próbek w ciekłym azocie pod wysokim ciśnieniem (~2,100 bar), co powoduje witryfikację, a nie krystalizację próbek wodnych, zachowując w ten sposób komórki w stanie zbliżonym do natywnego37,38,39. Po HPF następuje substytucja przez wymrażanie (FS), odwadnianie w niskiej temperaturze (-90 °C) w acetonie połączone z inkubacją z typowymi barwnikami EM, takimi jak tetratlenek osmu i octan uranylu. HPF i FS razem zapewniają wyraźną przewagę nad tradycyjnym utrwalaniem chemicznym (dłuższy proces, który może prowadzić do artefaktów) i odwadnianiem alkoholu w temperaturze pokojowej lub na lodzie (co może prowadzić do ekstrakcji lipidów i cukrów), a zatem pożądane jest połączenie z najlepszymi znacznikami EM do wykrywania białek.
Jednym z powodów, dla których HPF/FS nie został połączony z etykietowaniem APEX2, jest to, że lekkie chemiczne utrwalenie jest warunkiem wstępnym dla reakcji peroksydazy, ograniczając dyfuzję produktu reakcji DAB. W dotychczasowych badaniach APEX2 reakcja wiązania i peroksydazy jest stosowana tradycyjnymi metodami EM do barwienia i odwadniania alkoholem33,36. Wykazano jednak, że po utrwaleniu chemicznym za pomocą HPF/FS zapewnia wyraźną przewagę w konserwacji nad tradycyjnym utrwalaniem chemicznym i samym odwadnianiem alkoholem40. Utrata integralności ultrastrukturalnej obserwowana w tradycyjnych próbkach TEM wydaje się być mniej związana z utrwalaniem niż z odwodnieniem, które zwykle odbywa się przy użyciu alkoholu w temperaturze pokojowej lub na lodzie, i może prowadzić do ekstrakcji lipidów i cukrów40,41. Aby opracować metodę cryoAPEX, postawiliśmy hipotezę, że wiązanie chemiczne i reakcja peroksydazy, a następnie HPF i FS, dadzą optymalny wynik pod względem konserwacji ultrastrukturalnej.
Tutaj prezentujemy protokół cryoAPEX, który łączy znakowanie APEX2 z metodami kriofiksacji i substytucji przez zamrożenie (Rysunek 1). Ten prosty protokół składa się z transfekcji białka znakowanego APEX2, chemicznego utrwalenia komórek i reakcji peroksydazy. Następnie wykonywane są HPF i FS, a następnie typowe zatapianie żywicy i cienkie cięcie. Obrazowanie TEM ujawnia doskonałe zachowanie ultrastruktury przy użyciu tej metody. Dodatkowo zaobserwowano subkomórkową lokalizację i dystrybucję przestrzenną białka świetlnego retikulum endoplazmatycznego (ER). Metoda ta jest szeroko przydatna do wykrywania lokalizacji białek błonowych w komórkach do analizy mikroskopii elektronowej. W naszych rękach metoda sprawdziła się w przypadku różnych linii komórkowych hodowanych w hodowlach tkankowych, w tym HEK-293T (ludzka nerka embrionalna), HeLa (ludzki rak szyjki macicy), Cos7 (fibromlast nerki afrykańskiej zielonej małpy) i BHK (nerka chomika). Szczegółowa instrukcja została opisana poniżej przy użyciu ogniw HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>Hydrat tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Aceton (destylowany szkłem)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki; Plastikowa, jednorazowa mikroskopia elektronowa o pojemności 120 ml</td><td>Nauki</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do przechowywania kriogenicznego, 2 ml</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowa żywica epoksydowa A, M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy B, utwardzacz 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy C, akcelerator 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, jednoskładnikowy D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania, standardowa płaska, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania, standardowa płaska, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu; Nu-Serum IV Pożywka</td> wzrostowa <td>Suplement Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Szklane nóżki Łódki, 6,4 mm</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do szkła</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 10% roztwór wodny</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka wysokociśnieniowa z systemem szybkiego transferu</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Produkt archiwalny zastąpiony przez Leica EM</td></tr><tr><td>ICE Nadtlenek wodoru 30% roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji lipofekcaminy 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik membranowy do EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu, krystaliczna</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 20X, ultra czysty</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe kapsułki do AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>Siatki szczelinowe, 2 x 1 mm miedź z folią nośną Formvar</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu, 0,2 m, pH 7,4</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulka 500 g (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>kwasu garbnikowego</td><td>Sciences 21710</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych, polistyren, sterylne, Corning, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Paski</td> <td>noża do szkła UltraMikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu Dihydrat</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda cryoapex do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Kluczowe zdarzenia komórkowe, takie jak transdukcja sygnału i transport błonowy, polegają na prawidłowym rozmieszczeniu białek w kompartmentach komórkowych. Zrozumienie precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej białek jest zatem ważne dla udzielenia odpowiedzi na wiele pytań biologicznych. Poszukiwanie solidnej etykiety do identyfikacji lokalizacji białek w połączeniu z odpowiednią konserwacją i barwieniem komórek było historycznie trudne. Ostatnie postępy w obrazowaniu za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) doprowadziły do opracowania wielu metod i strategii mających na celu zwiększenie zachowania komórek i znakowanie białek docelowych. Stosunkowo nowy znacznik genetyczny oparty na peroksydazie, APEX2, jest obiecującym liderem w dziedzinie klonowalnych znaczników aktywnych EM. W ostatnich latach nastąpił również postęp w przygotowywaniu próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wraz z pojawieniem się kriofiksacji przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) oraz odwadniania i barwienia w niskiej temperaturze poprzez substytucję przez wymrażanie (FS). HPF i FS zapewniają doskonałe zachowanie ultrastruktury komórkowej do obrazowania TEM, ustępując jedynie bezpośredniemu krioobrazowaniu próbek ciała szklistego. Poniżej przedstawiamy protokół dla metody cryoAPEX, który łączy w sobie wykorzystanie znacznika APEX2 z HPF i FS. W tym protokole białko będące przedmiotem zainteresowania jest oznaczane APEX2, po którym następuje utrwalenie chemiczne i reakcja peroksydazy. Zamiast tradycyjnego barwienia i odwadniania alkoholem w temperaturze pokojowej, próbka jest kriofiksowana i poddawana odwadnianiu i barwieniu w niskiej temperaturze za pomocą FS. Korzystając z cryoAPEX, można nie tylko zidentyfikować interesujące białko w przedziałach subkomórkowych, ale także uzyskać dodatkowe informacje dotyczące jego topologii w strukturalnie zachowanej błonie. Pokazujemy, że ta metoda może zapewnić wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby rozszyfrować wzorce dystrybucji białek w świetle organelli i odróżnić kompartmentalizację białka w jednej organelli w bliskiej odległości od innych nieznakowanych organelli. Co więcej, cryoAPEX jest proceduralnie prosty i podatny na komórki hodowane w hodowli tkankowej. Nie jest to trudniejsze technicznie niż typowe metody kriofiksacji i substytucji przez zamrożenie. CryoAPEX ma szerokie zastosowanie w analizie TEM dowolnego białka błonowego, które można znakować genetycznie.

W celu porównania zachowania ultrastruktury przy użyciu metody cryoAPEX z tradycyjną fiksacją i odwodnieniem, przygotowano próbki, w których peptyd błony retikulum endoplazmatycznego (ERM; ER membrane) został oznakowany APEX2 i przetransfekowany do komórek HEK-293T. ERM-APEX2 lokalizuje się na cytoplazmatycznej stronie ER i przekształca strukturę ER w morfologicznie odmienne struktury znane jako zorganizowane gładkie ER (OSER)34,42,43...

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Metoda ta łączy w sobie zdolność do barwienia białka błonowego przy jednoczesnym zachowaniu integralności błony i architektury subkomórkowej. Jest więc naprawdę potężny w precyzyjnym lokalizowaniu białka związanego z błoną. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona w sobie zastosowanie solidnego, genetycznie klonowalnego znacznika, APEX2, z najnowocześniejszymi metodami konserwacji komórek w mikroskopii elektronowej, w tym kriofiksacją i substytucją przez zamrożenie.Razem umożliwiają one precyzyjną lokalizację białka w dobrze zachowanej komórce. Protokół ten może być używany do analizowania mechanizmów, za pomocą których wirusy replikują się wewnątrz komórki gospodarza. Wirusy często przejmują kontrolę nad białkami gospodarza podczas schematu infekcji.Wirusy to małe genomy, które wykorzystują do replikacji w komórkach gospodarza. Ostatnio udało nam się oznaczyć te białka za pomocą tej technologii na podstawie niepublikowanych danych, aby zrozumieć, w jaki sposób wirusy się replikują. Technika ta okazała się bardzo istotna w niedawnym wspólnym badaniu nad toksyną bakteryjną, która powoduje rozpad Golgiego.Korzystając z cryoAPEX, byliśmy w stanie precyzyjnie zlokalizować toksynę za pomocą rozdrobnionych kawałków Golgiego, co było naprawdę trudne do zobaczenia w inny sposób przy użyciu normalnych technik immunofluorescencji. Technikę tę zademonstrują Elaine Mihelc, doktorantka, i pracownik naukowy, Stephanie Angel, z naszych laboratoriów. Po wysianiu komórek HEK293 w naczyniu, transfekować komórki plazmidami ekspresyjnymi ssaków oznaczonymi APEX2 za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie ze wskazówkami producenta.Po 12-15 godzinach od transfekcji przemyj komórki raz PBS. Następnie zmyj komórki PBS z naczynia do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Wirować przy 500 x g przez pięć minut.Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach 2% aldehydu glutarowego i 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu o pH 7,4 w temperaturze pokojowej. Umieścić próbkę na lodzie w celu inkubacji przez 30 minut. Następnie osadzać próbkę w masie 500 x g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przemyć osad trzy razy przez pięć minut, każdy z dwoma mililitrami 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu, odwirowując w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Aby przeprowadzić reakcję peroksydazy, przemyj osad przez ponowne zawieszenie w trzech mililitrach roztworu DAB, a następnie granulowanie w ilości 500 x g przez pięć minut.Następnie ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach roztworu DAB z 5,88 milimolowym nadtlenkiem wodoru. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Osad staje się widocznie brązowy, co wskazuje na obecność nierozpuszczalnego produktu reakcji DAB.Po ponownym przemyciu buforem kakodylanu sodu w DMEM, zgodnie z manuskryptem, ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach roztworu krioprotektantu DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 15% albuminy surowicy bydlęcej. Przenieś zawiesinę komórek do 0,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Ponownie osad, nieznacznie zwiększając prędkość wirówki z 500 x g.Wyrzucić większość supernatantu, upewniając się, że pozostała wystarczająca ilość płynu, aby osad nie wyschł. Odchować pozostały płyn z osadu komórkowego za pomocą rogu chusteczki laboratoryjnej lub ręcznika papierowego. Pozostaw wystarczającą ilość płynu, aby granulka utworzyła pastę o konsystencji podobnej do pasty do zębów.Odessać od dwóch do trzech mikrolitrów osadu komórkowego i umieścić go na nośniku membranowym. Całkowicie napełnij studzienkę nośnika membrany, tak aby napięcie powierzchniowe utworzyło lekką kopułę na górze. Wsuń nośnik membrany do wkładu i zabezpiecz.Umieść wkład w urządzeniu HPF, które zostało przygotowane i zagruntowane, a następnie naciśnij przycisk Start, aby zamrozić. Trzymając wkłady zanurzone w ciekłym azocie, wyjmij nośnik membrany z wkładu. Umieść w plastikowej kapsułce i umieść plastikową kapsułkę w Cryovial pełnym ciekłego azotu.W kapturze chemicznym przygotuj jeden mililitr na próbkę roztworu 0,2% wagowo kwasu garbnikowego i 5% wody DI w acetonie w Cryovialu. Umieść je w ciekłym azocie do zamrożenia. Umieścić jedną fiolkę z mieszanką do substytucji przez zamrożenie i kriowiale zawierające granulki zamrożonych komórek w komorze na próbki jednostek do substytucji przez zamrożenie.Przenieść kapsułkę wewnętrzną zawierającą nośnik membranowy z fiolki z ciekłym azotem do odpowiedniej fiolki zawierającej mieszaninę z substytucją przez zamrożenie. Rozpocznij protokół substytucji zamrażania w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach wstrzymać substytucję przez zamrażanie i przemyć próbki trzykrotnie przez pięć minut acetonem schłodzonym do 90 stopni Celsjusza.Następnie w kapturze chemicznym przygotuj jeden mililitr na próbkę roztworu 1% tetratlenku osmu, 0,2% octanu uranylu i 5% wody DI w acetonie w Cryovial i umieść je w ciekłym azocie do zamrożenia. Umieścić Cryovials z substytucją zamrażania, wymieszać dwie w jednostce substytucji zamrażania i przenieść kapsułki z trzeciego płukania acetonem do wymieszania przez zamrożenie dwóch fiolek. Inkubuj je i zamrażaj substytucję, mieszaj dwa przez 72 godziny w temperaturze 90 stopni Celsjusza, a następnie stopniowo podgrzewaj do zera stopni Celsjusza przez 12-18 godzin.Utrzymuj temperaturę na poziomie zero stopni Celsjusza i dodaj wstępnie schłodzony aceton do fiolek, aby umyć je trzy razy przez 10 minut każda. Przygotuj wybraną mieszaninę żywicy w plastikowej zlewce zgodnie ze wskazówkami producenta i dodaj 2%4%i 8%żywicy do fiolek, aby zanurzyć kapsułki. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze zero stopni Celsjusza.Następnie inkubuj w 15%30%60%90% i 100% składnikach żywicy A, B i D tylko przez cztery godziny każdy w temperaturze pokojowej. Po upływie 20 godzin przygotować mieszaninę składników żywicznych A, B, C i D i inkubować przez cztery godziny. Umieść nośniki membrany stroną z granulkami komórkowymi do góry w płaskich foremkach do zatapiania i wypełnij mieszaniną żywicy A, B, C i D. Umieść je w piekarniku do polimeryzacji w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24-36 godzin.Po polimeryzacji wyjmij bloki z formy i umieść próbkę w pionowym uchwycie ultramikrotomu, gdzie można ją uwidocznić w powiększeniu. Oddziel nośnik membrany od bloku poprzez połączenie wklepywania ciekłego azotu w nośnik membrany w celu oddzielenia metalu od tworzywa sztucznego i użycia żyletki do odłupywania żywicy wokół nośnika membrany. Po oddzieleniu delikatnie podnieś nośnik membrany, pozostawiając kopułę granulki ogniw na powierzchni bloku.Umieść blok z odsłoniętymi granulkami komórkowymi skierowanymi do góry w płaskiej formie do zatapiania, która jest nieco głębsza niż pierwsza forma i wypełnij składnikami żywicy A, B, C i D. Polimeryzuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24-36 godzin. Przytnij blok wokół kulki komórkowej za pomocą żyletki. Następnie umieść blok w uchwycie na próbkę na ramieniu sekcyjnym ultramikrotomu.Za pomocą noża szklanego lub diamentowego przytnij blok do kształtu trapezu ściśle otaczającego granulkę komórki. Uzyskaj 90-nanometrowe ultracienkie odcinki granulki komórkowej za pomocą noża szklanego lub diamentowego. Podnieś wstążkę sekcji na siatce TEM.Osusz siatkę, osuszając krawędź na kawałku bibuły filtracyjnej i przechowuj ją w pudełku do przechowywania siatki TEM. Zamontuj siatkę na uchwycie TEM i umieść uchwyt w mikroskopie. Użyj Tecnai T12 o napięciu 80 kilowoltów do przesiewania próbek cryoAPEX.Uzyskuj obrazy komórek i struktur subkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania dzięki znakowaniu APEX2. W tym badaniu przygotowanie próbki tradycyjnymi metodami APEX skutkowało wyraźnym oznakowaniem zorganizowanych, gładkich struktur retikulum endoplazmatycznego. Przy dużym powiększeniu ułożone w stos błony wydawały się pofałdowane, a między koncentrycznymi gęstościami błon występowały niejednolite przerwy, co wskazuje na słabą konserwację błony i ekstrakcję lipidów.Próbka przygotowana przez cryoAPEX miała również wyraźnie zdefiniowane znakowanie zorganizowanych, gładkich struktur retikulum endoplazmatycznego, jednak błony były gładkie i równoległe, a ekstrakcja lipidów była niewielka lub żadna. Analiza TEM cienkich odcinków o grubości 90 nanometrów wykazała, że białko E oddziałujące z drożdżami Huntingtona było obecne w obwodowej retikulum endoplazmatycznym, a także w otoczce jądrowej. Dodatkowo, gęstość białka E oddziałującego z drożdżami Huntingtona została rozłożona na regularnie rozmieszczone ogniska wzdłuż błony retikulum endoplazmatycznego światła.Dystrybucja i ogniska białka E oddziałujące z drożdżami Huntingtona były również widoczne w próbce przygotowanej za pomocą tradycyjnego utrwalania i odwadniania. Wystąpiło jednak znaczne rozerwanie błony i ekstrakcja, co sprawiło, że próbka nie była optymalna. Znakowanie APEX2 przeprowadzono przy użyciu trzech markerów komórkowych, z których mito-V5-APEX2 zapewniał specyficzne barwienie tylko mitochondriów, a CAAX-APEX2 powodował wyraźne barwienie tylko błony komórkowej.Nie zaobserwowano znakowania w organellach wewnątrzkomórkowych. Barwienie światła Golgiego oceniano również przy użyciu markera Alpha MAN2-APEX2, jak opisano w naszym oryginalnym manuskrypcie Sengupta i wsp. Po tej procedurze można wykonać metody trójwymiarowe, takie jak tomografia elektronowa lub skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów, w celu zbadania rozkładu 3D białka będącego przedmiotem zainteresowania.Wiele substancji chemicznych użytych w tym protokole jest toksycznych, dlatego przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki, aby upewnić się, że chemikalia są obsługiwane przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Poznaj metodę cryoAPEX do lokalizacji białek błonowych w komórkach HEK293 przy zachowaniu ultrastruktury. Technika łączy znacznik APEX2 z krioelektronową mikroskopią transmisyjną, umożliwiając precyzyjne badanie replikacji wirusów i mechanizmów komórkowych.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Przeglądaj więcej filmów