Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny
23 czerwca 2020
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.
Metoda ta może być stosowana do analizy reaktywnych form tlenu w komórkach przylegających tylko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz do ilościowego określania intensywności reaktywnych form tlenu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny. Zacznij od wysiewu dwóch razy 10 do piątych komórek raka jelita grubego HCT116 w DMEM do każdej studzienki 24-dołkowej płytki.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną 100-mikromolowym siarczanem żelazawym lub 10-mikromolową pożywką zawierającą doksorubicynę i inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny. Przygotować roztwór DCFH-DA, rozpuszczając 4,85 miligrama DCFH-DA w jednym mililitrze DMSO, aby uzyskać 10-milimolowy roztwór podstawowy.
Tuż przed dodaniem go do studzienek rozcieńczyć bulion wstępnie podgrzanym DMEM, aby uzyskać 10-mikromolowy roztwór roboczy i wirować go przez 10 sekund. Aby zabarwić komórki, usuń pożywkę zawierającą lek i umyj je raz DMEM. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu roboczego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po inkubacji wyjąć DCFH-DA ze studzienek i umyć je dwukrotnie DMEM i raz PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdej studzienki. Użyj zielonego kanału białka fluorescencyjnego w mikroskopie fluorescencyjnym, aby wykonać reprezentatywne obrazy komórek.
Następnie usunąć PBS i dodać 200 mikrolitrów buforu do testu radioimmunoprecypitacji do każdej studzienki. Inkubuj płytkę na lodzie przez pięć minut i zbierz lizaty komórkowe do 1,5 mililitrowych probówek. Odwirować probówki w temperaturze 21, 130 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie przenieść 100 mikrolitrów supernatantu na czarną 96-dołkową płytkę. Użyj czytnika mikropłytek o długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 530 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję w każdym dołku. Następnie zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda, przenosząc jeden mikrolitr supernatantu na przezroczystą 96-dołkową płytkę ze 100 mikrolitrami roztworu do oznaczania białek.
Użyj stężeń białka, aby znormalizować intensywność fluorescencji. Komórki raka jelita grubego HCT116 traktowano 100 mikromolowym siarczanem żelazawym lub 10 mikromolową doksorubicyną w celu wywołania stresu oksydacyjnego. Zgodnie z oczekiwaniami, zielona fluorescencja została dramatycznie zwiększona przez oba zabiegi.
Aby określić ilościowo względne zmiany intensywności, komórki poddano lizie i znormalizowano stężeniami białek. Względna intensywność fluorescencji została istotnie zwiększona przez siarczan żelazawy lub doksorubicynę. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby roztwór DCFH-DA był świeży i unikał ekspozycji na światło, a także aby zminimalizować zaburzenia stanu komórek i wykonać intensywne płukanie PBS tuż przed wykonaniem zdjęcia.
Oprócz wykrywania całkowitego ROS za pomocą tego protokołu, można wykonać w szczególności ROS, taki jak nadtlenek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykrywania całkowitej ilości wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu DCFH-DA. Metoda ta umożliwia wizualizację lokalizacji ROS w komórkach adherentnych oraz ilościowe określenie intensywności ich występowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Analiza reaktywnych form tlenu
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Reaktywne formy tlenu odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie lokalizacji ROS może dostarczyć cennych informacji na temat procesów komórkowych.
- Techniki fluorescencyjne są powszechnie stosowane do detekcji ROS.
- Niniejszy protokół został opracowany z myślą o łatwości użycia i efektywności kosztowej.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody wykrywania ROS w komórkach adherentnych.
- Umożliwienie wizualizacji i kwantyfikacji ROS przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Uproszczenie procesu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Wysiewanie komórek raka jelita grubego HCT116 na płytkę 24-dołkową.
- Inkubowanie komórek z siarczanem żelaza(II) lub doksorubicyną.
- Przygotowanie roztworu DCFH-DA do detekcji ROS.
- Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej i czytnika płytek do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja lokalizacji ROS w komórkach.
- Ilościowe oznaczenie intensywności ROS wykazało efektywność metody.
- Protokół okazał się prosty i wydajny dla badaczy.
- Kosztoefektywne podejście do analizy ROS w badaniach komórkowych.
Wnioski
- Protokół zapewnia prostą metodę detekcji ROS.
- Można go zastosować do różnych typów komórek adherentnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby uzyskać głębszy wgląd w mechanizmy komórkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczanie całkowitej ilości reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach adherentnych z wykorzystaniem barwienia DCFH-DA zapewnia zestandaryzowany odczyt stresu oksydacyjnego, który jest kluczowym czynnikiem w modelowaniu chorób i badaniach odpowiedzi na leki. Metoda ta umożliwia rzetelną ocenę stanu redoks komórek po perturbacjach chemicznych lub genetycznych, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów we wczesnej fazie odkrywania leków. Jej efektywność kosztowa i skalowalność sprawiają, że nadaje się ona do integracji z wysokoprzepustowym przesiewaniem oraz procesami translacyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę szlaków stresu oksydacyjnego w modelach komórkowych istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów modulujących komórkową równowagę redoks.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie interwencji związków chemicznych lub genetycznych z poziomem ROS.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia odtwarzalny test oparty na fluorescencji do ilościowego oznaczania ROS w komórkach adherentnych.
- Wspiera standaryzację i normalizację testu poprzez pomiary stężenia białka.
- Umożliwia wiarygodną ocenę stresu oksydacyjnego indukowanego związkami w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki stresu oksydacyjnego z modelami chorób w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć in vitro do przedklinicznej walidacji czynników modulujących potencjał redoks.
- Oferuje wartość prognostyczną w zakresie bezpieczeństwa i skuteczności związków w odniesieniu do mechanizmów oksydacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół detekcji ROS oparty na DCFH-DA wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji związku wiodącego, zapewniając ilościowy odczyt modulacji stresu oksydacyjnego w systemach komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących celów i szlaków związanych z procesami redox.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowane, ilościowe pomiary ROS do selekcji związków.
- Analityka: Integruje normalizację intensywności fluorescencji w celu rzetelnego porównywania danych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki dotyczące stresu oksydacyjnego in vitro z walidacją w modelach przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowalny, kosztowo efektywny test dla różnych typów komórek i interwencji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w biologii redoks i walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje kwantyfikację ROS dzięki skalowalnym i powtarzalnym przepływom pracy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie interwencji z efektami stresu oksydacyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów modulujących redoks z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz obsługi czytnika płytek.
- Niezbędny jest dostęp do standardowej infrastruktury do hodowli komórkowych i oznaczania ilości białka.
- Wymagane jest ostrożne obchodzenie się z odczynnikiem DCFH-DA, aby uniknąć degradacji wywołanej światłem.
- Standaryzacja etapów płukania i normalizacji jest krytyczna dla powtarzalności wyników.
- Protokół można dostosować do różnych linii komórek adherentnych, jednak może on wymagać optymalizacji dla konkretnych modeli.
