Name: Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Poznaj metodę wykrywania całkowitych reaktywnych form tlenu w komórkach przyległych za pomocą barwienia DCFH-DA. Protokół umożliwia wizualizację i ilościową analizę ROS przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (K01DK114390), Research Scholar Grant od American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), Research Pilot Project Grant od University of New Mexico Environmental Health Signature Program i Superfund (P42 ES025589), Shared Resources Pilot Project Award oraz Research Program Support Pilot Project Award od UNM comprehensive cancer center (P30CA118100), oraz nagroda dla nowego badacza z Dedykowanych Funduszy Badań nad Zdrowiem na Wydziale Medycznym Uniwersytetu Nowego Meksyku.

1. Sadzenie komórek
<ol>
	<li>Wysiewać 2 x 105 komórek HCT116 raka jelita grubego na basenie na 24-dołkowej płytce i utrzymywać komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zastąp pożywkę lub bez niej 100 μM siarczanu żelazawego (FS) lub 10 μM doksorubicyny (DOX) zawierającej pożywkę i inkubuj przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu DCFH-DA
<ol>
	<li>Rozpuścić 4,85 mg DCFH-DA w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 10 mM roztworu podstawowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy wstępnie podgrzanym DMEM w roztworze roboczym 10 μM tuż przed dodaniem go do studzienek.</li>
	<li>Wiruj roztwór roboczy przez 10 sekund.</li>
</ol>
3. Barwienie DCFH-DA
<ol>
	<li>Usuń pożywkę zawierającą lek i przemyj raz DMEM.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu roboczego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór roboczy DCFH-DA. Przemyć raz DMEM i 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).</li>
	<li>Dodaj 500 μl 1x PBS do każdej studzienki.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazowania i pomiar intensywności
<ol>
	<li>Wykonaj reprezentatywne obrazy fluorescencyjne dla każdej studzienki przy użyciu kanału białka zielonej fluorescencji (GFP) na mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
	<li>Po wykonaniu zdjęć usuń PBS i dodaj 200 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 5 minut, a następnie zebrać lizat komórkowy do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 21,130 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 100 μl supernatantu na czarną płytkę 96-dołkową i zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika fluorescencyjnego na mikropłytkach o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm.</li>
	<li>Przenieść 1 μl supernatantu na klarowną 96-dołkową płytkę zawierającą 100 μl 1x roztworu do oznaczania białek w celu zmierzenia stężenia białka za pomocą testu Bradforda9.</li>
	<li>Normalizuj intensywność fluorescencji za pomocą stężeń białek.</li>
</ol>

<ol><li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organization+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li>
<li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li>
<li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).</li>
<li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li>
<li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li>
<li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).</li>
<li>Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKruger%2C+NJ+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).</li>
<li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li>
<li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li>
<li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder%2Fphosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Guang+Pu+Xue+Yu+Guang+Pu+Fen+Xi%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół eksperymentalny jest łatwo odtwarzalny w celu pomiaru całkowitego ROM w komórkach. Kluczowe kroki obejmują świeżość roztworu DCFH-DA i unikanie ekspozycji na światło, minimalizację zakłóceń stanu komórek i intensywne mycie PBS tuż przed wykonaniem zdjęć. W celu przygotowania roztworu roboczego DCFH-DA, roztwór podstawowy należy dodać do wstępnie podgrzanego DMEM tuż przed dodaniem do płytki 24-dołkowej. Powodem jest to, że stare rozwiązania, które generują wysoką fluorescencję tła lub ekspozycję na...

Trzy główne reaktywne formy tlenu (ROS) wytwarzane przez metabolizm komórkowy, które mają znaczenie fizjologiczne, to anion ponadtlenkowy, rodnik hydroksylowy i nadtlenek wodoru1. W niskich stężeniach uczestniczą w fizjologicznych procesach komórkowych, ale w wysokich stężeniach mają niekorzystny wpływ na szlaki sygnalizacji komórkowej1. Nasz organizm rozwinął systemy antyoksydacyjne, które skutecznie przeciwdziałają nadmiernemu ROS. Jednak stres oksydacyjny może wystąpić, gdy ROS przytłacza zdolność detoksykacyjną naszego organizmu, co przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym stanów zapalnych, raka i chorób neurodegeneracyjnych2,3,4. Celem tej metody jest określenie całkowitej komórkowej ROS w komórkach przylegających za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Uzasadnieniem jest to, że utlenianie DCFH-DA do 2'-7'dichlorofluoresceiny (DCF) jest szeroko stosowane do całkowitego wykrywania ROS, w tym rodników hydroksylowych (•OH) i dwutlenku azotu (•NO2). Mechanistycznie DCFH-DA jest wychwytywany przez komórki, w których esterazy komórkowe odcinają grupy acetylowe, w wyniku czego powstaje DCFH. Utlenianie DCFH przez ROS przekształca cząsteczkę w DCF, który emituje zieloną fluorescencję o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 530 nm. W porównaniu z wykrywaniem fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej i innymi alternatywnymi metodami5, zaletą tej metody wykorzystującej mikroskop fluorescencyjny i czytnik płytek jest to, że daje ona wyraźnie widoczne obrazy fluorescencyjne i jest łatwa do wykonania, wydajna i opłacalna. Ta metoda jest szeroko stosowana do wykrywania komórkowych ROS w celu badania różnych warunków6,7,8. Ten protokół służy do wykrywania całkowitych ROS w przylegających komórkach. Stosowanie tej metody do wykrywania ROS w komórkach zawiesinowych może wymagać pewnych modyfikacji.

<table><tbody><tr><td>Dioctan 2',7'-dichlorofluoresceiny</td><td>Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td><td>20656</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksorubicyny</td><td>TCI America, Portland, OR</td><td>D4193-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza, siedmiowodny</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny system obrazowania Invitrogen EVOS FL</td><td>Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td>lub dowolny inny mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Test białka Roztwór Bradforda</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax M2</td><td>Urządzenia molekularne, Radnor, PA</td><td>89429-532</td><td>lub dowolny inny czytnik mikropłytek fluorescencyjnych</td></tr></tbody></table>

wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Stres oksydacyjny jest ważnym wydarzeniem zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W tym badaniu pokazujemy, jak określić ilościowo stres oksydacyjny, mierząc całkowite reaktywne formy tlenu (ROS) za pomocą barwienia dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) w liniach komórkowych raka jelita grubego jako przykładu. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki, w tym przygotowanie roztworu DCFH-DA, inkubację komórek z roztworem DCFH-DA oraz pomiar znormalizowanej intensywności. Barwienie DCFH-DA to prosty i opłacalny sposób wykrywania ROS w komórkach. Może być używany do pomiaru wytwarzania ROS po obróbce chemicznej lub modyfikacjach genetycznych. Dlatego jest przydatny do określania komórkowego stresu oksydacyjnego na stres środowiskowy, dostarczając wskazówek do badań mechanistycznych.

Komórki raka jelita grubego HCT16 poddano działaniu 10 µM FS lub 10 µM DOX w celu wywołania stresu oksydacyjnego7. Jak pokazano na Rysunku 1, zgodnie z oczekiwaniami, fluorescencja zielona uległa gwałtownemu zwiększeniu pod wpływem zarówno FS, jak i DOX. Aby określić ilościowo względną zmianę intensywności, komórki po wykonaniu obrazowania poddano lizie i znormalizowano względem stężeń białek. Ilościowo określona intensywność fluorescencji była znacząco wyższa po zast...

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Metoda ta może być stosowana do analizy reaktywnych form tlenu w komórkach przylegających tylko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego oraz do ilościowego określania intensywności reaktywnych form tlenu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny. Zacznij od wysiewu dwóch razy 10 do piątych komórek raka jelita grubego HCT116 w DMEM do każdej studzienki 24-dołkowej płytki.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp pożywkę hodowlaną 100-mikromolowym siarczanem żelazawym lub 10-mikromolową pożywką zawierającą doksorubicynę i inkubuj płytkę przez kolejne 24 godziny. Przygotować roztwór DCFH-DA, rozpuszczając 4,85 miligrama DCFH-DA w jednym mililitrze DMSO, aby uzyskać 10-milimolowy roztwór podstawowy.Tuż przed dodaniem go do studzienek rozcieńczyć bulion wstępnie podgrzanym DMEM, aby uzyskać 10-mikromolowy roztwór roboczy i wirować go przez 10 sekund. Aby zabarwić komórki, usuń pożywkę zawierającą lek i umyj je raz DMEM. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu roboczego DCFH-DA do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po inkubacji wyjąć DCFH-DA ze studzienek i umyć je dwukrotnie DMEM i raz PBS. Następnie dodaj 500 mikrolitrów PBS do każdej studzienki. Użyj zielonego kanału białka fluorescencyjnego w mikroskopie fluorescencyjnym, aby wykonać reprezentatywne obrazy komórek.Następnie usunąć PBS i dodać 200 mikrolitrów buforu do testu radioimmunoprecypitacji do każdej studzienki. Inkubuj płytkę na lodzie przez pięć minut i zbierz lizaty komórkowe do 1,5 mililitrowych probówek. Odwirować probówki w temperaturze 21, 130 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przenieść 100 mikrolitrów supernatantu na czarną 96-dołkową płytkę. Użyj czytnika mikropłytek o długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisji 530 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję w każdym dołku. Następnie zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda, przenosząc jeden mikrolitr supernatantu na przezroczystą 96-dołkową płytkę ze 100 mikrolitrami roztworu do oznaczania białek.Użyj stężeń białka, aby znormalizować intensywność fluorescencji. Komórki raka jelita grubego HCT116 traktowano 100 mikromolowym siarczanem żelazawym lub 10 mikromolową doksorubicyną w celu wywołania stresu oksydacyjnego. Zgodnie z oczekiwaniami, zielona fluorescencja została dramatycznie zwiększona przez oba zabiegi.Aby określić ilościowo względne zmiany intensywności, komórki poddano lizie i znormalizowano stężeniami białek. Względna intensywność fluorescencji została istotnie zwiększona przez siarczan żelazawy lub doksorubicynę. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby roztwór DCFH-DA był świeży i unikał ekspozycji na światło, a także aby zminimalizować zaburzenia stanu komórek i wykonać intensywne płukanie PBS tuż przed wykonaniem zdjęcia.Oprócz wykrywania całkowitego ROS za pomocą tego protokołu, można wykonać w szczególności ROS, taki jak nadtlenek.

detection-total-reactive-oxygen-species-adherent-cells-2-7

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.

Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach

Ten film opisuje protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda pomaga uwidocznić lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i dalej określić ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych.

Wykrywanie ROS za pomocą barwienia DCFH-DA: pomiar całkowitego ROS w liniach komórkowych raka jelita grubego

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

Poznaj metodę wykrywania całkowitych reaktywnych form tlenu w komórkach przyległych za pomocą barwienia DCFH-DA. Protokół umożliwia wizualizację i ilościową analizę ROS przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Przeglądaj więcej filmów