Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Nasz protokół może być wykorzystany do szybkiego i łatwego przetestowania roli dowolnego genu kandydującego w kolonizacji i wzroście przerzutów. Protokół umożliwia również monitorowanie w czasie rzeczywistym przerzutów, ich powstawania i wzrostu, a także ilościowe określanie liczby i wielkości przerzutów u tych samych zwierząt bez konieczności resekcji lub barwienia histologicznego. Płytkować cztery komórki T1 po 150 000 komórek na studzience na 12-dołkowej płytce w kompletnej pożywce wzrostowej.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia odessaj pożywkę wzrostową z komórek. Dodaj 500 mikrolitrów supernatantu wirusa lucyferazy i 500 mikrolitrów supernatantu wirusa białka fluorescencyjnego, aby jednocześnie zainfekować komórki zarówno supernatantem wirusa lucyferazy, jak i białka fluorescencyjnego.

Następnie dodaj jeden mikrolitr ośmiu miligramów na mililitr bromku heksadimetryny i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 do 48 godzin. Trypsynizuj cztery komórki T1 za pomocą 500 mikrolitrów trypsyny. Po dwóch do pięciu minutach przenieś wszystkie komórki do sześciocentymetrowego naczynia w czterech mililitrach pożywki selekcyjnej, gasząc w ten sposób trypsynę.

Po zakończeniu selekcji potwierdź, że zainfekowane cztery komórki T1 wykazują ekspresję białka fluorescencyjnego ZsGreen za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w powiększeniu od 50 do 100 razy. Potwierdź również, że zainfekowane cztery komórki T1 wyrażają lucyferazy za pomocą dostępnego na rynku zestawu aktywności lucyferazy. Przystąp do przeprowadzenia optymalizacji projektu eksperymentalnego in vivo zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Odessać pożywkę i przepłukać płytki komórkowe 1X PBS. Trypsynizuj komórki pięcioma mililitrami trypsyny na 15-centymetrową płytkę przez dwie do pięciu minut i przenieś wszystkie komórki do stożkowej probówki. Umyj pozostałe komórki z naczynia do hodowli tkankowej wystarczającą ilością kompletnego podłoża wzrostowego, aby wygasić trypsynę.

Dodaj pranie do tej samej stożkowej rurki. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek. Następnie odwirować komórki w temperaturze 122 razy G przez trzy minuty i odessać supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w 1X PBS w żądanym stężeniu. Tutaj każdej myszy wstrzykuje się 25 000 komórek i 100 mikrolitrów PBS. Tak więc ponownie zawieszone ogniwa mają 250 000 komórek na mililitr.

Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia. Pracując w kapturze w obiekcie dla zwierząt, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj komórki, odwracając rurkę lub używając jednomililitrowej strzykawki, aby upewnić się, że są równomiernie ponownie zawieszone. Teraz załaduj jednomililitrową strzykawkę Luer Lock zawiesiną komórek i usuń nadmiar pęcherzyków powietrza.

Umieść półcalową igłę o rozmiarze 30 na strzykawce skosem do góry i usuń pęcherzyki powietrza. Delikatnie umieść mysz w uchwycie dla gryzoni. Boczna żyła ogonowa powinna być widoczna i rozszerzona.

Jeśli nie, delikatnie uszczypnij podstawę ogona i zanurz ogon w ciepłej wodzie z kranu, aby rozszerzyć żyły. Użyj chusteczki nasączonej alkoholem, aby oczyścić ogon, a następnie włóż igłę do żyły ogonowej, skośnie stroną do góry i wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Jeśli igła jest prawidłowo wprowadzona do żyły, powinna łatwo przesuwać się lekko do przodu i do tyłu, a przy naciskaniu tłoka nie powinno być oporu.

Udane wstrzyknięcia powinny również spowodować uderzenie gorąca, w którym niebieski kolor żyły zmienia kolor na biały na kilka sekund po wstrzyknięciu. Powoli wyjąć igłę i za pomocą jałowej gazy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełne wyzdrowienie.

Włącz urządzenie do obrazowania żywych zwierząt in vivo, otwórz oprogramowanie do obrazowania i zaloguj się. Kliknij przycisk inicjalizacji i poczekaj na zainicjowanie urządzenia. Zmień pole widzenia na D. Przy pierwszym użyciu edytuj ustawienia ekspozycji, klikając edytuj, preferencje, akwizycję i automatyczną ekspozycję.

Zmień maksymalny czas ekspozycji z domyślnych 60 sekund na 300 sekund i kliknij przycisk OK. Załaduj strzykawkę o pojemności jednego mililitra z D-lucyferyną, a następnie dodaj do strzykawki półcalową igłę o rozmiarze 30 i usuń pęcherzyki powietrza. Zmierz i zapisz masę znieczulonej myszy.

Powstrzymaj mysz, ściskając kark kciukiem i palcami wskazującymi oraz chwytając ogon między małym palcem a podstawą dłoni. Odwróć mysz pod kątem 45 stopni z głową skierowaną w dół. Włóż igłę, ukośną stroną do góry, w przestrzeń IP po lewej stronie myszy.

Potwierdź wejście do przestrzeni IP, pobierając z powrotem mały wolumin. Nie powinno być koloru u podstawy igły podczas cofania się w przestrzeni IP. Wstrzyknąć odpowiednią objętość D-lucyferyny w dawce 150 miligramów na kilogram.

Natychmiast po podaniu D-lucyferyny uruchom minutnik. Umieść mysz płasko na plecach w urządzeniu do obrazowania, tak aby jej nos znajdował się w stożku nosowym i upewnij się, że podawane jest od pół do dwóch i pół procenta izofluranu. Kliknij pola luminescencyjne i fotograficzne.

Zmień czas ekspozycji na automatyczny, a następnie kliknij przycisk Acquire (Uzyskaj) w panelu sterowania pobierania. Po obrazowaniu umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj przez 15 minut, aby zapewnić pełną regenerację. Po eutanazji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy odizolować i usunąć płuca od każdej myszy i przepłukać 1X PBS, aby usunąć nadmiar krwi.

Uzyskaj obrazy przerzutów ZsGreen w płatach przy 10x w jasnym polu i fluorescencji za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu z filtrem szerokopasmowym GFP. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo rozmiar i liczbę przerzutów na obrazach. Aby przetworzyć i przeanalizować dane z obrazów uzyskanych za pomocą urządzenia do obrazowania żywych zwierząt in vivo, otwórz wszystkie pliki obrazów dla każdej myszy w oprogramowaniu do obrazu.

Upewnij się, że jednostki są w promieniowaniu dla danych bioluminescencyjnych i wydajności dla danych fluorescencyjnych, klikając strzałkę w lewym górnym rogu okna obrazu i zmieniając ją na odpowiednią jednostkę. Użyj obrazu z ostatniego punktu czasu, aby utworzyć obszar zainteresowania lub ROI, klikając najpierw narzędzia ROI w oknie palety narzędzi. Następnie wstaw jeden ROI, klikając strzałkę i wybierając jeden.

Kliknij obramowanie obszaru roboczego i przenieś go na klatkę piersiową myszy. Dostosuj rozmiar ROI tak, aby zakrywał klatkę piersiową myszy i nie wykluczał sygnału. Następnie kliknij pozycję Zmierz zwrot z inwestycji i skopiuj lub wpisz nieprzetworzoną liczbę do arkusza Excel.

Wykreśl i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik obrazu, aby skopiować ROI, a następnie wklej go do plików graficznych z innych punktów czasowych i kliknij zmierz ROI. Wektor retrowirusowy z ekspresją tandemowych shRNA na bazie miR-30 ukierunkowanych zarówno na YAP, jak i TAZ zmniejsza ekspresję białek YAP i podatkowych oraz aktywność transkrypcyjną w czterech komórkach T1.

Cztery komórki lucyferazy T1 były stabilnie transdukowane za pomocą ekspresji ZsGreen wersji tego tandemowego wektora shRNA YAP / TAZ lub kontrolowanego shRNA opartego na miR-30. Obrazy bioluminescencyjne pokazują, że szybkość, z jaką wzrastało obciążenie przerzutami, była znacznie szybsza u myszy, którym wstrzyknięto komórki kontrolne w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ. Wykres sygnału transformowanej lucyferazy log10 mierzony dla każdej myszy w trakcie eksperymentu pokazuje również, że tempo było szybsze u myszy, którym wstrzyknięto komórki kontrolne w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ.

Znacznie mniej przerzutów powstało u myszy, którym wstrzyknięto komórki knockdown YAP / TAZ w porównaniu z myszami z komórkami kontrolnymi po ręcznym liczeniu. Ten sam trend zaobserwowano podczas korzystania z oprogramowania do analizy obrazu. Nie tylko u myszy kontrolnych powstało o wiele więcej przerzutów, ale były one na ogół większe.

Konsekwentnie, obciążenie przerzutami w płucach zostało również drastycznie zmniejszone przez knockdown YAP/TAZ. Udane wstrzyknięcie równej liczby zdrowych komórek każdej myszy ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej jakości danych. Należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i przestrzeganiu wytycznych bezpieczeństwa podczas pracy z zakaźnymi retrowirusami i lentiwirusami, zwłaszcza jeśli wirusy są zakaźne dla ludzi.

Technika ta pozwoliła nam zilustrować rolę genów kandydujących oraz kolonizacji i wzrostu przerzutów, zapewniając sposób identyfikacji i testowania nowych celów terapeutycznych w leczeniu choroby przerzutowej. Po tej procedurze przerzuty zawierające płuca mogą być dalej analizowane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub histologicznego w celu zbadania, w jaki sposób zmieniony gen wpływa na przerzuty i zidentyfikowania innych białek, które mogą być zaangażowane.