Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Protokół ten jest przydatny do scharakteryzowania funkcji składania bakteryjnych kompleksów wydzielania i może prowadzić do fundamentalnego zrozumienia mechanizmów molekularnych, które są wymagane do interakcji patogenów gospodarza. Technika ta integruje uzupełniające się podejścia, które zachowują natywną strukturę próbki i umożliwiają wizualizację kompleksów białkowych w nienaruszonych komórkach bakteryjnych. Zwiększa naszą wiedzę na temat zależności funkcji strukturalnych bakteryjnych systemów wydzielania.

Metodę tę można dostosować do badania innych typów systemów wydzielniczych lub innych kompleksów komórkowych w szerokiej gamie gatunków bakterii. Zacznij od zrobienia płatków agarozowych do obrazowania żywych komórek. Przygotuj około 30 ml 1% niskotopliwego roztworu agarozy w wodzie i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej w szklanej kolbie przez około 90 sekund, od czasu do czasu obracając, aż agaroza całkowicie się rozpuści.

Umieść dwa szkiełka podstawowe o wymiarach 22 na 22 x 0.15 mm na krawędzi szkiełka o wymiarach 25 na 75 x 1.1 mm jeden na drugim. Następnie ułóż dwie kolejne mniejsze szkiełka na drugiej krawędzi. Odpipetuj około 1 ml stopionej agarozy do środkowego szkiełka między dwoma górnymi szkiełkami i umieść kolejny duży szkiełko na stopionej agarozie, upewniając się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza.

Schłodzić szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie za pomocą skalpela lub żyletki delikatnie pociąć podkładkę na małe kwadraty. Zamocuj dwustronną ramkę samoprzylepną na szkiełku o wymiarach 25 na 75 x 1.1 mm i umieść kilka podkładek na szkiełku. Rozpuść ciężki plaster Legionella Pneumophila w 1 ml podwójnie destylowanej wody.

Następnie odwirować i odpipetować dwa do trzech mikrolitrów rozcieńczenia na podkładki. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 58 na 24 x 0,15 mm na ramce samoprzylepnej. Wybierz komórki do obrazowania przy użyciu jasnego oświetlenia pola.

Następnie w oknie przechwytywania oprogramowania mikroskopu ustaw ND na 180, a binning na dwa po dwóch. Użyj kanału 488 nanometrów, aby naświetlić próbkę na 500 do 1000 milisekund i zwaliduj specyficzność fluorescencji, obrazując nieoznakowaną Legionella Pneumophila o tych samych parametrach. Aby określić ilościowo polaryzację, dostosuj kontrast obrazu, aby bakterie były wyraźnie widoczne.

Następnie powiększ obszar zainteresowania i użyj narzędzia Region, aby umieścić prostokąt o wymiarach 0,25 na 1,3 mikrometra, zaczynając od bieguna i rozciągając się do cytoplazmy, upewniając się, że prostokąt pozostaje w granicach bakterii. Zaznacz co najmniej 200 bakterii i utwórz maski, używając przycisku regionu do maskowania w menu analizy. Kliknij na statystyki maski i wybierz obiekt w zakresie maski.

Następnie zaznacz średnią intensywność i wariancję w obszarze cechy i intensywność. Wyeksportuj dane jako plik tekstowy i użyj aplikacji arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć wyniki polaryzacji każdej bakterii jako stosunek wariancji do średniej intensywności. W przypadku zastosowań o wysokiej przepustowości należy użyć mikroskopii kontrastowej twarzy w celu uzyskania obrazów dwukanałowych.

Upewnij się, że wybierasz pola widzenia, w których bakterie są całkowicie oddzielone. Następnie dostosuj kontrast kanału twarzy obrazu do poziomu, w którym bakterie są wyraźnie widoczne. Otwórz obraz dwukanałowy i uruchom okno tworzenia maski segmentu.

Dostosuj odpowiedni próg, a następnie usuń małe obiekty, klikając przycisk definiowania obiektów i dostosowując minimalny rozmiar do 100 pikseli. W obszarze Popraw maskę wybierz opcję usuń krawędzie obiektów i oddziel maski bakterii, które sąsiadują ze sobą. Aby określić ilościowo dynamikę białek fuzyjnych, otwórz okno przechwytywania obrazu i zaznacz upływ czasu.

Wprowadź dwa w polu Liczba punktów czasowych. Zdobądź dwa udane obrazy bakterii Legionella Pneumophila wykazującej ekspresję interesującego białka fluorescencyjnego. Dostosuj kontrast obrazu, aż komórki będą wyraźnie widoczne.

Następnie użyj narzędzia regionu, aby umieścić kwadrat o wymiarach 0,25 na 0,25 mikrometra pośrodku co najmniej 400 komórek. Następnie użyj przycisku regionu do maski w menu analizy, aby utworzyć maskę interesujących kwadratów. Utwórz nową pustą maskę i użyj narzędzia Piksel, aby zaznaczyć cały obszar komórki z co najmniej 25 losowych komórek.

Utwórz kolejną maskę i użyj dużego pędzla, aby zaznaczyć obszary między komórkami. Na koniec wybierz statystyki maski i upewnij się, że obiekt jest wybrany w obszarze maski dla maski pierwszej. W obszarze Cechy i intensywność wybierz średnią intensywność.

Wyeksportuj dane i powtórz proces dla maski 2. Dla maski 3 wybierz całą maskę i wyeksportuj średnią intensywność. Aby przygotować próbkę kriotomografii elektronowej, hoduj ciężki płat Legionella Pneumophila na płytkach CYE Agrastreptomisum przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić komórki w wodzie do OD 600 wynoszącego około 0,7. Następnie dodaj pięć mikrolitrów koloidalnych cząstek złota do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek. Żar rozładować dziurawą siatkę węglową i odpipetować na niej pięć mikrolitrów mieszaniny komórek.

Odstaw na minutę. Osusz siatkę bibułą filtracyjną i zamroź ją w ciekłym etanie za pomocą grawitacyjnego aparatu nurnikowego. Po wprowadzeniu superfoldera GFP do chromosomu Legionella Pneumophila przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek w celu porównania sygnału fluorescencyjnego z sygnałem macierzystego superfolderu GFP ujemnego.

Ponadto wykorzystano mikroskopię jasnego pola do zbadania proporcji komórek o określonym sygnale fluorescencyjnym. Tylko część komórek, które wytworzyły superfolder DotB GFP, wykazywała polarną lokalizację białka fuzyjnego. Charakteryzując rozkład sygnału fluorescencyjnego DotB, stwierdzono, że intensywność nadfolderu DotB GFP na biegunach była około dwa razy wyższa niż w cytozolu.

Aby zbadać, czy lokalizacja polarna superfolderu DotB GFP była zależna od w pełni zmontowanego systemu wydzielania typu czwartego, wyniki polaryzacji superfolderu DotB GFP określono dla pojedynczych komórek w typie dzikim i w mutancie systemu wydzielania typu czwartego. Rzeczywiście, biegunowe pozycjonowanie superfolderu DotB GFP zniknęło, gdy system Dot/ICM został usunięty. Wzorce dynamiczne wskazywały, że ATPaza DotB była obecna w dynamicznej populacji cytozolowej i była rekrutowana do polarnie zlokalizowanego systemu wydzielania Dot / ICM typu czwartego w późnym etapie reakcji składania.

Wysokowydajny cryo-ET wykorzystano do wizualizacji nienaruszonego aparatu systemu wydzielania typu czwartego w szczepie Legionella Pneumophila wykazującym ekspresję nadfolderu DotB GFP. Rekonstrukcja komórki ujawniła wiele maszyn Dot/ICM osadzonych w otoczce komórki. Określono również ogólne umiejscowienie DotB i superfoldera GFP w stosunku do nienaruszonej maszyny systemu wydzielania typu czwartego.

Trójwymiarowe renderingi powierzchni wykazały, że superfolder GFP znajduje się poniżej heksameru DotB, który składa się jako dysk u podstawy cytoplazmatycznego kompleksu ATPazy. Próbując tej techniki, należy ocenić stabilność białek fuzyjnych i funkcjonalność systemu wydzielania znaczników przed przystąpieniem do akwizycji obrazu. Modelowanie i dopasowanie mogą być skutecznymi sposobami analizy wzorców dynamicznych i gęstości strukturalnych, a także oceny zmian konformacyjnych lub lokalizacji podjednostek w strukturze.

Takie podejście może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób funkcjonują różne tajne komponenty systemu typu czwartego, jak oddziałują na siebie w ramach większego kompleksu i jakie funkcje pełnią różne podzespoły.