Name: Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej do badania systemu wydzielania typu IV u Legionella pneumophila. Technika ta pozwala wizualizować kompleksy białkowe w nienaruszonych komórkach bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.C. i C.R.R. były wspierane przez NIH (R37AI041699 i R21AI130671). D.P., B.H. i J.L byli wspierani przez National Institutes of Health (R01AI087946 i R01GM107629).

UWAGA: Wszystkie procedury obejmujące hodowlę, manipulację i obrazowanie L. pneumophila powinny być przeprowadzane w laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) zgodnie z lokalnymi wytycznymi.
1. Wprowadzenie sfGFP do chromosomu L. pneumophila z wykorzystaniem wymiany allelicznej i strategii podwójnej selekcji (Rysunek 2, Rysunek 3)
<ol>
	<li>Sklonuj do wektora do zastępowania genów pSR47S11 następującą sekwencję: 1 000 bp powyżej miejsca zainteresowania, następnie sekwencję sfGFP, a następnie 1 000 bp poniżej miejsca zainteresowania (Rycina 2). Sekwencja sfGFP powinna zostać umieszczona w odpowiedniej ramce odczytu względem końca N-końcowego lub C-końcowego za pomocą łącznika zawierającego od czterech do ośmiu aminokwasów. Przetransformuj otrzymany wektor do E. coli DH5αλpir. Następnie wyizoluj L. pneumophila (biorcę) metodą smugową w celu uzyskania pojedynczych kolonii na agarze z ekstraktem drożdżowym i węglem aktywnym (CYE)12 zawierającym 100 µg/mL streptomycyny i inkubuj przez 5 dni w temperaturze 37 °C (Rycina 3).</li>
	<li>Wyizoluj L. pneumophila metodą smugową na agarze CYE z streptomycyną i inkubuj przez 2 dni w temperaturze 37 °C (gęsty pas)10. Wyizoluj metodą smugową E. coli DH5α przetransformowane pomocniczym plazmidem pRK600 (pomocnik)13 na agarze LB zawierającym 25 µg/mL chloramphenikolu. Wyizoluj metodą smugową E. coli DH5αλpir (donor) na agarze LB zawierającym 50 µg/mL kanamycyny.</li>
	<li>Przeprowadź kojenie trójskładnikowe: inkubuj kolonię pomocnika, kolonię donora i biorcę poprzez nałożenie pasm trzech szczepów na płytkę z agarem CYE bez selekcji i inkubowanie przez 4–8 h w temperaturze 37 °C. Jako kontrole negatywne inkubuj mieszaninę szczepów pomocnik+biorca oraz donor+biorca przez ten sam czas.</li>
	<li>Resuspenduj mieszaniny po kojeniu w 500 µL ddH2O. Wysiej 20 µL i 50 µL z tych mieszanin na agar CYE zawierający 100 µg/mL streptomycyny i 10 µg/mL kanamycyny i inkubuj przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Wyizoluj metodą smugową cztery z otrzymanych klonów na agarze CYE zawierającym 100 µg/mL streptomycyny i inkubuj przez 5 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyizoluj metodą smugową 16 klonów na agarze CYE zawierającym 5% sacharozy i 100 µg/mL streptomycyny i inkubuj przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Następnie wyizoluj metodą smugową 32 z tych klonów na agarze CYE zawierającym 100 µg/mL streptomycyny oraz na agarze CYE zawierającym 100 µg/mL streptomycyny i 10 µg/mL kanamycyny i inkubuj przez 5 dni w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja klonów, w których sfGFP zostało zintegrowane z chromosomem L. pneumophila
<ol>
	<li>Wykulturuj metodą kreskowania klony wrażliwe na kanamycynę na płytkach z agarem CYE z streptomycyną i potwierdź insercję sfGFP do chromosomu za pomocą PCR kolonii. Użyj starterów komplementarnych do genu sfGFP oraz do interesującego regionu chromosomowego, aby przeprowadzić amplifikację miejsca złączenia insercji.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 0,5 µL każdego z roztworów starterów o stężeniu 10 µM oraz jedną kolonię do uzyskania końcowej objętości 12,5 µL i denaturuj przez 10 min w 95 °C. Chłodź na lodzie przez 10 min, dodaj 12,5 µL roztworu 2x PCR master mix i przeprowadź analizę PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykulturuj gęste plamy wyizolowanych kolonii na płytkach z agarem CYE z streptomycyną przez 2 dni w 37 °C. Zbadaj poziomy ekspresji i stabilność fuzji sfGFP za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciała anty-GFP.</li>
</ol>
3. Obrazowanie żywych komórek L. pneumophila z użyciem komponentów Dot/Icm znakowanych fluorescencyjnie
<ol>
	<li>Przygotowanie podkładek agarozowych
	<ol>
		<li>Przygotować około 30 mL 1% roztworu agarozy niskotopliwej w wodzie. Podgrzewać w kolbie szklanej w kuchence mikrofalowej przez około 90 s, okresowo mieszając, aż agaroza całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>Umieścić dwa szkiełka przedmiotowe o wymiarach 22 x 22 x 0,15 mm3 na krawędzi szkiełka przedmiotowego o wymiarach 25 x 75 x 1,1 mm3, jedno na drugim. Na drugiej krawędzi ułożyć stos z dwóch kolejnych szkiełek 22 x 22 x 0,15 mm3.</li>
		<li>Nanieść pipetą około 1 mL roztopionej agarozy na środkowe szkiełko pomiędzy dwa górne szkiełka, a następnie na roztopioną agarozę położyć kolejne szkiełko 25 x 75 x 1,1 mm3. Należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Chłodzić szkiełka w temperaturze 4 °C przez 15 min.</li>
		<li>Za pomocą skalpela lub żyletki ostrożnie pociąć podkładkę na małe kwadraty o wymiarach ~5 x 5 mm2. Przymocować dwustronną ramkę samoprzylepną o wymiarach 17 x 28 x 0,25 mm3 do szkiełka przedmiotowego 25 x 75 x 1,1 mm3 i umieścić na szkiełku kilka podkładek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów 
	UWAGA: Poniższe kroki opisano dla mikroskopu sterowanego programem SlideBook 6.0, wyposażonego w oświetlacze półprzewodnikowe, monochromatyczną kamerę CCD oraz obiektyw 100x (apertura numeryczna 1,4). W razie potrzeby należy użyć alternatywnych urządzeń mikroskopowych z odpowiednią konfiguracją sprzętową i programową, którą można dostosować do ustawień protokołu.
	<ol>
		<li>Rozpuścić gęstą plamkę L. pneumophila w 1 mL ddH2O, wymieszać w wirówce typu vortex i nanieść pipetą 2–3 µL rozcieńczenia na podkładki. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 x 24 x 0,15 mm3 na ramkę samoprzylepną.</li>
		<li>W oknie przechwytywania ustawić filtr ND na 180. Ustawić binning na 2×2 i użyć kanału 488 nm, aby naświetlać próbkę przez 500–1 000 ms. Potwierdzić swoistość sygnału fluorescencji, obrazując nieoznaczone L. pneumophila przy tych samych parametrach (Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja polarności lokalizacji i dynamiki komponentów Dot/Icm
UWAGA: Poniższe kroki zostały opracowane dla obrazów o rozdzielczości 0,129 µm na piksel, które zostały pozyskane przy biningu 2 x 2.
<ol>
	<li>Kwantyfikacja polarności dla białek fuzyjnych sfGFP (Rysunek 5)
	<ol>
		<li>Dostosuj kontrast obrazu tak, aby bakterie były wyraźnie widoczne. Użyj narzędzia obszaru, aby umieścić prostokąt o wymiarach 0,25 x 1,3 µm2, zaczynając od bieguna i rozciągając go w głąb cytoplazmy. Prostokąt musi znajdować się precyzyjnie w obrębie granic bakterii.</li>
		<li>Zaznacz co najmniej 200 bakterii i użyj przycisku Region to Mask, aby utworzyć maski dla obszarów zainteresowania. W sekcji Mask Statistics i Mask Scope wybierz Object. Następnie w sekcji Features i Intensity zaznacz Mean Intensity oraz Variance.</li>
		<li>Wyeksportuj dane i oblicz wskaźniki polarności dla każdej bakterii jako stosunek wariancji do średniej intensywności.</li>
		<li>W zastosowaniach wysokoprzepustowych użyj obiektywu fazowego i odpowiedniego ustawienia kondensora, aby uzyskać obrazy w kanałach fazowym i 488 nm. Upewnij się, że wybierasz pola widzenia, w których bakterie są całkowicie odseparowane.</li>
		<li>Dostosuj kontrast kanału fazowego obrazu do poziomu, w którym bakterie są wyraźnie widoczne. Otwórz obraz dwukanałowy, uruchom okno Create Segment Mask i zmień kanał na fazowy.</li>
		<li>Ustaw odpowiedni próg i usuń małe obiekty za pomocą przycisku Define Objects. W sekcji Refine Mask wybierz Remove Edges Objects, a następnie rozdziel maski bakterii, które znajdują się obok siebie.</li>
		<li>Oblicz wskaźniki polarności sygnału w kanale 488 dla każdej komórki, zgodnie z opisem w krokach 4.1.2–4.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja dynamiki dla białek fuzyjnych sfGFP (Rysunek 6) 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji 3, aby przygotować próbkę do akwizycji obrazu. Dynamikę definiuje się jako zmiany intensywności w czasie, a poniższe kroki są przeznaczone dla krótkich okresów obrazowania (tj. kilku minut). Dodaj do podłożki odpowiednie suplementy, jeśli pożądane są dłuższe okresy obrazowania.
	<ol>
		<li>W oknie Image Capture zaznacz Timelapse, wprowadź czas interwałów w polu interwałów oraz wpisz 2 w polu # of Time Points. Wykonaj dwa następujące po sobie obrazy L. pneumophila wykazujących ekspresję interesującego białka fluorescencyjnego.</li>
		<li>Dostosuj kontrast obrazu, aż komórki staną się wyraźnie widoczne. Postępuj zgodnie z Rysunkiem 6A i poniższymi opisami, aby umieścić trzy różne maski. Użyj narzędzia obszaru, aby umieścić kwadrat o wymiarach 0,25 x 0,25 µm w centrum co najmniej 400 komórek.</li>
		<li>Użyj przycisku Region to Mask, aby utworzyć maskę (maska 1) dla wybranych kwadratów. Utwórz nową pustą maskę (maska 2) i użyj narzędzia piksela lub poligonu, aby zaznaczyć cały obszar komórki dla co najmniej 25 losowych komórek, które posłużą do obliczenia blaknięcia fluorescencji. Utwórz nową pustą maskę (maska 3) i użyj dużego pędzla, aby zaznaczyć obszary między komórkami, które posłużą do odjęcia tła.</li>
		<li>W sekcji Mask Statistics i Mask Scope wybierz Object dla maski 1 i maski 2. Następnie w sekcji Features i Intensity wybierz Mean Intensity i wyeksportuj dane z obu masek. Dla maski 3 wyeksportuj średnią intensywność całej maski.</li>
		<li>Oblicz zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obiektu w masce 1, korzystając z następujących wzorów:</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Równanie współczynnika wybielania, równowaga statyczna, analiza matematyczna, formuła do badań naukowych." src="/files/ftp_upload/60693/60693eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
<img alt="Równanie dynamiki intensywności przedstawiające zmianę intensywności w czasie z uwzględnieniem czynników maskowania i blaknięcia." src="/files/ftp_upload/60693/60693eq2b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
gdzie maska 1 to kwadrat o wymiarach 0.25 µm × 0.25 µm umieszczony w centrum komórki, maska 2 obejmuje całą komórkę, maska 3 stanowi tło między komórkami, t1 to średnia intensywność w pierwszym punkcie czasowym, a t2 to średnia intensywność w drugim punkcie czasowym.
5. Wyznaczanie gęstości masy sfGFP za pomocą krio-ET
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek, zbieranie danych i rekonstrukcja
	<ol>
		<li>Wyhodować gęstą kolonię L. pneumophila wykazującej ekspresję białka Dot/Icm z tagiem fluorescencyjnym na płytkach z agarem CYE z dodatkiem streptomycyny przez 48 h w temperaturze 37 °C. Resuspenderować komórki w ddH2O do OD600 ~0,7. Dodać 5 µL koloidalnych cząstek złota (BSA Tracer, 10 nm) do 20 µL zawiesiny komórkowej.</li>
		<li>Nanieść pipetą 5 μL mieszaniny komórkowej na świeżo poddaną wyładowaniom żarowym siatkę z dziurawego węgla (R 2/1 na Cu 200 mesh) i pozostawić na 1 min. Osuszyć papierem filtrującym i zamrozić w ciekłym etanie przy użyciu grawitacyjnego urządzenia do mrożenia (plunger) zgodnie z wcześniejszym opisem14,15.</li>
		<li>Wykonać obrazowanie zamrożonych próbek w stanie uwodnionym za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego 300 kV wyposażonego w działo emisji polowej, filtr energetyczny, płytkę fazową Volta oraz detektor bezpośredni. Zebrać serie nachyleń w jednej osi przy powiększeniach 26 000x i 42 000x, co skutkuje rozmiarem piksela na poziomie preparatu wynoszącym odpowiednio 5,4 Å/pixel lub 3,4 Å/pixel.</li>
		<li>Użyć pakietu tomograficznego SerialEM do zbierania stosów obrazów przy defokusie ~0 μm, w zakresie kątów nachylenia od -60° do +60° z przyrostem kroku 3° i skumulowaną dawką ~60 e-/Å2,16. Wykonać wyrównanie obrazów filmowych z frakcjonowaniem dawki w każdym stosie za pomocą MotionCor217. Złożyć stosy z korekcją dryftu za pomocą TOMOAUTO14.</li>
		<li>Wyrównać stosy z korekcją dryftu za pomocą wyrównywania zależnego od markerów w programie IMOD18. Zrekonstruować tomogramy metodą SIRT19 do celów segmentacji i bezpośredniej analizy obrazów oraz metodą WBP20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza subtomogramów próbek fuzji sfGFP
	<ol>
		<li>Do analizy subtomogramów użyć pakietu tomograficznego I3 (0.9.9.3)14,21,22. 
		UWAGA: Wyrównywanie przebiega iteracyjnie; każda iteracja składa się z trzech części, w których generowane są referencje i maski klasyfikacji, subtomogramy są wyrównywane i klasyfikowane, a średnie klas są wyrównywane względem siebie.</li>
		<li>Do wstępnego wyrównania użyć subtomogramów z binowaniem 4 x 4 x 4. Połączyć cząstki należące do średnich klas, które wykazują gęstość elektronową odpowiadającą sfGFP. Po posortowaniu cząstek z fuzjami sfGFP, użyć subtomogramów z binowaniem 2 x 2 x 2 do ukierunkowanego wyrównania regionu zainteresowania (np. cytoplazmatycznego kompleksu ATPase Dot/Icm) w celu uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li>
<li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508(2009).</li>
<li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila%3A+strength+in+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li>
<li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole%3A+making+a+cosy+niche+inside+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li>
<li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li>
<li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires%27+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li>
<li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136(2011).</li>
<li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Type+IVB+secretion+system%3A+an+enigmatic+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li>
<li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li>
<li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene%3A+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li>
<li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charcoal-yeast+extract+agar%3A+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li>
<li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li>
<li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Tomoauto%3A+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608(2016).</li>
<li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weighted+Back-projection+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Tomography%22%5BJournal%5D)">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li>
<li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li>
<li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li>
<li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li>
<li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function%3A+insights+from+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li>
<li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterselectable+markers%3A+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li>
<li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyjaśnienie funkcji bakteryjnych systemów wydzielania jest kluczem do pełnego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen. Systemy wydzielania to złożone maszyny, które mogą wstrzykiwać białka efektorowe do komórek gospodarza, a w niektórych przypadkach sprzyjać tworzeniu się niszy subkomórkowej, która wspiera replikację bakterii. Powyższa metoda dostarcza ważnych nowych narzędzi do badania systemu wydzielania Dot/Icm patogenu bakteryjnego Legionella pneumophila, dostarczając wskazówek dotyczących mechanizmów trans...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), czynnik etiologiczny choroby legionistów, zamieszkuje zbiorniki słodkowodne, gdzie bakterie rozmnażają się, infekując i replikując się w wodnych swobodnie pływających pierwotniakach. L. pneumophila powoduje ogniska choroby u ludzi, gdy dochodzi do wdychania bakterii w aerozolu ze źródeł wody pitnej. W zakażonych komórkach subwersja szlaków gospodarza pozwala L. pneumophila opóźnić endocytarne dojrzewanie wakuoli, w której się znajduje, i promować biogenezę przedziału komórkowego, który wspiera replikację bakterii. Proces ten jest napędzany przez wyspecjalizowany bakteryjny system wydzielania IVB typu (T4BSS) znany jako Dot/Icm i jego repertuar ponad 300 białek "efektorowych", które są translokowane do cytozolu gospodarza podczas infekcji, aby ułatwić manipulację funkcjami komórkowymi1,2,3,4,5. Mutanty pozbawione funkcjonalnego aparatu Dot/Icm nie dostarczają efektorów do cytozolu gospodarza, są wadliwe w replikacji wewnątrzkomórkowej i są awirulentne w zwierzęcych modelach choroby6,7.
Wiele gatunków bakterii rozwinęło niezwykle skomplikowane i dynamiczne wieloskładnikowe maszyny, które są niezbędne do procesów infekcji. Inne T4BSS, takie jak system Dot/ICM, są również niezbędne do wewnątrzkomórkowej replikacji patogenów bakteryjnych, takich jak Coxiella burnetii i Rickettsiella grylli. Chociaż T4BSS są ewolucyjnie spokrewnione z prototypowymi systemami typu IVA, które pośredniczą w transferze DNA i mogą dostarczać ograniczony repertuar białek efektorowych, system Dot/Icm ma prawie dwa razy więcej komponentów maszynowych i dostarcza szeroką gamę efektorów. Przypuszczalnie to zwiększenie liczby komponentów umożliwiło aparatowi Dot/Icm łatwe dostosowanie i integrację nowych efektorów8,9.
Ostatnio użyliśmy tomografii krioelektronowej (cryo-ET) do rozwiązania struktury aparatu Dot/Icm in situ i pokazaliśmy, że tworzy on kanał obejmujący otoczkę komórki, który łączy się z kompleksem cytoplazmatycznym. Dalsza analiza wykazała, że cytozolowa ATPaza DotB wiąże się z układem Dot/Icm na biegunie komórkowym L. pneumophila poprzez interakcje z cytozolową ATPazą DotO. Odkryliśmy, że DotB wykazuje ruch cytozolowy w większości komórek bakteryjnych, co wskazuje, że ta ATPaza jest obecna w dynamicznej populacji cytozolowej, ale wiąże się również z polarnymi kompleksami Dot / ICM. Ponadto DotO tworzy heksameryczny zespół dimerów DotO związanych z kompleksem błony wewnętrznej, a heksamer DotB łączy się z podstawą tego kompleksu cytoplazmatycznego. Złożenie kompleksu energetycznego DotB-DotO tworzy kanał cytoplazmatyczny, który kieruje translokacją substratów przez T4SS (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1) < klasa sup = "xref">10.
Pomimo tych ostatnich osiągnięć, niewiele wiadomo o tym, jak funkcjonuje system Dot/Icm i jak każde białko łączy się, tworząc aktywne urządzenie8. Odkrycie obwodów regulacyjnych Dot/Icm T4SS ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych interakcji gospodarz-patogen. Dlatego omawiamy, jak używać mikroskopii żywych komórek i cryo-ET do wykrywania i charakteryzowania istotnych elementów systemu L. pneumophila Dot/ICM, które są oznaczone superfolderem GFP (sfGFP). Za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej polarna lokalizacja DotB zostanie zdefiniowana na tle typu dzikiego lub po usunięciu układu typu IV. Mikroskopia poklatkowa zostanie wykorzystana do ilościowego określenia różnic w lokalizacji i dynamice między cytozolowymi ATPazami Dot/ICM.
Połączone zastosowanie dwóch uzupełniających się podejść, takich jak obrazowanie na żywo i cryo-ET, daje przewagę w porównaniu z innymi systemami in vitro. Obie metody są wykonywane w nienaruszonych komórkach i zachowują naturalne środowisko T4BSS, minimalizując w ten sposób zakłócenie natywnej struktury podczas przygotowywania próbki. Ponieważ nadekspresja białek może upośledzać stechiometrię aparatu wydzielniczego, fuzje sfGFP są zwracane poprzez wymianę alleli do chromosomu Legionella, tak że każda fuzja jest kodowana w pojedynczej kopii, a ekspresja jest napędzana przez endogenny promotor. Wizualizacja fuzji kodowanych chromosomalnie umożliwia ilościowe określenie dokładnego poziomu ekspresji białka w określonym punkcie czasowym. Cryo-ET ma również wiele zalet w określaniu struktury systemów sekrecjonalnych. Najbardziej zauważalną zaletą jest to, że próbki cryo-ET składają się z zamrożonych nienaruszonych komórek, które zachowują natywne kompleksy w kontekście architektury komórek bakteryjnych. W związku z tym cryo-ET może być lepszy niż biochemiczne metody oczyszczania, które ekstrahują kompleksy błonowe i mogą usuwać białka obwodowe z aparatu rdzeniowego lub modyfikować ogólną strukturę. Ponadto znakowanie interesującego białka za pomocą dużego białka, takiego jak sfGFP, dodaje masę, która jest wykrywalna przez cryo-ET i może pomóc w mapowaniu różnych podkompleksów aparatu Dot / Icm na strukturę uzyskaną przez cryo-ET.
To podejście jest potężnym narzędziem do odkrywania informacji strukturalnych o wielocząsteczkowych kompleksach, które gromadzą się w błonie komórkowej bakterii. Interpretacja struktur wyjaśnionych za pomocą tych technik pomoże w zrozumieniu, w jaki sposób działają komponenty T4BSS, dlaczego tak wiele komponentów jest wymaganych do działania, w jaki sposób komponenty oddziałują na siebie w obrębie większego kompleksu i jakie funkcje pełnią te podzespoły.

<table><tbody><tr><td>Cząstki złota koloidalnego 10 nm</td><td>Aurion</td><td>25486</td><td></td></tr><tr><td>100x Obiektyw Plan Apo (1.4 NA)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel aktywny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroze GPG/LMP, niskotopliwy</td> amerykański <td>AB00981</td><td></td><td>bioanalityczny</td></tr><tr><td>Odwodniony agar Bacto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP EZ 20 MHz cyfrowa kamera monochromatyczna</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene, Ramka genowa, 1,7x2,8 cm, 125 &mikro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0578</td><td></td></tr><tr><td>Holey Siatka węglowa R 2/1 Cu 200 mesh</td><td>Quantifoil</td><td>Q225-CR1</td><td></td></tr><tr><td>Azotan żelaza(III) bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216828</td><td></td></tr><tr><td>K2 Kamera szczytowa do cryo-EM</td><td>GATAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe mikroskopu 22x22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe do mikroskopów 24x50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545K</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe 25x75x1 mm</td><td>Globe Scientific</td><td>1380</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0</td><td>Inteligentne innowacje</td><td></td><td></td>w obrazowaniu</tr><tr><td>Silnik świetlny Spectra X</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0270</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm legionella pneumophila

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

System wydzielania Dot/Icm Legionella pneumophila to złożona nanomaszyna systemu wydzielania typu IV (T4SS), która lokalizuje się na biegunie bakteryjnym i pośredniczy w dostarczaniu białek i substratów DNA do komórek docelowych, co zazwyczaj wymaga bezpośredniego kontaktu między komórkami. Niedawno rozwiązaliśmy strukturę aparatu Dot/Icm za pomocą tomografii krioelektronowej (cryo-ET) i wykazaliśmy, że tworzy on kanał obejmujący otoczkę komórkową, który łączy się z kompleksem cytoplazmatycznym. Zastosowanie dwóch uzupełniających się podejść, które zachowują natywną strukturę próbki, mikroskopii fluorescencyjnej w żywych komórkach i cryo-ET, umożliwia wizualizację białek in situ oraz asymilację stechiometrii i czasu produkcji każdego komponentu maszyny w stosunku do innych podjednostek Dot/Icm. Aby zbadać wymagania dotyczące pozycjonowania biegunowego i scharakteryzować dynamiczne cechy związane z biogenezą maszyny T4SS, połączyliśmy gen kodujący superfolder białka zielonej fluorescencji z genami ATPazy Dot / Icm w ich natywnych pozycjach na chromosomie. Poniższa metoda integruje ilościową mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek i krio-ET w celu ilościowego określenia polarnej lokalizacji, dynamiki i struktury tych białek w nienaruszonych komórkach bakteryjnych. Zastosowanie tych podejść do badania Legionella pneumophila T4SS jest przydatne do scharakteryzowania funkcji systemu Dot / Icm i może być dostosowane do badania szerokiej gamy patogenów bakteryjnych, które wykorzystują T4SS lub inne typy kompleksów wydzielania bakteryjnego.

Do konstrukcji zdefiniowanej insercji sfGFP wykorzystano rekombinację homologiczną z podwójną selekcją w dwóch etapach. W pierwszym kroku przeprowadzono kojenie trójszczepowe, w którym koniugacyjny plazmid pRK600 (plazmid IncP) ze szczepu pomocniczego E. coli MT616 został zmobilizowany do szczepu donora E. coli zawierającego wektor samobójczy pSR47S z genem sfGFP flankowanym przez dwa regiony homologiczne, centrum transferu oriT oraz gen kontraselekcyjny sacB pochodzący z Bacillus subtilis<...

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Protokół ten jest przydatny do scharakteryzowania funkcji składania bakteryjnych kompleksów wydzielania i może prowadzić do fundamentalnego zrozumienia mechanizmów molekularnych, które są wymagane do interakcji patogenów gospodarza. Technika ta integruje uzupełniające się podejścia, które zachowują natywną strukturę próbki i umożliwiają wizualizację kompleksów białkowych w nienaruszonych komórkach bakteryjnych. Zwiększa naszą wiedzę na temat zależności funkcji strukturalnych bakteryjnych systemów wydzielania.Metodę tę można dostosować do badania innych typów systemów wydzielniczych lub innych kompleksów komórkowych w szerokiej gamie gatunków bakterii. Zacznij od zrobienia płatków agarozowych do obrazowania żywych komórek. Przygotuj około 30 ml 1% niskotopliwego roztworu agarozy w wodzie i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej w szklanej kolbie przez około 90 sekund, od czasu do czasu obracając, aż agaroza całkowicie się rozpuści.Umieść dwa szkiełka podstawowe o wymiarach 22 na 22 x 0.15 mm na krawędzi szkiełka o wymiarach 25 na 75 x 1.1 mm jeden na drugim. Następnie ułóż dwie kolejne mniejsze szkiełka na drugiej krawędzi. Odpipetuj około 1 ml stopionej agarozy do środkowego szkiełka między dwoma górnymi szkiełkami i umieść kolejny duży szkiełko na stopionej agarozie, upewniając się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza.Schłodzić szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie za pomocą skalpela lub żyletki delikatnie pociąć podkładkę na małe kwadraty. Zamocuj dwustronną ramkę samoprzylepną na szkiełku o wymiarach 25 na 75 x 1.1 mm i umieść kilka podkładek na szkiełku. Rozpuść ciężki plaster Legionella Pneumophila w 1 ml podwójnie destylowanej wody.Następnie odwirować i odpipetować dwa do trzech mikrolitrów rozcieńczenia na podkładki. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 58 na 24 x 0,15 mm na ramce samoprzylepnej. Wybierz komórki do obrazowania przy użyciu jasnego oświetlenia pola.Następnie w oknie przechwytywania oprogramowania mikroskopu ustaw ND na 180, a binning na dwa po dwóch. Użyj kanału 488 nanometrów, aby naświetlić próbkę na 500 do 1000 milisekund i zwaliduj specyficzność fluorescencji, obrazując nieoznakowaną Legionella Pneumophila o tych samych parametrach. Aby określić ilościowo polaryzację, dostosuj kontrast obrazu, aby bakterie były wyraźnie widoczne.Następnie powiększ obszar zainteresowania i użyj narzędzia Region, aby umieścić prostokąt o wymiarach 0,25 na 1,3 mikrometra, zaczynając od bieguna i rozciągając się do cytoplazmy, upewniając się, że prostokąt pozostaje w granicach bakterii. Zaznacz co najmniej 200 bakterii i utwórz maski, używając przycisku regionu do maskowania w menu analizy. Kliknij na statystyki maski i wybierz obiekt w zakresie maski.Następnie zaznacz średnią intensywność i wariancję w obszarze cechy i intensywność. Wyeksportuj dane jako plik tekstowy i użyj aplikacji arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć wyniki polaryzacji każdej bakterii jako stosunek wariancji do średniej intensywności. W przypadku zastosowań o wysokiej przepustowości należy użyć mikroskopii kontrastowej twarzy w celu uzyskania obrazów dwukanałowych.Upewnij się, że wybierasz pola widzenia, w których bakterie są całkowicie oddzielone. Następnie dostosuj kontrast kanału twarzy obrazu do poziomu, w którym bakterie są wyraźnie widoczne. Otwórz obraz dwukanałowy i uruchom okno tworzenia maski segmentu.Dostosuj odpowiedni próg, a następnie usuń małe obiekty, klikając przycisk definiowania obiektów i dostosowując minimalny rozmiar do 100 pikseli. W obszarze Popraw maskę wybierz opcję usuń krawędzie obiektów i oddziel maski bakterii, które sąsiadują ze sobą. Aby określić ilościowo dynamikę białek fuzyjnych, otwórz okno przechwytywania obrazu i zaznacz upływ czasu.Wprowadź dwa w polu Liczba punktów czasowych. Zdobądź dwa udane obrazy bakterii Legionella Pneumophila wykazującej ekspresję interesującego białka fluorescencyjnego. Dostosuj kontrast obrazu, aż komórki będą wyraźnie widoczne.Następnie użyj narzędzia regionu, aby umieścić kwadrat o wymiarach 0,25 na 0,25 mikrometra pośrodku co najmniej 400 komórek. Następnie użyj przycisku regionu do maski w menu analizy, aby utworzyć maskę interesujących kwadratów. Utwórz nową pustą maskę i użyj narzędzia Piksel, aby zaznaczyć cały obszar komórki z co najmniej 25 losowych komórek.Utwórz kolejną maskę i użyj dużego pędzla, aby zaznaczyć obszary między komórkami. Na koniec wybierz statystyki maski i upewnij się, że obiekt jest wybrany w obszarze maski dla maski pierwszej. W obszarze Cechy i intensywność wybierz średnią intensywność.Wyeksportuj dane i powtórz proces dla maski 2. Dla maski 3 wybierz całą maskę i wyeksportuj średnią intensywność. Aby przygotować próbkę kriotomografii elektronowej, hoduj ciężki płat Legionella Pneumophila na płytkach CYE Agrastreptomisum przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ponownie zawiesić komórki w wodzie do OD 600 wynoszącego około 0,7. Następnie dodaj pięć mikrolitrów koloidalnych cząstek złota do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek. Żar rozładować dziurawą siatkę węglową i odpipetować na niej pięć mikrolitrów mieszaniny komórek.Odstaw na minutę. Osusz siatkę bibułą filtracyjną i zamroź ją w ciekłym etanie za pomocą grawitacyjnego aparatu nurnikowego. Po wprowadzeniu superfoldera GFP do chromosomu Legionella Pneumophila przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną żywych komórek w celu porównania sygnału fluorescencyjnego z sygnałem macierzystego superfolderu GFP ujemnego.Ponadto wykorzystano mikroskopię jasnego pola do zbadania proporcji komórek o określonym sygnale fluorescencyjnym. Tylko część komórek, które wytworzyły superfolder DotB GFP, wykazywała polarną lokalizację białka fuzyjnego. Charakteryzując rozkład sygnału fluorescencyjnego DotB, stwierdzono, że intensywność nadfolderu DotB GFP na biegunach była około dwa razy wyższa niż w cytozolu.Aby zbadać, czy lokalizacja polarna superfolderu DotB GFP była zależna od w pełni zmontowanego systemu wydzielania typu czwartego, wyniki polaryzacji superfolderu DotB GFP określono dla pojedynczych komórek w typie dzikim i w mutancie systemu wydzielania typu czwartego. Rzeczywiście, biegunowe pozycjonowanie superfolderu DotB GFP zniknęło, gdy system Dot/ICM został usunięty. Wzorce dynamiczne wskazywały, że ATPaza DotB była obecna w dynamicznej populacji cytozolowej i była rekrutowana do polarnie zlokalizowanego systemu wydzielania Dot / ICM typu czwartego w późnym etapie reakcji składania.Wysokowydajny cryo-ET wykorzystano do wizualizacji nienaruszonego aparatu systemu wydzielania typu czwartego w szczepie Legionella Pneumophila wykazującym ekspresję nadfolderu DotB GFP. Rekonstrukcja komórki ujawniła wiele maszyn Dot/ICM osadzonych w otoczce komórki. Określono również ogólne umiejscowienie DotB i superfoldera GFP w stosunku do nienaruszonej maszyny systemu wydzielania typu czwartego.Trójwymiarowe renderingi powierzchni wykazały, że superfolder GFP znajduje się poniżej heksameru DotB, który składa się jako dysk u podstawy cytoplazmatycznego kompleksu ATPazy. Próbując tej techniki, należy ocenić stabilność białek fuzyjnych i funkcjonalność systemu wydzielania znaczników przed przystąpieniem do akwizycji obrazu. Modelowanie i dopasowanie mogą być skutecznymi sposobami analizy wzorców dynamicznych i gęstości strukturalnych, a także oceny zmian konformacyjnych lub lokalizacji podjednostek w strukturze.Takie podejście może pomóc w zrozumieniu, w jaki sposób funkcjonują różne tajne komponenty systemu typu czwartego, jak oddziałują na siebie w ramach większego kompleksu i jakie funkcje pełnią różne podzespoły.

applying-live-cell-imaging-cryo-electron-tomography-to-resolve

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Źródło: Chetrit, D., et al. Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)Film ten demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do ilościowego określenia polarności i dynamiki składników systemu wydzielania u Legionella pneumophila, umożliwiając analizę rekrutacji przestrzennej i redystrybucji cytozolowej krytycznej dla zrozumienia...

Kwantyfikacja polarności i dynamiki składnika układu wydzielania u Legionella pneumophila

Źródło: Chetrit, D., et al. Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020)Film opisuje, jak przygotować próbki Legionella pneumophila do kriotomografii elektronowej poprzez połączenie hodowli bakterii, znakowania nanocząstek złota i technik witryfikacji. Proces ten zachowuje natywne struktury komórkowe i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości...

Przygotowanie bakterii Legionella pneumophila do kriogenicznej tomografii elektronowej

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej do badania systemu wydzielania typu IV u Legionella pneumophila. Technika ta pozwala wizualizować kompleksy białkowe w nienaruszonych komórkach bakteryjnych.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Przeglądaj więcej filmów