Name: Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę przesiewową do szybkiej identyfikacji supresorów wyciszania RNA w patogenach roślinnych. Technika ta wykorzystuje Nicotiana benthamiana i umożliwia dokładne badanie interakcji patogen-roślina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z "Programu Shuguang" Fundacji Rozwoju Edukacji w Szanghaju i Miejskiej Komisji Edukacji w Szanghaju, Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (2018YFD0201500), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31571696 i 31660510), Programu Tysiąca Talentów dla Młodych Profesjonalistów z Chin, oraz Komisja Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (18DZ2260500).

UWAGA: Wszystkie etapy procedury powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Umieść wszystkie podłoża zawierające chorobotwórcze mikroby, jak również rośliny i tkanki roślinne użyte w teście, do odpowiednich pojemników na odpady i autoklawu przed wyrzuceniem.
1. Przygotowanie konstruktów plazmidowych zawierających domniemane efektory
<ol>
	<li>Wybierz przypuszczalnie wydzielane efektory, które ulegają silnej ekspresji podczas infekcji, jak określono za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-Seq), a następnie za pomocą ilościowej techniki Real Time PCR (qRT-PCR).</li>
	<li>Określ miejsce rozszczepienia peptydu sygnałowego każdego efektora za pomocą narzędzia programowego, takiego jak SignalP18.</li>
	<li>Zaprojektuj startery i wykonaj PCR w celu amplifikacji genu kodującego interesujący efektor przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby sprawdzić produkt PCR, a następnie sklonuj amplikon do wektora wejściowego bramki pQBV3 za pomocą zestawu do klonowania bez ligacji (tabela materiałów), a następnie do docelowego wektora ekspresji pEG100 przy użyciu reakcji rekombinacji LR19.</li>
	<li>Przekształć 3−5 μl mieszaniny reakcyjnej LR w 100 μl kompetentnych komórek E. coli (np. TOP10, DH5α), rozprowadzić przekształcone komórki bakteryjne na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16−20 h. 
	UWAGA: Transformanty dodatnie można zidentyfikować za pomocą PCR20 i dalej analizować za pomocą miniprepu plazmidu i sekwencjonowania.</li>
	<li>Wprowadzić 50−100 ng rekombinowanych plazmidów przenoszących białko efektorowe do 100 μl chemicznie kompetentnych komórek A. tumefaciens (np. GV3101 lub C58C1), delikatnie wymieszać, a następnie zamrozić w ciekłym azocie na 1 min. Rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Dodać 500 μl bulionu LB i inkubować w temperaturze 30 °C przez 4-6 godzin z delikatnym wstrząsaniem, a następnie przenieść i rozprowadzić wszystkie komórki agrobakterii na podłożu agarowym LB uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 30 °C przez 2 dni. 
	UWAGA: Dodatnie klony można zweryfikować za pomocą PCR kolonii.</li>
	<li>Użyj pojedynczej przekształconej kolonii do eksperymentów agroinfiltracji, chyba że zalecono inaczej. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu żaden z badanych genów efektorowych nie zawierał przewidywanych intronów; każdy z genów został bezpośrednio amplifikowany z genomowego DNA izolatu Phytophthora sojae. Wektor wyrażenia roślinnego Gateway bez żadnego znacznika jest zalecany, ale nie jest to konieczne.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roślin N. benthamiana 16c
<ol>
	<li>Przygotować mieszanki gleby doniczkowej składające się (objętościowo) z 50% mchu torfowego, 30% perlitu i 20% wermikulitu i pozostawić w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Namocz autoklawizowane mieszanki glebowe w roztworze nawozu roślinnego (1 g/l) i zapakuj je do mniejszych doniczek (80 mm x 80 mm x 75 mm) przechowywanych na większej tacy (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Wysiewaj jedno lub dwa nasiona N. benthamiana 16c na powierzchnię gleby w każdej doniczce. Przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować.</li>
	<li>Umieść tacę w jasnych komorach wzrostowych o kontrolowanej temperaturze i temperaturze 23−25 °C, wilgotności względnej 50−60% i fotoperiodze długiego dnia (14 h światła/10 h ciemności, z oświetleniem przy 130−150 μE·m-2 s-1).</li>
	<li>Zdejmij plastikową kopułę po wykiełkowaniu nasion (3-4 dni) i pozwól sadzonkom rosnąć w tych samych warunkach, które są używane na etapie kiełkowania.</li>
	<li>Dodawaj odpowiednią ilość wody, utrzymując glebę wilgotną, ale nie moczącą, co 2-3 dni; dodawaj nawóz co 10 dni, aby przyspieszyć dalszy wzrost. Utrzymuj rośliny N. benthamiana 16c w normalnych warunkach, dopóki nie będą gotowe do użycia; Na tym etapie roślina powinna mieć co najmniej pięć w pełni rozwiniętych prawdziwych liści i nie mieć widocznych pąków pachowych ani kwiatowych, a liście powinny mieć zdrowy zielony wygląd).</li>
	<li>Do testów wyciszania ustrojowego RNA należy użyć 3-4 tygodniowych liści N. benthamiana 16c do miejscowych testów wyciszania RNA, a młodych roślin N. benthamiana 16c (10−14 dni) do ogólnoustrojowych testów wyciszania RNA. 
	UWAGA: Warunki wzrostu roślin i obiekty różnią się w zależności od laboratorium; Wybierz zdrowe, dobrze rozwinięte i w pełni rozwinięte liście do infiltracji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultury Agrobacterium do infiltracji
<ol>
	<li>Wybrać dodatnią kolonię z płytki LB i zaszczepić komórki w szklanej probówce zawierającej 5 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny. Hodować komórki w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez 24−48 godzin.</li>
	<li>Przenieść 100 μl kultury do 5 ml pożywki LB uzupełnionej tymi samymi antybiotykami, 10 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES; pH 5,6) i 20 μM acetosyringonu (AS). Hodować bakterie w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 16−20 godzin.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 4 000 x g przez 10 min. Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml 10 mM buforu MgCl2</li>.
	<li>Powtórz krok 3.3, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyków.</li>
	<li>Określić gęstość kultury Agrobacterium, mierząc gęstość optyczną przy 600 nm (OD600). Dostosuj do OD600 1,5−2,0 z buforem 10 mM MgCl2.</li>
	<li>Dodać 10 mM MES (pH 5,6) i 150 μM AS do końcowych kultur zawiesinowych i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny bez wstrząsania. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj końcowych kultur zawiesiny na noc.</li>
</ol>
4. Współinfiltracja pozostawia N. benthamiana
<ol>
	<li>Zmieszać równe objętości kultury Agrobacterium zawierającej 35S-GFP z kulturą Agrobacterium zawierającą 35S- supresor wirusa mozaiki ogórka 2b (CMV2b), przypuszczalny efektor lub pusty wektor (EV).</li>
	<li>Ostrożnie i powoli infiltrować zmieszane zawiesiny agrobacterium na bokach abaksjalnych liści N. benthamiana 16c za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej.</li>
	<li>Usunąć pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści za pomocą wycieraczek do tkanek miękkich i okrążyć brzegi naciekanych plam pisakiem.</li>
	<li>Pozostaw naciekane rośliny w komorze wzrostowej w tych samych warunkach wzrostu. 
	UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa i zdrowia podczas infiltracji należy nosić okulary ochronne i maskę. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, rękawice powinny być wymieniane lub sterylizowane etanolem między infiltracjami. Zwykle do infiltracji potrzeba co najmniej 1 ml zawiesiny agrobacterium na liść. Do wyciszenia ogólnoustrojowego do infiltracji potrzebne będą co najmniej dwa liście.</li>
</ol>
5. Analiza obrazowa GFP
<ol>
	<li>Wizualnie wykryj fluorescencję GFP w nowo wyrosłych liściach całych roślin 2 tygodnie po infiltracji (w celu wyciszenia ogólnoustrojowego RNA) lub naciekanych plamach liści 3−4 dpi za pomocą długofalowej lampy ultrafioletowej (UV) bez zbierania liści.</li>
	<li>Sfotografuj zebrane rośliny i/lub oderwane liście za pomocą aparatu cyfrowego wyposażonego zarówno w filtry UV, jak i żółte. 
	UWAGA: W celu przeprowadzenia testów miejscowego tłumienia wyciszania należy zbadać infiltrowane plamy liści N. benthamiana 16c, natomiast w przypadku ogólnoustrojowej aktywności tłumiącej należy zbadać nowo wyrosłe liście. Aktywność supresji wyciszania RNA może się różnić w zależności od indywidualnych efektorów. Dlatego obserwuj plamy lub liście przez kilka dni, zaczynając od 3 dpi. Użyj CMV2b i EV jako odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej.</li>
</ol>
6. Analiza Northern blot poziomów mRNA GFP w infiltrowanych liściach
<ol>
	<li>Izolacja całkowitego RNA z tkanki liścia przy użyciu odczynnika do izolacji RNA (tabela materiałów)
	<ol>
		<li>Zebrać tkanki liści z naciekanych plastrów N. benthamiana 16c w temperaturze 4−7 dpi, sproszkować w ciekłym azocie na drobny proszek i przenieść proszek do sterylnej probówki o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Natychmiast dodać odczynnik do izolacji RNA (1 ml/100 mg tkanki) do probówki z próbką w kapturze, energicznie wstrząsnąć do homogenizacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać chloroform (200 μl/1 ml odczynnika izolującego RNA) do każdej probówki w kapturze, wstrząsać energicznie przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwirować homogenat przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wolnej od RNaz i wyrzucić osad. Dodać 0,7 objętości izopropanolu do supernatantu, delikatnie odwrócić kilka razy i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Wytrącić osad RNA przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant, umyj osad 70% etanolem i wysusz pellet na powietrzu w kapturze. Rozpuść RNA w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 10-20 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Northern blot poziomu mRNA GFP w naciekanych liściach
	<ol>
		<li>Przygotuj 1,2% żel agarozowy denaturujący formaldehyd w 1x buforze do biegania MOPS.</li>
		<li>Zmieszać RNA 1:1 z barwnikiem ładującym RNA i dokonać denaturacji przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 10 minut, natychmiast schłodzić zdenaturowane próbki na lodzie przez 1 minutę.</li>
		<li>Załadować próbki do żelu i elektroforezy pod napięciem 100 V przez 50 minut, aż RNA zostanie dobrze oddzielone.</li>
		<li>Wypłucz żel w 20x buforze soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC) w celu usunięcia formaldehydu i przenieś żel na membranę nylonową przez transfer kapilarny w 20x buforze SSC przez noc. Namocz membranę w 2x SSC i przymocuj RNA do membrany, wystawiając mokrą membranę na sieciowanie UV.</li>
		<li>Dodać odpowiednią ilość buforu do hybrydyzacji (10 ml na 100cm2 membrany; Tabela materiałów) w probówce do hybrydyzacji i mieszać w temperaturze 60 °C w piecu do hybrydyzacji.</li>
		<li>Umieścić membranę w probówce hybrydyzacyjnej i inkubować przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Rozcieńczyć sondę DNA znakowaną 5'DIG (stężenie końcowe, 50 ng / ml) w roztworze hybrydyzacyjnym zawierającym wstępnie podgrzany bufor hybrydyzacyjny.</li>
		<li>Wyrzuć bufor do hybrydyzacji i natychmiast zastąp go wstępnie podgrzanym roztworem hybrydyzacyjnym zawierającym sondę znakowaną DIG. Inkubować blot za pomocą sondy w temperaturze 60 °C przez noc, delikatnie mieszając.</li>
		<li>Po hybrydyzacji przemyć membranę dwukrotnie w o rosnącym stopniu rygorystyczności w temperaturze 60 °C przez 20 minut każdy. Delikatnie przetrzyj membranę, aby usunąć dodatkowy bufor płuczący i dodaj odczynniki zgodnie z sugestią w zestawie do hybrydyzacji i wykrywania chemiluminescencyjnego (tabela materiałów).</li>
		<li>Wykrywanie sygnałów hybrydyzowanych w reakcji chemiluminescencyjnej w połączeniu z systemem obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Waterfield, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Virulence+Annotation+%28RVA%29%3A+identification+of+virulence+factors+using+a+bacterial+genome+library+and+multiple+invertebrate+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).</li>
<li>Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+pathogen+effector+functions%3A+of+pathogens%2C+hosts+and+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).</li>
<li>Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+the+stage%3A+effectors+in+the+spotlight%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Taking the stage: effectors in the spotlight.</a> Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).</li>
<li>Lee, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Pseudomonas+syringae+Type+III+Secreted+Effector+Function+via+a+Yeast+Genomic+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).</li>
<li>Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-Pathogen+Effectors%3A+Cellular+Probes+Interfering+with+Plant+Defenses+in+Spatial+and+Temporal+Manners%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).</li>
<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).</li>
<li>Pumplin, N., Voinnet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+suppression+by+plant+pathogens%3A+defence%2C+counter-defence+and+counter-counter-defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).</li>
<li>Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+silencing+suppressors%3A+Tools+forged+to+fine-tune+host-pathogen+coexistence%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence.</a> Virology. 479-480, 85-103 (2015).</li>
<li>Johansen, L. K., Carrington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+on+the+spot.+Induction+and+suppression+of+RNA+silencing+in+the+Agrobacterium-mediated+transient+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system.</a> Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).</li>
<li>Powers, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+the+identification+of+RNA+silencing+suppressors+based+on+complementation+of+viral+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103 (1), 157-167 (2000).</li>
<li>Deleris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+action+and+inhibition+of+plant+Dicer-like+proteins+in+antiviral+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense.</a> Science. 313 (5783), 68-71 (2006).</li>
<li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li>
<li>Navarro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+miRNA+contributes+to+antibacterial+resistance+by+repressing+auxin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.</a> Science. 312 (5772), 436-439 (2006).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oomycete+pathogens+encode+RNA+silencing+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors.</a> Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).</li>
<li>Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fungal+effector+from+Puccinia+graminis+suppressing+RNA+silencing+and+plant+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses.</a> New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WY+domain+in+the+Phytophthora+effector+PSR1+is+required+for+infection+and+RNA+silencing+suppression+activity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity.</a> New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).</li>
<li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SignalP+4.0%3A+discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).</li>
<li>Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodman%2C+ME+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).</li>
<li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+RNA+silencing+suppressor+from+a+plant+double-stranded+RNA+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus.</a> Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).</li>
<li>Burgyan, J., Havelda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Viral suppressors of RNA silencing.</a> Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).</li>
<li>Incarbone, M., Dunoyer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+and+its+suppression%3A+novel+insights+from+in+planta+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses.</a> Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).</li>
<li>Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+suppressor+activity+of+the+Tobacco+rattle+virus-encoded+16-kDa+protein+and+interference+with+endogenous+small+RNA-guided+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways.</a> Virology. 376 (2), 346-356 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyciszanie RNA jest kluczowym mechanizmem obronnym wykorzystywanym przez rośliny do zwalczania patogenów wirusowych, bakteryjnych, lęgniowców i grzybów. Z kolei te drobnoustroje wyewoluowały białka supresorowe wyciszające, aby przeciwdziałać wyciszaniu przeciwwirusowemu, a te RSS zakłócają różne etapy szlaku wyciszania RNA 22,23. Opracowano kilka testów przesiewowych w celu identyfikacji RSS10.
W tym miejscu opi...

W ciągu ostatnich dwóch dekad przyspieszenie sekwencjonowania genomu mikroorganizmów wywołujących choroby roślin doprowadziło do coraz większej luki w wiedzy między informacjami o sekwencji a biologicznymi funkcjami kodowanych białek1. Wśród cząsteczek ujawnionych w ramach projektów sekwencjonowania znajdują się cząsteczki efektorowe, które tłumią wrodzoną odporność i ułatwiają kolonizację gospodarza; Czynniki te są wydzielane przez destrukcyjne patogeny roślin, w tym bakterie, nicienie i drobnoustroje nitkowate. Aby zareagować na te zagrożenia, rośliny żywicielskie wyewoluowały nowe receptory, które rozpoznają te efektory, umożliwiając przywrócenie odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym efektory podlegają różnym naciskom selekcyjnym, co prowadzi do zróżnicowania repertuaru efektorów wśród linii patogenów2. W ostatnich latach wykazano, że domniemane efektory patogenów roślinnych zaburzają wrodzoną odporność roślin poprzez hamowanie procesów komórkowych gospodarza, co przynosi korzyści drobnoustrojom na różne sposoby, w tym rozregulowanie szlaków sygnałowych, transkrypcję, transport wewnątrzkomórkowy, stabilność cytoszkieletu, transport pęcherzyków i wyciszanie RNA3,4,5. Jednak zdecydowana większość efektorów patogenów, zwłaszcza tych pochodzących z patogenów nitkowatych, pozostała enigmatyczna.
Wyciszanie RNA to maszyneria inaktywacji genów za pośrednictwem homologii, która jest zachowana wśród eukariontów. Proces ten jest wywoływany przez długi dwuniciowy RNA (dsRNA) i celuje w homologiczny jednoniciowy RNA (ssRNA) w sposób specyficzny dla sekwencji i manipuluje szerokim zakresem procesów biologicznych, w tym obroną przeciwwirusową6. Aby przezwyciężyć wrodzone odpowiedzi immunologiczne gospodarza, niektóre wirusy ewoluowały, aby zrównoważyć wyciszanie RNA, w tym zdolność do replikacji wewnątrz przedziałów wewnątrzkomórkowych lub ucieczki przed zreorganizowanym sygnałem wyciszającym. Niemniej jednak najbardziej ogólną strategią, za pomocą której wirusy chronią swoje genomy przed zależną od wyciszenia RNA utratą funkcji genu, jest kodowanie specyficznych białek, które hamują wyciszanie RNA7,8. Ustalono kilka mechanistycznie różnych podejść do badań przesiewowych i charakterystyki wirusowych supresorów wyciszania RNA (VSR), w tym jednoczesną infiltrację kultur Agrobacterium tumefaciens, rośliny transgeniczne wykazujące ekspresję przypuszczalnych supresorów, szczepienie i hodowlę komórkową9,10,11,12,13.
Każdy z tych testów ma zalety i wady, a także identyfikuje VSR na swój własny, odrębny sposób. Jedno z najczęstszych podejść opiera się na jednoczesnej infiltracji poszczególnych kultur A. tmuefaciens zawierających potencjalne białko wirusa i gen reporterowy (zwykle białko zielonej fluorescencji [GFP]) na roślinach Nicotiana benthamiana 16c konstytutywnie wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S. W przypadku braku aktywnego supresora wyciszającego wirusa, GFP jest identyfikowany przez komórki gospodarza jako egzogenny i jest wyciszany w ciągu 3 dni po infiltracji (dpi). W przeciwieństwie do tego, jeśli białko wirusowe ma aktywność supresyjną, poziom ekspresji GFP pozostaje stały powyżej 3−9 dpi9. Ten test współinfiltracji jest prosty i szybki; Nie jest jednak ani bardzo stabilny, ani wrażliwy. Niemniej jednak test zidentyfikował liczne VSR z różnymi sekwencjami i strukturami białkowymi w wielu wirusach RNA7,8.
Ostatnio scharakteryzowano kilka białek efektorowych, które mogą hamować aktywność wyciszania komórkowego RNA, z bakteryjnych, lęgniowców i grzybowych patogenów roślin14,15,16. Odkrycia te sugerują, że supresja wyciszania RNA jest powszechną strategią ułatwiającą infekcję, która jest wykorzystywana przez patogeny w większości królestw. Teoretycznie wiele, jeśli nie wszystkie, efektory mogą kodować supresory wyciszające RNA (RSS); Do tej pory zidentyfikowano jednak tylko kilka z nich, głównie ze względu na brak wiarygodnej i ogólnej strategii badań przesiewowych. Co więcej, supresory wyciszania RNA nie zostały zbadane w zdecydowanej większości patogenów roślin17.
W tym raporcie przedstawiamy zoptymalizowany i ogólny protokół identyfikacji efektorów patogenów roślinnych, które mogą tłumić miejscowe i ogólnoustrojowe wyciszanie RNA za pomocą testu agroinfiltracji. Głównym celem tego badania było podkreślenie kluczowych aspektów protokołu i szczegółowe opisanie kroków, zapewniając w ten sposób test przesiewowy, który jest odpowiedni dla prawie wszystkich efektorów patogenów roślinnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-morfolinoetanosulfonowy (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)Amresco</td><td></td> <td>0264C507-1KG</td><td>Bufor MOPS</td></tr><tr><td>Acetosyringon (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Indukcja agaru</td></tr> <tr><td></td><td>AgrobacteriumSigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB</td></tr><tr><td>medium Ekstrakcja</td> <td>drożdży BactoBD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB średni</td></tr><tr><td>aparat</td><td>fotograficzny Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografia</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System obrazowania</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduł detekcji chemiluminescencyjnej składnik zestawów Dafa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Detekcja luminescencji</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress II</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Podwiązanie</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Bufor hybrydyzacyjny</td></tr><tr><td>Easypure Plasmid Miniprep Zestaw</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Ekstrakcja plazmidu</td></tr><tr><td>EasyPure Zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Ekstrakcja żelem</td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA dwuwodna</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>Elektroforeza buforowa Zasilacz</td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Elektroforeza kwasów nukleinowych.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Żel do trawienia wektorowego</td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Obraz</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>LR Enzym Klonaza II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>reakcja</td></tr> <tr><td>LRNitroceluloza Błona bibułkowa 0,45um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south zestaw do losowego znakowania biotyny prime DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Znakowanie biotyny</td></tr><tr><td>PCR Termocyklery</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mech torfowy</td><td>PINDSTRUP</td><td>Ciemne złoto + glina</td><td>Rośliny</td></tr><tr><td>Peters Nawóz rozpuszczalny w wodzie</td><td>ICE</td><td>Peter Profesjonalny nawóz 20-20-20</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity Polimeraza DNA</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Żel RNA Barwnik ładujący (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>Barwnik ładujący żel RNA</td></tr><tr><td>Hydrat octanu sodu</td><td>Amresco/VWR</td><td>0530-1KG</td><td>Bufor</td></tr> <tr>MOPS<td>Chlorek sodu</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB średni</td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC Bufor</td></tr><tr><td>Trizol Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Odczynnik do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>Obserwacja</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Oven</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Północny</td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających rna z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Wyciszanie RNA jest ewolucyjnie zachowanym, specyficznym dla sekwencji mechanizmem regulacji genów u eukariontów. Kilka patogenów roślinnych wyewoluowało białka zdolne do hamowania szlaku wyciszania RNA rośliny żywicielskiej. W przeciwieństwie do białek efektorowych wirusa, tylko kilka wydzielanych białek efektorowych wykazało zdolność do tłumienia wyciszania RNA w patogenach bakteryjnych, lęgniowców i grzybów, a funkcje molekularne większości efektorów pozostają w dużej mierze nieznane. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nieco zmodyfikowaną wersję testu współinfiltracji, która może służyć jako ogólna metoda obserwacji wyciszania RNA i charakteryzowania białek efektorowych wydzielanych przez patogeny roślinne. Kluczowymi etapami tego podejścia są wybór zdrowych i w pełni rozwiniętych liści, dostosowanie kultury bakterii do odpowiedniej gęstości optycznej (OD) przy 600 nm oraz obserwacja fluorescencji białka zielonej fluorescencji (GFP) w optymalnym czasie na naciekanych liściach, aby uniknąć pominięcia efektorów o słabej aktywności supresyjnej. Ten ulepszony protokół przyczyni się do szybkich, dokładnych i rozległych badań przesiewowych supresorów wyciszających RNA i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do badania funkcji molekularnych tych białek.

Powyżej opisano procedurę krok po kroku ulepszonego testu przesiewowego służącego do oceny aktywności RSS efektorów RxLR P. sojae. Cały eksperyment trwa od 5 do 6 tygodni. Następnie RSS zidentyfikowane w tym teście mogą zostać dalej scharakteryzowane pod kątem funkcji i mechanizmu molekularnego. Jako przykład naszego podejścia wykorzystaliśmy efektor RxLR P. sojae Phytophthora suppressor of RNA silencing 1 (PSR1), który jest wydzielany i dostarczany do komórek gospodarza...

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, jak przesiewać supresory wyciszające RNA wydzielane przez patogeny roślinne. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie szybkiego, dokładnego i obszernego testu przesiewowego do identyfikacji supresorów wyciszających RNA. Przygotuj mieszanki gleby doniczkowej składające się z 50% mchu torfowego, 30% perlitu i 20% wermikulitu i autoklaw w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 20 minut.Namocz autoklawizowane mieszanki glebowe roztworem nawozu roślinnego w ilości jednego grama na litr i zapakuj je do mniejszych doniczek przechowywanych na większej tacy. Zasiej jedno lub dwa nasiona Nicotiana bethamiana 16c na powierzchnię gleby każdej doniczki. Przykryj tacę plastikową kopułą i pozwól nasionom wykiełkować.Umieść tacę pod jasnymi komorami wzrostowymi o kontrolowanej temperaturze o temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza, wilgotności względnej od 50 do 60% i długim dniu fotoperiodu. Po trzech do czterech dniach nasiona kiełkują. Zdejmij plastikową kopułę i pozwól sadzonkom rosnąć w tych samych warunkach, które są używane na etapie kiełkowania.Co dwa do trzech dni dodawaj odpowiednią ilość wody, utrzymując glebę wilgotną, ale nie moczącą. Co 10 dni dodawaj nawóz, aby pobudzić dalszy wzrost. Utrzymuj rośliny Nicotiana bethamiana 16c w normalnych warunkach, aż rośliny będą miały co najmniej pięć w pełni rozwiniętych prawdziwych liści bez widocznych pąków pachowych lub kwiatowych, a liście będą miały zdrowy zielony wygląd.Użyj 10 do 14-dniowych roślin Nicotiana bethamiana 16c do ogólnoustrojowych testów wyciszania RNA i trzy- do czterotygodniowych liści Nicotiana bethamiana 16c do lokalnych testów wyciszania RNA. Użyj końcówki, aby wybrać dodatnią kolonię z płytki LB i zaszczepić komórki w szklanej probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i 50 mikrogramami na mililitr ryfampicyny. Hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 24 do 48 godzin.Przenieś 100 mikrolitrów kultury do pięciu mililitrów pożywki LB uzupełnionej tymi samymi antybiotykami, 10 milimolowymi MES przy pH 5,6 i 20 mikromolowymi AS. Hoduj bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 16 do 20 godzin. Odwirować komórki w temperaturze 4 000 g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach 10-milimolowego buforu chlorku magnezu.Powtórz pranie, aby zapewnić całkowite usunięcie antybiotyków. Określ gęstość kultury Agrobacterium, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach. Dostosuj hodowlę komórkową z 10-milimolowym buforem chlorku magnezu do OD 600 wynoszącego od 1,5 do 2,0.Dodać 10 milimolowy MES o pH 5,6 i 150 mikromolowy AS do końcowej hodowli zawiesinowej i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez co najmniej trzy godziny bez wstrząsania. Zmieszać równe objętości kultury Agrobacterium zawierającej 35S zielone białko fluorescencyjne z kulturą Agrobacterium zawierającą supresor wirusa mozaiki ogórka 35S 2b, przypuszczalny efektor lub pusty wektor. Za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej ostrożnie i powoli infiltruj zmieszane zawiesiny Agrobacterium na abaksjalnych stronach liści Nicotiana bethamiana 16c.Usuń pozostałą zawiesinę bakteryjną z liści za pomocą chusteczek do tkanek miękkich i zakreśl brzegi naciekanych plam markerem. Trzy do czterech dni po infiltracji użyj długofalowej lampy ultrafioletowej, aby wizualnie wykryć fluorescencję GFP w infiltrowanych plamach liści. Dwa tygodnie po infiltracji użyj lampy, aby wykryć nowo wyrosłe liście całej rośliny w celu wyciszenia ogólnoustrojowego RNA.Aby wyizolować całkowite RNA z tkanki liścia w ciągu czterech do siedmiu dni po infiltracji, należy zebrać tkanki liścia z naciekanych plastrów Nicotiana bethamiana 16c do moździerza. Umieść ciekły azot w moździerzu i zmiel tkankę na drobny proszek za pomocą pręta szlifierskiego i przenieś proszek do sterylnej dwumililitrowej probówki. Natychmiast dodać odczynnik do izolacji RNA o objętości jednego mililitra na 100 miligramów tkanki do probówki z próbką w kapturze, energicznie wirować w celu homogenacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Dodać chloroform w objętości 200 mikrolitrów na jeden mililitr odczynnika izolacyjnego RNA do każdej probówki w kapturze, energicznie wstrząsać przez 15 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odwirować homogenat w temperaturze 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki wolnej od RNaz i wyrzucić osad.Dodać 0,7 objętości izopropanolu do supernatantu, delikatnie odwrócić kilka razy i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wytrącić osad RNA przez odwirowanie w temperaturze 12 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant.Umyj pellet 70% etanolem i wysusz pellet na powietrzu w kapturze. Rozpuść RNA w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu, inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut. Aby przeprowadzić analizę Northern blot poziomów informacyjnego RNA GFP, przygotuj 1,2% żel agarozowy denaturujący formaldehyd w buforze 1X MOPS.Wymieszaj RNA jeden do jednego z barwnikiem ładującym RNA i denaturuj RNA przez inkubację w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Zdenaturowane próbki należy natychmiast schłodzić na lodzie przez jedną minutę. Za pomocą pipety załaduj próbki do dołków żelu i elektroforezy o napięciu 100 woltów przez 50 minut, aż RNA zostanie dobrze oddzielone.Wypłucz żel w 20-krotnym buforze cytrynianu sodu soli fizjologicznej, aby usunąć formaldehyd. Wykonaj transfer kapilarny przez noc, ustawiając 20-krotny bufor cytrynianu sodu z solą fizjologiczną, jedną warstwę ręcznika papierowego, dwie warstwy mokrego papieru Whatman, jedną warstwę żelu, jedną warstwę membrany nylonowej, dwie warstwy mokrego papieru Whatman, dwie warstwy suchego papieru Whatman, jedną szklaną płytkę i obciążnik. Rano RNA w żelu jest przenoszone do membrany nylonowej.Namocz błonę w 2X soli fizjologicznej cytrynianu sodu i przymocuj RNA do membrany, wystawiając mokrą membranę na sieciowanie UV. Postępuj zgodnie z rękopisem. W pełni rozwinięte liście trzy- lub czterotygodniowych roślin Nicotiana bethamiana 16c były naciekane w płatach z mieszaninami Agrobacterium przenoszącymi 35S GFP.Po czterech dniach od infiltracji fluorescencję GFP infiltrowanego obszaru zobrazowano w świetle naturalnym i długofalowym świetle UV. Northern blot ujawnił, że informacyjny RNA GFP gromadził się wyżej w liściach wyrażających 35S GFP plus 35S CMV2b lub 35S GFP plus 35S PSR1 niż w liściach wyrażających 35S GFP plus EV. Test agroinfiltracji przeprowadzono w celu oceny rozprzestrzeniania się sygnału wyciszającego w liściach dwutygodniowych siewek Nicotiana bethamiana 16c. Po 14 dniach od infiltracji ponad 98% EV nie wykazywało wyraźnej sygnalizacji GFP w liściach ogólnoustrojowych.Natomiast zarówno CMV2b, jak i PSR1 skutecznie hamowały ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie się sygnału wyciszającego. Fluorescencję GFP zaobserwowano w około 80% roślin współinfiltrowanych, a w pozostałych 20% roślin naciekanych, w których na nowo wyrosłych liściach pojawiło się tylko kilka czerwonych żyłek. Technika ta toruje naukowcom drogę do zidentyfikowania nowych supresorów wyciszających RNA wydzielanych przez wiele patogenów roślinnych.Połączenie roślin i odpowiedniego OD jest najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić funkcjonalną charakterystykę supresora wyciszającego RNA, aby zbadać mechanizm, w jaki sposób te supresory naciskają na wyciszenie RNA gospodarza i jakie jest wyjście. Podczas infiltracji roślin należy nosić okulary ochronne, a także nosić rękawice lateksowe podczas wszystkich etapów eksperymentu.

screening-identification-rna-silencing-suppressors-from-secreted

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Źródło: Shi, J. i inni. Przesiewowe badania i identyfikacja supresorów tłumiących RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje test współinfiltracji w celu identyfikacji białek efektorowych patogenów, które hamują wyciszanie RNA w Nicotiana benthamiana 16c. Fluorescencjonujący raport oraz gen efektorowy kandydatów są dostarczane do liści rośliny za pomocą Agrobacterium. Zazwyczaj wyciszanie RNA degraduje transkrypcje reporterów, zmniejszając...

Badanie współinfiltracyjne w celu wykrywania efektorów patogenów tłumiących wyciszanie RNA roślin

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Rurociąg bioinformatyczny, a mianowicie miRDeep-P2 (w skrócie miRDP2), z aktualnymi kryteriami miRNA roślin i przebudowanym algorytmem, mógłby dokładnie i efektywnie analizować transkryptomy mikroRNA u roślin, szczególnie dla gatunków o złożonych i dużych genomach.

Rurociąg bioinformatyczny do dokładnej i wydajnej analizy transkryptomów mikroRNA w roślinach

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Poznaj zmodyfikowaną metodę przesiewową do szybkiej identyfikacji supresorów wyciszania RNA w patogenach roślinnych. Technika ta wykorzystuje Nicotiana benthamiana i umożliwia dokładne badanie interakcji patogen-roślina.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Przeglądaj więcej filmów