Name: Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj analizę topologii łańcuchów ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji PRM. Ta metoda spektrometrii masowej umożliwia precyzyjną identyfikację i ilościowe określenie zmian w obfitości łańcuchów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Céline Jeanty za pomoc w tworzeniu granulek komórkowych z leczeniem MG-132, jak opisano w reprezentatywnych wynikach, oraz Elise Mommaerts za dostarczenie granulek E. coli używanych w protokole.

1. Przygotowanie wzorca ciężkiego peptydu
<ol>
	<li>W zależności od dostawcy i jakości zakupionych ciężkich peptydów, ciężkie peptydy będą musiały zostać rozcieńczone. W protokole tym wykorzystano sekwencje peptydowe opisane w Tabeli 1, z C-końcowym aminokwasem zmodyfikowanym do lizyny (13C615N 2-lizyny) lub argininy (13C615N4-argininy).
	<ol>
		<li>Wymieszaj ciężkie peptydy, rozcieńczając mieszaninę 50% acetonitrylem (ACN), aby utworzyć mieszaninę peptydów z każdym peptydem o stężeniu 10 μM.</li>
		<li>Utworzyć podwielokrotności mieszaniny peptydów i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Liza próbki 
	UWAGA: Podczas przygotowywania próbki należy wziąć pod uwagę stabilność łańcuchów ubikwityny. Próbki biologiczne i należy przechowywać w stanie schłodzonym w temperaturze 4 °C i jak najszybciej dodać próbki do buforu stabilizującego ubikwitynę.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 1 M NH4HCO3 (wodorowęglan amonu) w wodzie i dostosować pH do 8 za pomocą 1 M NaOH.</li>
		<li>Przygotować roztwór 200 mM N-etylomaleimidu (NEM) w wodzie.</li>
		<li>Przygotować bufor stabilizujący ubikwitynę przy użyciu 8 M mocznika w 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. Bufor stabilizujący ubikwitynę musi być za każdym razem przygotowywany na świeżo. 
		UWAGA: 5 ml roztworu 8 M mocznika będzie wymagało znacznie mniej niż 5 ml wody, biorąc pod uwagę rozszerzanie się wody w nasyconym roztworze mocznikiem. 
		UWAGA: Nie należy przygotowywać buforu w temperaturze powyżej 50 °C ze względu na skłonność mocznika do tworzenia polimocznika w wysokich temperaturach.</li>
		<li>Zawiesić próbkę biologiczną do badania w buforze stabilizacyjnym ubikwityny w celu uzyskania 0,5 μg/μl białka i poddać komórki lizie za pomocą metody odpowiedniej dla próbki. Metoda sonikacji składająca się z trzech 10-sekundowych impulsów z sonifikatorem SFX 150 Branson ustawionym na 70% intensywność z 10-sekundowymi przerwami na lodzie między każdym impulsem, została zastosowana dla linii komórkowych w tym protokole.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
		<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej z mikrowęzłem o niskiej wiązalności białek. W tym momencie w razie potrzeby próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki i kontrole
	<ol>
		<li>Jeżeli próbki są zamrożone, wymieszać (np. za pomocą termomiksera) podczas ich rozmrażania, aby szybko rozpuścić mocznik. 
		UWAGA: Nie używaj temperatur powyżej 50 °C ze względu na tendencję mocznika do tworzenia polimocznika w wysokich temperaturach.</li>
		<li>Odwirować próbkę o masie 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
		<li>Przenieść 20 μg próbki do świeżej probówki wirówkowej z mikrowirówką o niskim poziomie wiązania i dostosować objętość do 50 μl za pomocą buforu stabilizującego ubikwitynę.</li>
		<li>Stworzyć kontrolę ujemną za pomocą znormalizowanej objętości buforu stabilizującego ubikwitynę (50 μl). W tej próbce nie powinna być obecna żadna lekka wersja każdego peptydu, co pozwala na obserwację jakiegokolwiek zanieczyszczenia światłem wynikającego z ciężkich peptydów z kolcami. Ta kontrola ujemna została również wykorzystana do zaplanowania czasu retencji osoby o ograniczonej możliwości poruszania się, opisanego w sekcji 3.1.</li>
		<li>Stworzono również kontrolę pozytywną z buforem stabilizującym ubikwitynę i dodaniem dostępnych na rynku typów łańcuchów do znormalizowanej objętości buforu stabilizującego ubikwitynę (50 μL). Zwykle dostępne są K63, K48 i M1. W reprezentatywnych wynikach wykorzystano 20 ng K48, K63 i M1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Redukcja, alkilacja i trawienie
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 50 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) w wodzie i dostosować próbkę do pH = 8 z 1 M NaOH.</li>
		<li>Kulturę E. coli wyhodowaną w bulionie LB odwirowano 5 000 x g przez 5 minut w celu utworzenia osadu, który następnie przemyto 2x PBS przed ponownym zawieszeniem w buforze stabilizującym ubikwitynę w stężeniu 5 μg / μL.</li>
		<li>Dodać 1 μg lizatu E. coli do każdej próbki i kontroli. W protokole tym wykorzystuje się E. coli (DH10B), ale można użyć dowolnego złożonego lizatu bez ubikwityny. Należy pamiętać, że ubikwityna jest wspólna dla wszystkich eukariontów. 
		UWAGA: Stosowanie matrycy lizatu E. coli zmniejsza utratę peptydów z powodu niespecyficznej przyczepności do wyrobów z tworzyw sztucznych. Jest to szczególnie widoczne w kontroli ujemnej lub próbkach o ograniczonej zawartości białka i ma silny wpływ na obserwację K6312.</li>
		<li>Przygotować roztwór 500 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) w wodzie klasy MS (alternatywnie można użyć DTT).</li>
		<li>Zredukować próbki i kontrole przez dodanie TCEP do końcowego stężenia 50 mM. Wirować krótko przed inkubacją przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku korzystania z naziemnej telewizji cyfrowej temperaturę należy podnieść do 50 °C. 
		UWAGA: Nie używaj temperatur powyżej 50 °C ze względu na tendencję mocznika do tworzenia polimocznika w wysokich temperaturach.</li>
		<li>Przygotować roztwór 550 mM chloroacetamidu (CAA) w NH4HCO3. Przechowywać w ciemności.</li>
		<li>Alkilować próbki i kontrole przez dodanie CAA do końcowego stężenia 55 mM. Wirować krótko przed inkubacją przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
		UWAGA: CAA jest stosowany zamiast jodoacetamidu jako środka redukującego, aby zmniejszyć ryzyko podwójnej modyfikacji karbamidometylu (114.0429) na reszcie lizyny z modyfikacją -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Dodać endopeptydazę LysC do próbek w stosunku 1:25 (w/w) do zawartości białka. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki i próby kontrolne w 200 μl 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Dodać trypsynę do próbek w stosunku 1:25 w/w do zawartości białka. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 10% roztwór kwasu mrówkowego (FA) do wody klasy MS w stosunku 1:10 v/v do każdej próbki i próbki kontrolnej. Sprawdź, czy pH wynosi <3) przed czyszczeniem C18 i w razie potrzeby dodaj więcej kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Do każdej próbki i próby kontrolnej dodać 0,5 μl wzorca ciężkiego peptydu utworzonego w sekcji 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie peptydów
	<ol>
		<li>Kilku producentów oferuje końcówki lub płytki czyszczące C18. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla używanego produktu i wysusz eluowane peptydy w wirówce próżniowej, gotowe do analizy MS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza za pomocą LC-MS/MS
<ol>
	<li>Wykonaj wstępną analizę PRM na ciężkim wzorcu peptydowym w nieplanowany sposób.
	<ol>
		<li>Zawiesić wysuszone próbki w 10 μl buforu ładującego MS 2% ACN/0,05% kwasu trifluorooctowego (TFA).</li>
		<li>Wyposażyć HPLC w kolumnę analityczną C18 z odwróconymi fazami (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 kulek) przeznaczoną do nanoprzepływu MS. Uformuj gradienty liniowe, wymieniając wodę klasy MS uzupełnioną 0,1% FA na ACN zawierającą 0,1% FA. Zastosowano tutaj kolumnę pułapki protektorowej (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 kulek Å C18) w celu zachowania żywotności kolumny analitycznej, ale nie jest ona wymagana.</li>
		<li>Sprzężyć dane wyjściowe kolumny analitycznej ze źródłem nano-ESI na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Zastosuj odpowiednią ukierunkowaną metodę proteomiczną dla spektrometru masowego. Na przykład w przypadku metody Q-Exactive plus dwóch eksperymentów przełączaj się między pełnym stwardnieniem rozsianym a eksperymentem PRM. W eksperymencie Full MS zastosowano rozdzielczość 120 000 z celem AGC 1e6 i 240 ms jako maksimum IT. W eksperymencie PRM zastosowano ten sam cel AGC i maksymalne IT o niższej rozdzielczości 60 000 i oknie izolacji 1,2 m/z.</li>
		<li>Wstrzyknąć 200 ng kontroli ujemnej do kolumny analitycznej za pomocą automatycznego podajnika próbek HPLC. Zastosuj gradient liniowy do próbki na kolumnie analitycznej, zwiększając stężenie ACN od 2–25% w okresie ~45 min. 
		UWAGA: 25% stężenie ACN jest niższe niż zwykle w proteomice ze względu na niską hydrofilowość typowych peptydów charakterystycznych dla topologii ubikwityny. Jeśli inne peptydy mają być oznaczone ilościowo, może być pożądane wyższe stężenie ACN w celu uzyskania dobrej separacji docelowej.</li>
		<li>Przeanalizuj wyniki uruchomienia planowania zgodnie z opisem w sekcji 4.2, aby utworzyć zaplanowaną listę dołączania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek
	<ol>
		<li>Uruchom pozostałe próbki zgodnie z opisem dla planowania w 3.1, z wyjątkiem korzystania z zaplanowanej listy dołączania utworzonej w sekcji 4.2. 
		UWAGA: Po kontroli pozytywnej należy przeprowadzić ślepą próbę, aby upewnić się, że w kolejnych próbkach nie zostanie wykryte przeniesienie z poprzedniej serii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza oprogramowania
<ol>
	<li>Utwórz listę dołączeń z odpowiednim formatowaniem dla używanego MS. Protokół ten korzystał z oprogramowania open source Skyline (wersja 19.1.0.193) (https://skyline.ms), które oferuje dobrze udokumentowane wsparcie i pomoc. Dla kilku spektrometrów masowych można utworzyć listę włączeń za pomocą funkcji eksportu listy izolacji.
	<ol>
		<li>Otwórz nowy dokument Skyline.</li>
		<li>Wybrać modyfikacje ciężkich izotopów odpowiednio do ciężkich peptydów charakterystycznych dla topologii. W Ustawieniach|Ustawienia peptydu w zakładce Modyfikacja kliknij pole nazwy, aby zobaczyć potencjalną modyfikację. Selekcja opiera się na stanie izotopowym zakupionych ciężkich peptydów. W tym przykładzie zastosowano syntetyczne peptydy przenoszące albo ciężką lizynę (13C615N 2-lizynę), albo ciężką argininę (13C615N4-argininę) na końcu C. Odpowiednimi etykietami byłyby: "Etykieta:13C(6)15N(2) (C-term K)" i "Etykieta:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Wybierz Ustawienia|Przejście. W zakładce Filtr znajdują się Ładunki Prekursorów 2, 3, 4.</li>
		<li>Wstaw peptydy, wybierając pozycję Edytuj|Wstawić|Peptydy.</li>
		<li>Wypełnij odpowiednie pola, w tym sekwencję peptydową charakterystyczną dla topologii i nazwę białka (np. "Łańcuch-K63").</li>
		<li>Rozwiń każdy peptyd wyświetlany teraz w panelu Cele. Usuń niepożądane stany naładowania. Preferowany stan naładowania i energia zderzenia, które mogą się różnić w zależności od użytego spektrometru mas, dla każdego peptydu o charakterystyce topologii przedstawiono w tabeli 1.</li>
		<li>Dla każdego peptydu o charakterystyce topologii (z wyjątkiem M1, gdzie GG jest zawarty w sekwencji) kliknij sekwencję prawym przyciskiem myszy i wybierz Modyfikuj. Dodaj GG jako modyfikację strukturalną, klikając pole nazwy i wybierając <Pokaż wszystko...> przed wybraniem "GlyGly (K)".</li>
		<li>Eksport listy izolacji Plik|Eksport|Isolation List, wybierz typ instrumentu i ustaw typ metody na Standardowy. Wybranie przycisku OK spowoduje otwarcie monitu o zapisanie pliku *.csv, którego można użyć do utworzenia metody PRM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz zaplanowaną listę dołączeń na podstawie opisanego tutaj harmonogramu intensywnego peptydowego przy użyciu oprogramowania Skyline o otwartym kodzie źródłowym.
	<ol>
		<li>Utwórz listę celów zgodnie z opisem w sekcji 4.1.</li>
		<li>Zaimportuj przebieg planowania w wersji 3.1, wybierając pozycję Plik|Import|Wyniki.</li>
		<li>Przejrzyj identyfikacje. Ciężki sygnał dla każdego peptydu można zaobserwować, klikając masę dla każdego wpisu ciężkiego peptydu. Prawidłowe rozpoznanie piku jest często określane automatycznie, ale oprogramowanie może wymagać ręcznego wyboru piku za pomocą kliknięcia i przeciągnięcia pod osią x.</li>
		<li>Czasy retencji wybrane dla wariantów ciężkich są również stosowane do wersji lekkich, tworząc w ten sposób harmonogram dla PRM. Okno planowania można modyfikować w obszarze Ustawienia|Ustawienia peptydów za pomocą zakładki Przewidywanie, zmieniając okno czasowe.</li>
		<li>Zaplanowaną listę dołączania można teraz wyeksportować za pomocą polecenia Plik|Eksport|Lista izolacji i wybór odpowiedniego typu instrumentu oraz typu metody ustawiania na Zaplanowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj dane.
	<ol>
		<li>Zaimportuj próbki w taki sam sposób, jak w przypadku analizy przebiegu planowania w sekcji 4.2.</li>
		<li>Po całkowitym zaimportowaniu wszystkich próbek zaleca się selekcję przejść. Jest to proces, w którym usuwane są przejścia z zakłóceniami lub słabym stosunkiem sygnału do szumu. Przykład chromatogramu przed i po selekcji jest pokazany w Rysunek 4.</li>
		<li>Dane można teraz eksportować, klikając prawym przyciskiem myszy odpowiednie wykresy i wybierając opcję Kopiuj dane lub wybierając Plik|Eksport|Wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
<li>Goldstein, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+polypeptide+that+has+lymphocyte-differentiating+properties+and+is+probably+represented+universally+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+Destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction.</a> Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+structures%2C+functions%2C+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ubiquitin+Binders+to+Decipher+the+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+editing+revealed+by+polyubiquitin+linkage-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies.</a> Cell. 134 (4), 668-678 (2008).</li>
<li>Spence, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-regulated+modification+of+the+ribosome+by+a+variant+multiubiquitin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain.</a> Cell. 102 (1), 67-76 (2000).</li>
<li>Borràs, E., Sabidó, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+targeted+proteomics%3F+A+concise+revision+of+targeted+acquisition+and+targeted+data+analysis+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry.</a> PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).</li>
<li>Lesur, A., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-resolution+accurate+mass+spectrometry+application+to+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics.</a> PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).</li>
<li>Longworth, J., Dittmar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Ubiquitin+Chain+Topology+by+Targeted+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+proteasome+reduce+the+accelerated+proteolysis+in+atrophying+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Collision+Energy+Optimization+on+the+Measurement+of+Peptides+by+Selected+Reaction+Monitoring+%28SRM%29+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Analiza stanu ubikwityny w proteomie ma coraz większe znaczenie dla wielu różnych zagadnień biologicznych. Opis stanu ubikwitynacji próbki musi koncentrować się nie tylko na profilu białek ulegających ubikwitynacji, ale także na topologii tej ubikwitynacji. Opisana tutaj ocena tej topologii przez docelowe państwa członkowskie odgrywa rolę w szerokim zakresie badań biologicznych.
Należy rozumieć, że opisany tutaj protokół zapewnia globalny profil topologii. Zastosowanie oddolnego podejścia prot...

Ścisła regulacja funkcji i stabilności białek ma ogromne znaczenie, ponieważ są one głównymi czynnikami wpływającymi na fenotypową kontrolę biologii. Funkcja białka składa się z dwóch elementów: jego wewnętrznej sekwencji polipeptydowej i wszelkich modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Zidentyfikowano różne chemiczne PTM, w tym glikozylację, fosforylację, acetylację i metylację1. W 1975 roku Goldstein i wsp.2 zidentyfikowali małe białko i nazwali je ubikwityną ze względu na jego wszechobecną naturę. Stwierdzono, że ubikwityna odgrywa ważną rolę w degradacji białek3. Jednak od tego czasu ustalono, że funkcja ubikwityny jako cząsteczki sygnałowej wykracza daleko poza regulację stabilności białka. Sygnalizacja ubikwityny bierze udział w szerokim zakresie innych funkcji biologicznych, takich jak stabilizacja białek, autofagia, kontrola cyklu komórkowego i transport białek4.
Podczas gdy inne PTM są zazwyczaj binarne (tzn. białko jest modyfikowane lub pozostawiane niezmodyfikowane) dla danego miejsca, ubikwityna może modyfikować białko zarówno jako monomer, jak i jako łańcuch polimerowy, przy czym sama dołączona ubikwityna jest ubikwitynowana. Co więcej, ten łańcuch poliubikwitynacji może rozwijać się w kilku topologiach, przy czym ubikwitynacja poprzedniej ubikwityny przyłącza się do jednego z ośmiu miejsc wiązania5,6. Ubikwityna jest przenoszona w wieloetapowym procesie enzymatycznym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), w którym C-koniec ubikwityny jest połączony z jedną z siedmiu reszt lizyny (K06, K11, K27, K29, K33, K48 lub K63) lub N-końcem poprzedniej ubikwityny (określanym jako M1 lub ubikwitynacja liniowa)5,6. Ta topologia łańcucha ma kluczowe znaczenie dla losu modyfikowanego białka. Na przykład modyfikacja łańcuchem połączonym K48 lub K11 prowadzi do degradacji zmodyfikowanego białka w proteasomie, podczas gdy łańcuch liniowy jest niezbędny do aktywacji sygnalizacji NF-kB. W związku z tym względny rozkład tych topologii łańcuchów jest istotny dla szerokiej gamy zagadnień biologicznych.
Użycie spektrometrii mas (MS) jest szczególnie korzystne dla analizy topologii łańcucha ubikwityny, ponieważ nie jest zależne od interakcji opartych na przeciwciałach lub powinowactwie7,8, z których wiele ma ograniczoną specyficzność i nie rozróżnia różnych typów łańcuchów. Inną możliwością wykrycia jest użycie genetycznie modyfikowanych mutantów ubikwityny. Tutaj specyficzna lizyna jest wymieniana na argininę, która nie może wspierać modyfikacji przez ubikwitynę. Brak tworzenia się łańcucha ubikwityny na białku substratowym jest następnie interpretowany jako dowód na istnienie określonej topologii9.
MS Identyfikacja ubikwitynowanych białek opiera się na fakcie, że C-koniec ubikwityny zawiera resztę argininy w pozycji 74, która jest rozpoznawana przez trypinę podczas proteolitycznego przygotowania próbek do analizy MS, oddzielając C-końcową podwójną glicynę. Ten GlyGly (-GG) pozostaje przyłączony do grupy ε-aminowej reszty lizyny białka substratowego. W przypadku analizy topologii ubikwityny modyfikacja zachodzi na jednej z siedmiu reszt lizyny ubikwityny. W ten sposób powstaje zestaw siedmiu kluczowych peptydów, które przenoszą resztę lizyny, która jest modyfikowana przez GG, specyficzna dla każdej z topologii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Na przykład w topologii K06 lizyna w pozycji 6 w sekwencji aminokwasów będzie chroniona przed trawieniem tryptycznym dzięki modyfikacji -GG 114 Da dodanej do tej lizyny.
Identyfikacja określonych peptydów przez MS jest określana jako ukierunkowana proteomika, a dokładniej celowane pozyskiwanie peptydów10. Opracowano dwie metody w zależności od wydajności używanego spektrometru masowego. Są to monitorowanie wybranych reakcji (SRM), zwane również monitorowaniem reakcji wielokrotnych (MRM) i monitorowanie reakcji równoległych (PRM). SRM polega na doborze przejść składających się z prekursora m/z i jonu produktu m/z. I odwrotnie, PRM wymaga tylko prekursora m/z. Po selekcji przeprowadzany jest pełny skan ankietowy jonów produktu. Ma to tę zaletę, że przed pomiarem nie jest konieczny wybór odpowiednich jonów produktowych do oznaczania ilościowego na określonym spektrometrze masowym11. Zarówno SRM, jak i PRM mogą być zaplanowane, w zależności od instrumentu. Planowanie to praktyka polegająca na przypisywaniu okna czasowego, w którym dany jon zostanie włączony do analizy, ponieważ peptydy eluują się w określonych czasach retencji z systemu chromatograficznego. Zmniejszenie liczby jonów badanych w danym momencie zwiększa częstotliwość zamierzonych w tym czasie zapytań dotyczących tych jonów, poprawiając w ten sposób dokładność danych.
Ogólnie, zastosowanie ukierunkowanej proteomiki dla topologii ubikwityny jest takie samo jak w każdym innym eksperymencie proteomiki ukierunkowanej. Ważne są jednak dwie kluczowe różnice: po pierwsze, należy wziąć pod uwagę stabilność łańcuchów ubikwityny. Istnieje wiele silnych enzymów deubikwitynujących (DUB), które szybko degradują łańcuchy podczas lizy komórek. Proteazy specyficzne dla ubikwityny dzielą się na dwie kategorie: tioesterazy i metaloproteazy. Większość hydrolaz ubikwityny to tioesterazy, które w swoim aktywnym centrum przenoszą resztę cysteiny. Poprzez alkilowanie tej reszty cysteiny można je inaktywować. W związku z tym stosowanie stabilizujących ubikwitynę zawierających środki alkilujące, takie jak N-etylomaleimid (NEM) i wysoce denaturujące chemikalia, a także utrzymywanie próbek w stanie schłodzonym ma kluczowe znaczenie dla udanej analizy. Po drugie, w przeciwieństwie do innych eksperymentów celowanych, wybór peptydu jest stały. W typowym eksperymencie celowanym peptyd proteotypowy można wybrać pod kątem dobrej wydajności chromatograficznej i jonizacji. Dla niektórych peptydów charakterystycznych dla topologii, takich jak K48, właściwości te są dobre, podczas gdy dla innych są mniej pożądane. Na przykład chromatografia K33 w typowym układzie z odwróconymi fazami jest słaba ze względu na tworzenie rozciągniętego profilu elucji, a słabe właściwości jonizacji peptydu K27 zmniejszają jego widoczność przez MS12.
W tym protokole opisujemy, jak przeprowadzić ocenę topologii ubikwityny próbki biologicznej za pomocą PRM. Przykładowe dane do zabiegu przedstawiono przy użyciu zaburzenia proteasomu za pomocą leczenia inhibitorem MG-132 w kilku różnych typach komórek.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacetamid (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Ciężkie peptydy</td><td>Technologie peptydowe JPT HPLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch kontroli pozytywnej K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch kontroli pozytywnej K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch kontroli pozytywnej M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier</td><td>Sonifier Branson</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karboksyetylo)fosfina (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Wody &mu; Elucja C18 płytki</td><td>Wody</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ocena globalnego profilu topologii łańcuchów ubikwityny w proteomie jest interesująca, aby odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje modyfikację di-glicyny (-GG) pozostałą po tryptycznym trawieniu ubikwityny włączonej w łańcuch. Poprzez ilościowe określenie tych peptydów charakterystycznych dla topologii można określić względną obfitość każdej topologii łańcucha ubikwityny. Kroki wymagane do ilościowego określenia tych peptydów za pomocą równoległego eksperymentu monitorowania reakcji są przedstawione z uwzględnieniem stabilizacji łańcuchów ubikwityny. Przygotowanie ciężkich kontroli, liza komórek i trawienie są opisane wraz z odpowiednią konfiguracją spektrometru mas i przepływem pracy analizy danych. Przedstawiono przykładowy zestaw danych z perturbacjami w topologii ubikwityny, któremu towarzyszą przykłady wpływu optymalizacji protokołu na wyniki. Postępując zgodnie z opisanymi krokami, użytkownik będzie mógł przeprowadzić globalną ocenę krajobrazu topologii ubikwityny w swoim kontekście biologicznym.

Aby zademonstrować zastosowanie analizy łańcuchów ubikwityny za pomocą PRM, wybrano trzy linie komórkowe: mysią linię komórek czerniaka B16 oraz dwie powszechnie stosowane ludzkie linie komórkowe A549 (komórki nabłonka podstawnego pęcherzyków płucnych z gruczolakoraka) i HeLa (komórki raka szyjki macicy). Hodowle te namnażano do średniej fazy wykładniczej w odpowiednich mediach, a następnie traktowano 0, 10 lub 100 mM MG-132 przez 4 h przed zbiorem. MG-132 jest inhibitorem proteasomów zapobiegającym degradacji białek spr...

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Ponieważ różne topologie łańcuchów ubikwityny mają szeroki zakres skutków biologicznych, zrozumienie zmian w ich obfitości jest istotne dla wielu różnych stanów biologicznych. Zastosowanie równoległego monitorowania reakcji do analizy łańcucha ubikwityny pozwala na specyficzną identyfikację i kwantyfikację topologii łańcuchów ubikwityny. W przeciwieństwie do typowych eksperymentów PRM, analiza topologii łańcucha ubikwityny jest ograniczona do określonych zmodyfikowanych peptydów, z których wiele nie jest idealnych do analizy SM.Wizualna demonstracja tej techniki podkreśla korekty i oczekiwane wyniki obserwowane dla tych nieidealnych peptydów. Rozpocząć od przygotowania roztworu wodorowęglanu amonu, roztworu n-etylomaleimidu i buforu stabilizującego ubikwitynę, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Ponownie zawiesić próbkę biologiczną w buforze stabilizującym ubikwitynę i poddać komórki lizie za pomocą odpowiedniej metody.Po lizie komórek odwirować próbkę w temperaturze 18 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek. W razie potrzeby przed kontynuowaniem należy przechow

ubiquitin-chain-analysis-by-parallel-reaction-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Poznaj analizę topologii łańcuchów ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji PRM. Ta metoda spektrometrii masowej umożliwia precyzyjną identyfikację i ilościowe określenie zmian w obfitości łańcuchów.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Przeglądaj więcej filmów