Name: Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj protokół generowania humanizowanych myszy NOG do badań nad HIV, w tym ekspozycję dopochwową i kwantyfikację RNA. Model ten umożliwia ocenę różnych szczepów wirusa oraz nowych interwencji terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Biomedicine Animal Facility na Uniwersytecie w Aarhus, szczególnie Pani Jani Kær za utrzymanie kolonii i śledzenie wagi myszy. Autorzy pragną podziękować profesorowi Florianowi Kleinowi za opracowanie standardu opieki nad pacjentem cART oraz za wskazówki. Następujący odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) od dr Johna Kappesa i dr Christiny Ochsenbauer.

<ol><li>WHO. GHO | By category | Antiretroviral therapy coverage - Data and estimates by WHO region (2018). World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://apps.who.int/gho/data/node.main.626">http://apps.who.int/gho/data/node.main.626</a> (2018).</li>
<li>Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hitchhiker%27s+guide+to+humanized+mice%3A+new+pathways+to+studying+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections.</a> Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).</li>
<li>Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Administration+of+Antiretrovirals+Prior+to+Exposure+Prevents+Rectal+and+Intravenous+HIV-1+Transmission+in+Humanized+BLT+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice.</a> PLoS ONE. 5 (1), 8829(2010).</li>
<li>Zou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nef+functions+in+BLT+mice+to+enhance+HIV-1+replication+and+deplete+CD4+%2B+CD8+%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes.</a> Retrovirology. 9 (1), 44(2012).</li>
<li>Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+transmission+of+R5+and+X4+tropic+HIV-1+via+vaginal+and+rectal+routes+in+humanized+Rag2+-%2F-+%CE%B3c+-%2F-+%28RAG-hu%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice.</a> Virology. 373 (2), 342-351 (2008).</li>
<li>Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+HIV-1+Mucosal+Transmission+and+Prevention+in+Humanized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice.</a> Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).</li>
<li>Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+topical+microbicide+gel+formulation+of+CCR5+antagonist+maraviroc+prevents+HIV-1+vaginal+transmission+in+humanized+RAG-hu+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20209(2011).</li>
<li>Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pre-exposure+prophylaxis+by+anti-retrovirals+raltegravir+and+maraviroc+protects+against+HIV-1+vaginal+transmission+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model.</a> PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).</li>
<li>Veselinovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+pre-exposure+prophylaxis%3A+Mucosal+tissue+drug+distribution+of+RT+inhibitor+Tenofovir+and+entry+inhibitor+Maraviroc+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model.</a> Virology. 464-465, 253-263 (2014).</li>
<li>Akkina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Rag1-%2F-%CE%B3c-%2F-+mice+support+multilineage+hematopoiesis+and+are+susceptible+to+HIV-1+infection+via+systemic+and+vaginal+routes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20169(2011).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+combinatorial+dsiRNAs+via+nanoparticles+efficiently+suppresses+HIV-1+infection+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice.</a> Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).</li>
<li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+routines+cause+animal+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+Topics+in+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).</li>
<li>Trecarichi, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+protective+effect+of+CCR5-Delta+32+heterozygosity+in+a+cohort+of+heterosexual+Italian+HIV-1+exposed+uninfected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals.</a> AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).</li>
<li>Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geographic+spread+of+the+CCR5+%CE%9432+HIV-resistance+allele%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele.</a> PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).</li>
<li>Solloch, U. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequencies+of+gene+variant+CCR5-%CE%9432+in+87+countries+based+on+next-generation+sequencing+of+1.3+million+individuals+sampled+from+3+national+DKMS+donor+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers.</a> Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).</li>
<li>Ochsenbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmitted%2FFounder+HIV-1+Infectious+Molecular+Clones+and+Characterization+of+Their+Replication+Capacity+in+CD4+T+Lymphocytes+and+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).</li>
<li>Andersen, A. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting%2C+Potent+Delivery+of+Combination+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy.</a> ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).</li>
<li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL%2F6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).</li>
<li>Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+mice+with+human+CD34%2B+cells+transduced+by+a+self-inactivating+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector.</a> Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcriptional+activity+during+frequent+longitudinal+sampling+in+aviremic+patients+on+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy.</a> AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).</li>
<li>Halper-Stromberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibodies+and+viral+inducers+decrease+rebound+from+HIV-1+latent+reservoirs+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice.</a> Cell. 158 (5), 989-999 (2014).</li>
<li>Rothenberger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+number+of+rebounding%2Ffounder+HIV+variants+emerge+from+multifocal+infection+in+lymphatic+tissues+after+treatment+interruption%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Hemato-Lymphoid+System+Mice%3A+Current+Use+and+Future+Potential+for+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).</li>
<li>Walsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).</li>
<li>Denton, P. W., García, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mouse+models+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Reviews%22%5BJournal%5D)">Humanized mouse models of HIV infection.</a> AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).</li>
<li>Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+animal+models+to+overcome+temporal%2C+spatial+and+combinatorial+challenges+in+HIV+persistence+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research.</a> Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).</li>
<li>Andersen, A. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAIMP+administration+in+humanized+mice+induces+a+chimerization-level-dependent+STING+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response.</a> Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Mature+and+Functional+Human+Myeloid+Subsets+in+Hematopoietic+Stem+Cell-Engrafted+NOD%2FSCID%2FIL2r+KO+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice.</a> The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPCR%3A+A+technology+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">DPCR: A technology review.</a> Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).</li>
<li>Denton, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+HIV+Latency+in+Humanized+BLT+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice.</a> Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+immune+system+mouse+model+with+robust+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human immune system mouse model with robust lymph node development.</a> Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).</li>
<li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Replication+and+Latency+in+a+Humanized+NSG+Mouse+Model+during+Suppressive+Oral+Combinational+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Virology. 92 (7), 02118(2018).</li>
<li>Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+intake%2C+water+intake%2C+and+drinking+spout+side+preference+of+28+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Behavior+Genetics%22%5BJournal%5D)">Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains.</a> Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+T-cell+subsets+with+HLA-restricted+immune+responses+in+HLA+class+I+expressing+NOD%2FSCID%2FIL2r+null+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).</li>
<li>Willinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IL-3%2FGM-CSF+knock-in+mice+support+human+alveolar+macrophage+development+and+human+immune+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).</li>
<li>Hanazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+immunosuppressive+myeloid+cell+populations+in+human+interleukin-6+transgenic+NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice.</a> Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).</li>
<li>Huntington, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+trans-presentation+promotes+human+NK+cell+development+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Szczep myszy z poważnie obniżoną odpornością NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) doskonale nadaje się do przeszczepiania ludzkich komórek i tkanek. Zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne szlaki odpornościowe u tych myszy są naruszone. Myszy NOG i NSG są nosicielami mutacjiPrkdc scid, która powoduje wadliwą funkcję komórek T i B. Ponadto myszy te nie mają funkcjonalnego γ łańcucha receptora interleukiny-2 (wspólny łańcuch gamma, IL2rg), który jest nie...

Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest przewlekłą infekcją, która dotyka ponad 37 milionów zakażonych osób na całym świecie1. Skojarzona terapia przeciwwirusowa (cART) jest terapią ratującą życie, ale wyleczenie jest nadal uzasadnione. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które odzwierciedlają ludzki układ odpornościowy i jego reakcje, aby ułatwić kontynuowanie badań nad wirusem HIV. Wiele typów humanizowanych myszy, które są zdolne do podtrzymywania wszczepienia komórek i tkanek, zostało opracowanych poprzez przeszczepienie ludzkich komórek myszom z poważnym niedoborem odporności2. Takie humanizowane myszy są podatne na zakażenie wirusem HIV i stanowią ważną alternatywę dla modeli małpiego wirusa niedoboru odporności u naczelnych, ponieważ są tańsze i prostsze w użyciu niż naczelne. Humanizowane myszy ułatwiły badania nad przenoszeniem, patogenezą, profilaktyką i leczeniem wirusa HIV3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Prezentujemy elastyczny, humanizowany system modelowy do badań nad HIV, opracowany przez przeszczepianie ludzkich komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej myszom o pochodzeniu NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG). Oprócz tego, że są pochodzenia niepłodowego, praktyczna bioinżynieria tych myszy jest mniej wymagająca technicznie w porównaniu z procedurami mikrochirurgicznymi związanymi z przeszczepem konstruktu krew-wątroba-grasica (BLT).
Pokazujemy, jak wykryć zakażenie wirusem HIV poprzez transmisję dopochwową i jak monitorować wiremię w osoczu za pomocą czułego systemu kropelkowego opartego na cyfrowym PCR (ddPCR). Następnie opisujemy ustalanie standardowego cART podawanego w ramach codziennej diety myszy. Celem tych połączonych metod jest zmniejszenie stresu u zwierząt i ułatwienie eksperymentów na dużą skalę, w których czas spędzony na obchodzeniu się z każdym zwierzęciem jest ograniczony12.
U ludzi genotyp CCR5Δ32/wt lub CCR5Δ32/ Δ32 powoduje zmniejszoną podatność na zakażenie wirusem HIV wirusami przekaźnika/założyciela13, a pewne środki ostrożności muszą być podjęte podczas bioinżynierii humanizowanych myszy za pomocą komórek macierzystych na potrzeby badań nad HIV. Jest to szczególnie prawdziwe w naszym regionie, ponieważ naturalnie występujące warianty genu CCR5, zwłaszcza delecje Δ32, są bardziej rozpowszechnione w rodzimych populacjach skandynawskich i bałtyckich w porównaniu z resztą świata14,15. W związku z tym nasz protokół obejmuje łatwy, wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy pod kątem wariantów CCR5 przed przeszczepem.
Do ekspozycji dopochwowej wybraliśmy przekaźnik/założyciela wirusa R5 RHPA4259, wyizolowanego od kobiety we wczesnym stadium infekcji, która została zakażona dopochwowo16. Wystawiliśmy myszy na działanie dawki wirusa, która była wystarczająca do pomyślnej transmisji u większości myszy, ale poniżej 100% szybkości transmisji. Wybór takiej dawki umożliwia uzyskanie wystarczającego zakresu dynamicznego szybkości transmisji, tak aby działanie przeciwwirusowe kandydata na lek mogło skutkować ochroną zwierząt w eksperymentach dotyczących zapobiegania HIV i zmniejszeniem wiremii w badaniach nad leczeniem.

<table><tbody><tr><td>Niebieska podkładka</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Należy wysterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (klon OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (klon SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (klon AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (klon SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (klon 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (klon RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Do buforu zawiesinowego</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccos (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Ludzka krew pępowinowa CD34 Zestaw do pozytywnej selekcji II</td><td>Stemcell</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Roztwór lizujący 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w dH20 bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Probówki FACS (Falcon 5 ml round-botton)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący receptor Fc (Human Trustain FcX)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gauze Mesoft</td><td>157300</td><td>Należy wysterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>Lampa grzewcza</td><td></td><td></td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>hemacytometr (B&uuml; rker-T&uuml; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran gazowy</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, zatwierdzone przez PCR-PT</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>Mouse cART</td><td>food sniff Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>Produkt</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Ogranicznik</td><td></td> myszy <td>Produkt</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Igła, Microlance 3, 30G i frac12; "</td><td>Myszy BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>NOG NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Chemikalia VWR</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 Zestaw do izolacji DNA i RNA wirusa</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>zatwierdzone przez PCR probówki wirówkowe</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polimeraza DNA</td><td>Life Technologies</td><td>F549S Końcówki</td><td></td></tr><tr><td>do pipet, sterylne, ART 20P Barrier</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB</td><td>100005398</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QX100 Generator kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100 Czytnik kropel</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>DNAzy, wolne od RNaz wielkości F + bufor reakcyjny</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>Rozpuścić w</td></tr><tr><td>strzykawce H20 Softject 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Trypane niebieskie</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (środek do dezynfekcji wirusów)</td><td>Dupont</td><td>Numer telefonu 7511</td><td></td></tr></tbody></table>

humanizowane myszy nog do dopochwowej ekspozycji na hiv i leczenia zakażenia hiv

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Humanizowane myszy stanowią zaawansowaną platformę do badania wirusologii ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) i testowania leków przeciwwirusowych. Protokół ten opisuje ustanowienie ludzkiego układu odpornościowego u dorosłych myszy NOG. W tym miejscu wyjaśniamy wszystkie praktyczne kroki, od izolacji ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej i ich późniejszego dożylnego przeszczepu myszom, po manipulację modelem poprzez zakażenie wirusem HIV, skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i pobieranie próbek krwi. Około 75 000 komórek hCD34 + jest wstrzykiwanych dożylnie myszom, a poziom ludzkiego chimeryzmu, znanego również jako humanizacja, we krwi obwodowej jest szacowany podłużnie przez miesiące za pomocą cytometrii przepływowej. W sumie 75 000 komórek hCD34+ daje 20%-50% ludzkich komórek CD45+ we krwi obwodowej. Myszy są podatne na wewnątrzpochwowe zakażenie wirusem HIV, a krew może być pobierana raz w tygodniu do analizy i dwa razy w miesiącu przez dłuższy czas. Protokół ten opisuje test do ilościowego oznaczania miana wirusa w osoczu za pomocą kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR). Pokazujemy, w jaki sposób myszy mogą być skutecznie leczone za pomocą standardowego schematu opieki cART w diecie. Dostarczenie cART w postaci zwykłej karmy dla myszy jest znaczącym udoskonaleniem modelu eksperymentalnego. Model ten może być wykorzystywany do analizy przedklinicznej zarówno ogólnoustrojowych, jak i miejscowych związków profilaktyki przedekspozycyjnej, a także do testowania nowych metod leczenia i strategii leczenia HIV.

Strategia bramkowania dla analizy czystości komórek macierzystych przedstawiona jest na Rysunku 1. Rysunek 1A–C pokazuje oczyszczoną populację CD34+, a Rysunek 1D–F frakcję przepuszczoną CD34-, aby zilustrować, że podczas procesu izolacji tracona jest minimalna ilość populacji CD34+. Czystość wyizolowanych komórek macierzystych CD34+ wynosiła od 85% do 95%, przy zanieczyszczeniu limfocytami T poniże...

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Ustanowienie tego humanizowanego modelu myszy może pomóc w przedklinicznych badaniach naukowych nad wirusem HIV. Na przykład można ocenić zarówno różne szczepy wirusa, jak i nowatorskie interwencje związane z HIV. Protokoły te mogą być wykorzystywane do oceny statusu dawcy komórek macierzystych w wariancie CCR5 oraz do skutecznego zakażania humanizowanych myszy wirusem HIV oraz do ilościowego określania miana wirusa w osoczu myszy.Protokół kwantyfikacji RNA można łatwo dostosować do ilościowego oznaczania dowolnej sekwencji wirusowego RNA, która jest wykrywalna w próbkach osocza. Do badań genetycznych próbek krwi pępowinowej pod kątem wariantów CCR5 delta 32 należy inkubować 1,25 mikrolitra niegranulowanego przepływu z 11,25 mikrolitrami mieszanki PCR zawierającej 200 mikromolową mieszaninę dNTP, 0,01 jednostki na mikrolitr polimerazy DNA o wysokiej wierności oraz startery do przodu i do tyłu, jak opisano w tabeli. Dostosuj objętość wodą bez nukleaz do około 12,5 mikrolitra dla każdej reakcji PCR i amplifikuj fragmenty genomu za pomocą programu cyklicznego PCR, jak wskazano w tabeli.Pod koniec reakcji oddziel produkty PCR na 2% żelu agarozowym. Produkty PCR z alleli typu dzikiego i alleli delta 32 dają fragmenty PCR składające się odpowiednio ze 196 par zasad i 164 par zasad, dzięki czemu prążki można łatwo odróżnić za pomocą elektroforezy żelowej. W przypadku dopochwowej ekspozycji na wirusa HIV umieść lampę grzewczą skupioną na środku miejsca pracy, w którym będzie znajdować się mysz i umieść sterylne końcówki do pipet o pojemności 20 mikrolitrów w odpowiedniej pipecie w kapturze.Umieść pojemnik z płynnym środkiem dezynfekującym w kapturze w celu natychmiastowej dezaktywacji wszelkich materiałów i płynów, które miały kontakt z wirusem. Umieść znieczuloną mysz na sterylnej niebieskiej podkładce w pozycji leżącej pod lampą z ogonem myszy skierowanym do tyłu kaptura i potwierdź brak reakcji na odruch pedałowania u myszy. Chwyć zwierzę u nasady ogona.Delikatnie unosząc mysz za podstawę ogona, podeprzyj zwierzę w pozycji pionowej do góry nogami. Użyj sterylnej końcówki rury, aby stymulować obszar narządów płciowych, delikatnie głaszcząc w kierunku odbytu, aby wywołać opróżnienie odbytnicy i zmniejszyć nacisk na pochwę. Aby odsłonić otwór pochwy, ostrożnie owiń ogon myszy przez palce, tak aby srom naturalnie się otworzył.Używając nowej końcówki do pipety, umieść końcówkę na poziomie otworu pochwy i atraumatycznie uwolnij 20 mikrolitrów wirusa do pochwy, pozwalając grawitacji wciągnąć zawiesinę wirusa do pochwy. Po dostarczeniu całego wirusa należy utrzymać mysz w tej pozycji przez pięć minut, aby uniknąć wycieku wirusa spowodowanego grawitacją. Następnie ostrożnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej w pozycji leżącej na plecach i monitoruj aż do pełnego wyzdrowienia.Aby wyizolować RNA z rozmrożonych próbek osocza myszy, należy użyć zestawu do izolacji RNA wirusa zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj próbkę, która wiąże się z kolumną i dodaj etap leczenia DNazą na kolumnie, aby zapewnić usunięcie całego DNA z próbki osocza. Następnie przechowuj próbki RNA w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę.Aby zsyntetyzować cDNA, użyj odwrotnej transkryptazy zgodnie ze standardowymi protokołami, w tym 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy w reakcji cDNA, aby uniknąć degradacji RNA, a następnie przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z tabelą i przechowuj próbki cDNA w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Aby przygotować próbki do ddPCR, zmieszaj 11 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej sondy ddPCR zawierającej polimerazę i dNTP z 250 nanomolami sondy wiążącej mały rowek i 900 nanomolami każdego ze starterów do przodu i do tyłu, jak wskazano w tabeli. Dodaj trzy mikrolitry każdej próbki cDNA i dostosuj całkowitą objętość PCR do 22 mikrolitrów wodą bez nukleazy.Użyj oleju do wytwarzania kropel do sond na generatorze kropel zgodnie z protokołem producenta w celu emulgowania mieszanin PCR. Następnie uruchom program PCR zgodnie z opisem w tabeli. W przypadku leczenia cART po potwierdzonym zakażeniu wirusem HIV należy karmić myszy granulkami przygotowanymi przez zewnętrznego dostawcę zawierającymi standardowy schemat cART, jak wskazano w tabeli.Użyj diety cART w kolorze czerwonym, aby łatwo odróżnić ją od zwykłej karmy dla myszy i stosuj dietę kontrolną bez cART w standardowym brązowym kolorze. W celu rozpoczęcia leczenia należy umieścić dietę karmy zawierającą cART w sterylnych klatkach przed przeniesieniem myszy ze starej klatki do nowej. Następnie monitoruj wagę myszy i codziennie sprawdzaj spożycie karmy zawierającej cART, aby upewnić się, że myszy dostosowują się do zmiany.W tym miejscu przedstawiono strategię bramkowania cytometrią przepływową do analizy czystości komórek macierzystych, przy czym czystość izolowanych komórek macierzystych CD34 dodatnich zwykle waha się od 85 do 95% przy zanieczyszczeniu limfocytów T mniejszym niż 1%. Analiza PCR wykazuje status wariantu CCR5 oczyszczonych komórek macierzystych dawcy, dzięki czemu heterozygotycznych dawców CCR5 delta 32 można łatwo zidentyfikować. Częstość występowania zmutowanego genotypu w grupie 19 dawców wynosiła około 15,8%, co jest zgodne z większymi badaniami epidemiologicznymi populacji skandynawskich.Trzy do pięciu miesięcy po adoptywnym transferze 7,5 razy 10 do czwartej ludzkiej komórki CD45 dodatniej do myszy biorców, 20 do 50% białych krwinek odzyskanych z próbek krwi obwodowej zwierząt biorcy to ludzkie komórki CD45-dodatnie, a myszy rozwiną ludzkie komórki B i T. 64% myszy zostaje zarażonych wirusem HIV po ekspozycji pochwy, jak wykazano. Cztery tygodnie po przejściu na 40-dniową dietę zawierającą standardowy cART, miano wirusa u myszy zakażonych wirusem HIV spada poniżej granicy wykrywalności.Po zaprzestaniu diety wirus odbija się od dna, odzwierciedlając dane kliniczne. Co ważne, myszy na cART dobrze tolerują zmianę diety. Należy pamiętać, że zwierzęta te mają niedobór odporności, a zatem są wrażliwe na środowisko.Przestrzeganie technik aseptycznych poprawi ogólny stan zdrowia zwierząt i powodzenie protokołu. Po ustanowieniu humanizowanej kohorty myszy do zakażenia wirusem HIV, protokół może zostać dostosowany do kwantyfikacji wirusowego RNA w tkankach lub do testowania nowych interwencji w różnych szczepach wirusa. Elastyczność i dostępność humanizowanych myszy do badań nad zakażeniem wirusem HIV umożliwiła krytyczny postęp w badaniach nad wirusologią, immunologią i leczeniem HIV.Przed przystąpieniem do stosowania protokołów dotyczących zakaźnego wirusa HIV należy uzyskać zgodę lokalnych urzędników ds. środowiska pracy i przestrzegać zatwierdzonych procedur odkażania.

humanized-nog-mice-for-intravaginal-hiv-exposure-treatment-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test oceniający skuteczność doustnej terapii antyretrowirusowej (oral cART) w humanizowanym modelu myszy zakażonym ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 (HIV-1). Kombinacja leków ukierunkowanych na HIV-1, w tym nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy i inhibitory transferu nici integrazy, jest podawana wraz z suplementem diety i antybiotykami. Po spożyciu tej mieszaniny przez humanizowane myszy zakażone wirusem HIV-1, skuteczne tłumienie replikacji wirusa ocenia...

Doustna skojarzona terapia przeciwretrowirusowa w leczeniu zakażenia HIV-1 w humanizowanym modelu myszy

Wideo demonstruje technikę generowania humanizowanego modelu myszy z opartą na komórkach macierzystych odpornością przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV). Ludzka tkanka grasicy płodu i zmodyfikowane hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są wszczepiane do torebki nerkowej myszy z poważnie obniżoną odpornością. HSC, które wyrażają chimeryczne receptory antygenowe (CAR) przeciwko wirusowi HIV, są mieszane w galaretowatej mieszaninie białek, która sprzyja ich kolokalizacji z...

Budowa humanizowanego modelu myszy z inżynieryjną odpornością na HIV

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Ten protokół opisuje nowatorską metodę dostarczania doustnych leków antyretrowirusowych, które skutecznie hamują replikację RNA HIV-1 u humanizowanych myszy.

Doustne skojarzone leczenie przeciwretrowirusowe u humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV-1

Ten protokół opisuje, w jaki sposób połączenie infekcji EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP oferuje cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.

Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Poznaj protokół generowania humanizowanych myszy NOG do badań nad HIV, w tym ekspozycję dopochwową i kwantyfikację RNA. Model ten umożliwia ocenę różnych szczepów wirusa oraz nowych interwencji terapeutycznych.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Przeglądaj więcej filmów