Name: Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę znakowania zbliżeniowego TurboID do identyfikacji interakcji białko-białko u roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta pozwala wykrywać przejściowe i słabe powiązania białek in vivo, wspierając badania immunologii roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 dla Y.Z.), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31872637 do Y.Z.) oraz Funduszy Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2019TC028 do Y.Z.), oraz NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 i NIH-GM132582-01 dla S.P.D.K.

UWAGA: Przegląd metody jest pokazany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Nasiona N. benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie o dużej gęstości i utrzymywać w komorze klimatycznej z 16 godzinami światła (około 75 μmol/m2s) i 8 godzinami ciemnego fotoperiodu w temperaturze 23–25 °C.</li>
	<li>Około 1 tydzień później ostrożnie przenieś każdą młodą sadzonkę do doniczek o wymiarach 4 'x 4' i trzymaj sadzonki w tej samej komorze.</li>
	<li>Utrzymuj rośliny w komorze przez około 4 tygodnie, aż osiągną fazę liści 4–8 w celu późniejszej agroinfiltracji15.</li>
</ol>
2. Budowa fuzji TurboID
<ol>
	<li>Użyj standardowej techniki klonowania molekularnego, aby wygenerować fuzję docelowego białka z TurboID (PCR TurboID z plazmidu Addgene #107177). Tutaj użyliśmy N-końcowej domeny TIR receptora immunologicznego NLR jako białka docelowego i skonstruowaliśmy TIR połączony z TurboID pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (p35S::TIR-TurboID). 
	UWAGA: Fuzja enzymu TurboID z końcem karboksylowym lub aminokońcem białka docelowego będzie zależeć od białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zwykle w przypadku białka cytoplazmatycznego oba końce powinny być akceptowalne, o ile fuzja TurboID nie wpływa na funkcję białka docelowego. Jednak w przypadku białka zlokalizowanego w błonie, topologia białka powinna być scharakteryzowana z wyprzedzeniem przed określeniem, który koniec jest najlepszy dla fuzji TurboID.</li>
	<li>Skonstruuj cytryn ze stopionym TurboID pod tym samym promotorem, aby służył jako kontrola do późniejszej ilościowej analizy proteomicznej. 
	UWAGA: Ważne jest, aby skonstruować kontrolę TurboID w celu identyfikacji proteomu proksymalnego do białka docelowego. Kontrola fuzji TurboID powinna wykazywać poziom ekspresji podobny do poziomu białka docelowego połączonego z TurboID. Można to empirycznie określić, dostosowując stężenie Agrobacterium podczas agroinfiltracji. Ponadto ważne jest, aby białko kontrolne miało subkomórkowy wzorzec lokalizacji podobny do białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
3. Agroinfiltracja
<ol>
	<li>Przemiana plazmidów w Agrobacterium
	<ol>
		<li>Dodaj 0,5 μg plazmidów wygenerowanych w krokach 2.1 i 2.2 do 50 μl komórek kompetentnych szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101, przygotowanych zgodnie z wcześniejszym opisem16. 
		UWAGA: Można również stosować inne szczepy Agrobacterium, takie jak GV2260.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Szok cieplny w łaźni wodnej w temperaturze 42 °C przez 60 s.</li>
		<li>Dodać 400 μl pożywki LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 10 g/l NaCl; pH = 7,0) do Agrobacterium i inkubować w temperaturze 28 °C przez 90 min.</li>
		<li>Umieść całą zawartość w probówce na agarze LB uzupełnionym odpowiednimi antybiotykami w celu wyselekcjonowania plazmidu, a także dla Agrobacterium (dla GV3101: 50 mg/L gentamycyny i 50 mg/L ryfampicyny).</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 36–48 godzin, aż do momentu, gdy widoczne będą poszczególne kolonie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać i rozprowadzić kilka pojedynczych kolonii na świeżej płytce agarowej LB z antybiotykami (patrz krok 3.1.5) i rosnąć w temperaturze 28 °C przez noc. 
	UWAGA: Bardziej optymalne jest przeprowadzenie PCR kolonii w celu potwierdzenia obecności specyficznego konstruktu binarnego w Agrobacterium. Z naszego doświadczenia wynika, że ponad 95% kolonii zawiera wprowadzone konstrukty binarne.</li>
	<li>Zaszczepić 3 ml pożywki LB plus odpowiednie antybiotyki (patrz krok 3.1.4) kolonią Agrobacterium zawierającą interesujący konstrukt i inkubować przez wytrząsanie przez noc w temperaturze 28 °C, aż OD600 kultury Agrobacterium osiągnie 2,0.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 3 000 x g i ponownie zawiesić je do OD600 = 1,0 w buforze agroinfiltracyjnym (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringonu). 
	UWAGA: Chociaż optymalna jest inkubacja inokulum przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przed agroinfiltracją, z naszego doświadczenia ze szczepem GV3101 nie było dużej różnicy między ekspresją białka docelowego z inkubacją a bez niej.</li>
	<li>Użyj strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, aby nacieknąć inokulum w (abaksyjnym) naskórku w pełni dojrzałych liści N. benthamiana. 
	UWAGA: Aby przygotować wystarczającą ilość materiału liściowego dla trzech kontrprób biologicznych: zwykle infiltrowany jest cały liść, trzy liście są infiltrowane na roślinę, a do każdej konstrukcji używa się od trzech do czterech roślin. Na każdy liść wystarczy 1,5–2,0 ml zawieszonych agrobakterii.</li>
	<li>Po 36 godzinach po infiltracji (hpi) naciekać 200 μM biotyny (w 10 mM roztworze MgCl2) do liści wstępnie infiltrowanych konstruktami TurboID.</li>
	<li>Utrzymuj roślinę przez dodatkowe 3–12 godzin przed zbiorem tkanki liściowej, jak opisano w sekcji 4. 
	UWAGA: Powodem wyboru 36 hpi do infiltracji biotyny jest to, że ekspresja białka docelowego osiąga szczyt w tym punkcie czasowym, zgodnie z poprzednimi badaniami11. Zaleca się określenie czasu potrzebnego do optymalnej ekspresji białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania. Czas inkubacji po infiltracji biotyny zależy od projektu eksperymentalnego i badanego białka docelowego. Zwykle 3-12 godzin leczenia biotyną pozwala na znakowanie większości białek proksymalnie do białka docelowego za pomocą fuzji TurboID.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek liści
UWAGA: Do późniejszego przetwarzania próbek liści, noś sterylne rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek keratyną. Wszystkie odczynniki powinny być również jak najbardziej wolne od keratyny.
<ol>
	<li>Przeciąć naciekane liście u podstawy ogonka liściowego, usunąć nerwę liścia, a następnie błyskawicznie zamrozić tkankę liścia w ciekłym azocie.</li>
	<li>Zmiel tkankę liściową za pomocą tłuczka i moździerza i przechowuj proszek z liści w probówkach sokoła o pojemności 15 ml lub 50 ml w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia. 
	UWAGA: Weź od trzech do czterech kawałków liści dla każdej z trzech replik biologicznych z różnych roślin. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Przed przystąpieniem do kolejnych etapów zaleca się ocenę ekspresji białka i biotynylacji białka docelowego za pomocą analiz immunoblot. Typowe western bloty są pokazane w Rysunek 2.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja całkowitego białka liściowego
<ol>
	<li>Przenieś około 0,35 g proszku z liści do probówki o pojemności 2 ml. Przygotować dwie probówki dla każdej próbki. 
	UWAGA: Nosić rękawice podczas dotykania jakichkolwiek przedmiotów chłodzonych ciekłym azotem.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu do lizy RIPA (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% deoksycholanu sodu [w/v], 1 mM DTT, 1 tabletka koktajlu inhibitorów proteazy) do 0,35 g sproszkowanego liścia.</li>
	<li>Wirować rurki przez 10 minut.</li>
	<li>Pozostawić próbki na lodzie na 30 minut.</li>
	<li>Mieszaj zawartość co 4-5 minut, kilkakrotnie obracając probówki do góry nogami.</li>
</ol>
6. Usuwanie wolnej biotyny przez odsalanie
UWAGA: Ta sekcja zajmuje około 50 minut.
<ol>
	<li>Zrównoważyć kolumnę odsalającą.
	<ol>
		<li>Usuń uszczelniacz z dna kolumny odsalającej i umieść kolumnę w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Usunąć roztwór do przechowywania przez odwirowanie w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C przez 2 minuty i upewnić się, że nakrętka jest poluzowana.</li>
		<li>Umieść kolumnę odsalającą w probówce o pojemności 50 ml. Wyrównać kolumnę 3x z 5 ml buforu do lizy RIPA, za każdym razem odwirowując w temperaturze 1000 x g i 4 °C przez 2 minuty i odrzucając przepływ.</li>
		<li>Przenieść kolumnę odsalającą do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać tymczasowo w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować probówki z kroku 5.4 w temperaturze 16 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant z dwóch probówek do nowej probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodać 1 500 μl ekstraktu białkowego do górnej części żywicy zrównoważonej kolumny odsalającej (od kroku 6.1.4). Gdy ekstrakt białkowy dostanie się do żywicy, dodaj kolejne 100 μl buforu do lizy RIPA. 
	UWAGA: Chociaż do ekstrakcji białka z liści użyto 1 400 μl buforu do lizy RIPA, całkowita objętość po ekstrakcji białka i odsoleniu była niezmiennie do pewnego stopnia zwiększona w stosunku do pierwotnej objętości. W związku z tym połączenie próbek z każdej grupy, jak opisano w krokach 5.1 i 5.4, może dać co najmniej 1 500 μl ekstraktu białkowego na próbkę.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C przez 2 minuty i pozostawić odsolone próbki na lód.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja odsolonych ekstraktów białkowych za pomocą testu Bradforda
<ol>
	<li>Przygotować 50 μl każdego gradientowego roztworu BSA: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/ml i 1 mg/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć odsolony ekstrakt białkowy przez zmieszanie próbki o objętości 5 μl z 45 μl ddH2O.</li>
	<li>Przygotuj 1x regent Bradforda, rozcieńczając 5x regenta Bradforda (100 mg błękitu brylantowego Coomassie G250, 47 ml metanolu, 100 ml 85% kwasu fosforowego, 53 ml ddH2O).</li>
	<li>Dodaj 50 μl każdego gradientowego roztworu BSA i 50 μl rozcieńczonego ekstraktu białkowego do 2,5 ml 1x Bradford regent.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu z każdej próbki do jednego dołka na płytce ELISA (trzy kontrpróby techniczne na próbkę).</li>
	<li>Zmierz średnicę zewnętrzną595 za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Narysować krzywą wzorcową na podstawie wartości gradientowego roztworu BSA i obliczyć stężenie odsolonych próbek białka. Zwykle całkowite stężenie białka uzyskane z 0,7 g liści waha się w granicach 3–6 mg/ml.</li>
	<li>Przygotuj 6–8 mg odsolonego ekstraktu białkowego do późniejszego oczyszczania powinowactwa.</li>
</ol>
8. Wzbogacanie białek biotynylowanych
<ol>
	<li>Weź 200 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidn-C1 do probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zrównoważyć kulki magnetyczne sprzężone streptawidn-C1 z 1 ml buforu do lizy RIPA przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po każdym myciu użyj stojaka magnetycznego, aby zaadsorbować kulki przez 3 minuty i delikatnie usuń roztwór przez pipetowanie.</li>
	<li>Powtórz kroki 8.2 i 8.3.</li>
	<li>Przenieś odsolony ekstrakt białkowy do zrównoważonych kulek magnetycznych sprzężonych streptavidn-C1.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 12 godzin (lub przez noc) na rotatorze w celu oczyszczenia biotynylowanych białek pod względem powinowactwa.</li>
	<li>Chwyć kulki na stojaku magnetycznym przez 4 minuty w temperaturze suchej, aż kulki zbiorą się po jednej stronie probówki, a następnie delikatnie usuń supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml buforu do przemywania I (2% SDS w wodzie) do probówki i trzymać go na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 8 minut. Powtórz krok 8.3.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml buforu do przemywania II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% Triton X-100) do probówki i trzymać ją na rotatorze w temperaturze RT przez 8 minut. Powtórz krok 8.3.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml buforu do przemywania III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% kwasu deoksycholowego [w/v], 1% NP40 [v/v]) do probówki i trzymać go na rotatorze w temperaturze RT przez 8 minut. Powtórzyć krok 8.3.</li>
	<li>Dodać 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), aby usunąć detergent, a następnie powtórzyć krok 8.3.</li>
	<li>Przenieś kulki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i powtórz kroki 8.11 i 8.3.</li>
	<li>Przemyć kulki 6x przez 5 minut każdy za pomocą 50 mM buforu wodorowęglanu amonu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 50 mM buforu wodorowęglanu amonu do kulek magnetycznych i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Usuń 100 μl kulek do analizy immunoblot, aby potwierdzić wzbogacenie biotynylowanych białek. Typowy western blot jest pokazany w Rysunek 3.</li>
	<li>Pozostałe próbki białek należy błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast wysłać do analizy LC-MS/MS na suchym lodzie. 
	UWAGA: Typowe wyniki stwardnienia rozsianego są przedstawione w poprzedniej publikacji (Zhang i wsp. 2019; Rysunek 2, Dane uzupełniające 1 i Dane uzupełniające 2)11. Całe zestawy danych są dostępne w serwisie MassIVE (znajdującym się pod adresem <http://massive.ucsd.edu>) pod identyfikatorem: MSV000083018 i MSV000083019.</li>
</ol>

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
<li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling+of+interacting+proteins%3A+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li>
<li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li>
<li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li>
<li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+%28BioID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).</li>
<li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li>
<li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).</li>
<li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864(2019).</li>
<li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).</li>
<li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li>
<li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li>
<li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana%3A+a+plant+for+all+reasons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ligaza biotyny TurboID jest generowana w wyniku ukierunkowanej ewolucji BioID10 opartej na wyświetlaczu drożdży. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi enzymami PL. TurboID pozwala na zastosowanie PL do innych systemów modelowych, w tym much i robaków, których optymalna temperatura wzrostu wynosi około 25 °C10. Chociaż podejście PL jest szeroko stosowane w systemach zwierzęcych, jego zastosowanie w roślinach jest ograniczone. Opisany tutaj protokół zawiera procedurę krok po k...

PPI są podstawą różnych procesów komórkowych. Tradycyjne metody identyfikacji IPP obejmują badania przesiewowe drożdży z dwoma hybrydami (Y2H) i immunoprecypitację sprzężoną ze spektrometrią mas (IP-MS)1. Jednak oba mają pewne wady. Na przykład badanie przesiewowe Y2H wymaga dostępności biblioteki Y2H docelowych gatunków roślin lub zwierząt. Budowa tych bibliotek jest pracochłonna i kosztowna. Ponadto podejście Y2H przeprowadza się na heterologicznych jednokomórkowych drożdżach organizmów eukariotycznych, które mogą nie reprezentować statusu komórkowego wyższych komórek eukariotycznych.
Dla kontrastu, IP-MS wykazuje niską skuteczność w wychwytywaniu przejściowych lub słabych IPP, a także nie nadaje się do białek o niskiej obfitości lub wysokiej hydrofobowości. Wiele ważnych białek biorących udział w roślinnych szlakach sygnałowych, takich jak kinazy receptoropodobne (RLK) lub rodzina receptorów immunologicznych NLR, ulega ekspresji na niskich poziomach i często przejściowo oddziałuje z innymi białkami. W związku z tym znacznie ogranicza to zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw regulacji tych białek.
Ostatnio, metody etykietowania zbliżeniowego (PL) oparte na zmodyfikowanej peroksydazie askorbinianowej (APEX) i zmutowanej ligazie biotyny Escherichia coli BirAR118G (znanej jako BioID) zostały opracowane i wykorzystane do badania IPP2,3,4. Zasada działania PL polega na tym, że białko docelowe będące przedmiotem zainteresowania jest łączone z enzymem, który katalizuje tworzenie labilnego biotynyl-AMP (bio-AMP). Te wolne bio-AMP są uwalniane przez enzymy PL i dyfundują w okolice białka docelowego, umożliwiając biotynylację białek proksymalnych na pierwszorzędowych aminach w szacowanym promieniu 10 nm5.
To podejście ma znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami Y2H i IP-MS, takie jak możliwość wychwytywania przejściowych lub słabych PPI. Ponadto PL umożliwia znakowanie białek proksymalnych białka docelowego w ich natywnym środowisku komórkowym. Różne enzymy PL mają unikalne wady przy stosowaniu ich do różnych układów. Na przykład, chociaż APEX oferuje wyższą kinetykę znakowania w porównaniu z BioID i jest z powodzeniem stosowany w systemach ssaków, wymóg toksycznego nadtlenku wodoru (H2O2) w tym podejściu sprawia, że nie nadaje się on do badań PL na roślinach.
W przeciwieństwie do tego, PL oparte na BioID unika użycia toksycznego H2O2, ale tempo znakowania jest powolne (wymaga 18-24 godzin do zakończenia biotynylacji), co sprawia, że wychwytywanie przejściowych IPP jest mniej efektywne. Co więcej, wyższa temperatura inkubacji (37 °C) wymagana do skutecznego PL przez BioID wprowadza stres zewnętrzny do niektórych organizmów, takich jak rośliny4. W związku z tym zgłoszono ograniczone zastosowanie PL opartego na BioID w roślinach (tj. protoplastach ryżowych, Arabidopsis i N. benthamiana)6,7,8,9. Niedawno opisany enzym TurboID przezwycięża braki PL opartego na APEX i BioID. TurboID wykazał wysoką aktywność, która umożliwia osiągnięcie PL w ciągu 10 minut przy RT10. PL oparty na TurboID został z powodzeniem zastosowany w komórkach ssaków, much i robaków10. Ostatnio wraz z innymi grupami badawczymi niezależnie zoptymalizowaliśmy i rozszerzyliśmy zastosowanie PL opartego na TurboID do badania IPP w różnych systemach roślinnych, w tym w roślinach N. benthamiana i Arabidopsis oraz owłosionych korzeniach pomidorów11,12,13,14. Analizy porównawcze wykazały, że TurboID działa lepiej w przypadku PL w roślinach w porównaniu do BioID11,14. Wykazano również odporność PL na bazie TurboID w roślinach, identyfikując szereg nowych interakcji z receptorem immunologicznym NLR11, białkiem, którego partnerzy w interakcji są zwykle trudni do uzyskania przy użyciu tradycyjnych metod.
Ten protokół ilustruje PL oparty na TurboID w planta, opisując identyfikację białek interakcji N-końcowej domeny TIR receptora immunologicznego NLR w roślinach N. benthamiana. Metodę można rozszerzyć na dowolne białka będące przedmiotem zainteresowania N. benthamiana. Co ważniejsze, stanowi ważne odniesienie do badania IPP w innych gatunkach roślin, takich jak Arabidopsis, pomidor i inne.

<table><tbody><tr><td>721 Spektrofotometr</td><td>Metash, wyprodukowany w Chinach</td><td>Q / SXFZ6</td><td>do pomiaru OD600</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4639-1G</td><td>50 mM Wirówka</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Wirówka 5702</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>cOmcomplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697489001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas deoksycholowy</td><td>Sigma</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>VWR Life Science</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptawidyna C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>Do oczyszczania powinowactwa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tabliczka ELISA</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-P</td><td>Miliporowy</td><td>IPVH00010</td><td>Do analizy Western blot</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku litu (LiCl), 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzenie o niskiej prędkości wirówka</td><td>Zonkia, wyprodukowana w Chinach</td><td>KDC-2046</td><td>Do odsalania</td></tr><tr><td>chlorku magnezu, sześciowodnego (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>Do adsorpcji perełkowej</td></tr><tr><td>Multiskan FC Fotometr mikropłytkowy Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>N07710</td><td>Do pomiaru OD595</td></tr><tr><td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-HA</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td></td></tr><tr><td>Mikser rotacyjny</td><td>Kylin-Bell Lab Instrument</td><td>WH-986</td><td>do</td></tr><tr><td>inkubatora szokowego</td> IP <td>Labotery, wyprodukowany w Chinach</td><td>ZQPZ-228</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L4390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab7403</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560E</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z płaszczem wodnym</td><td>Niebieski pard, wyprodukowany w Chinach</td><td>GHP-9080</td><td>Do inkubacji</td></tr> <tr><td>AgrobacteriumKolumna odsalająca Zeba Spin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89893</td><td>Do usuwania biotyny</td></tr></tbody></table>

znakowanie zbliżeniowe oparte na turboid do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Techniki znakowania zbliżeniowego (PL) z użyciem zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (APEX) lub ligazy biotyny Escherichia coli BirA (znanej jako BioID) zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji interakcji białko-białko (PPI) w komórkach ssaków. Jednak wymagania dotyczące toksycznego nadtlenku wodoru (H2O2) w PL na bazie APEX, dłuższy czas inkubacji z biotyną (16–24 h) i wyższa temperatura inkubacji (37 °C) w PL na bazie BioID poważnie ograniczają ich zastosowanie w roślinach. Niedawno opisana PL oparta na TurboID rozwiązuje wiele ograniczeń BioID i APEX. TurboID umożliwia szybkie znakowanie zbliżeniowe białek w zaledwie 10 minut w warunkach temperatury pokojowej (RT). Chociaż użyteczność TurboID została zademonstrowana w modelach zwierzęcych, ostatnio wykazaliśmy, że PL oparty na TurboID działa lepiej u roślin w porównaniu z BioID do znakowania białek, które są proksymalne do białka będącego przedmiotem zainteresowania. Poniżej przedstawiono protokół krok po kroku do identyfikacji partnerów interakcji białkowych przy użyciu N-końcowej domeny receptora Toll / interleukiny-1 (TIR) rodziny białek bogatych w nukleotydy (NLR) jako modelu. Metoda opisuje budowę wektorów, agroinfiltrację konstruktów ekspresji białek, obróbkę biotyną, ekstrakcję i odsalanie białek, kwantyfikację i wzbogacanie biotynylowanych białek poprzez oczyszczanie powinowactwa. Opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do badania innych interesujących białek Nicotiana i innych gatunków roślin.

Reprezentatywne dane, ilustrujące oczekiwane wyniki na podstawie opisanego protokołu, zostały zaadaptowane z pracy Zhang et al11. Rysunek 1 podsumowuje procedury przeprowadzania PL w oparciu o TurboID w N. benthamiana. Rysunek 2 przedstawia ekspresję białek i biotinylację w zainfiltrowanych liściach N. benthamiana. Rysunek 3 pokazuje, że białka zabiotynilowane w zainfiltrowanych liściach zos...

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Receptory immunologiczne NLR odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w obronie roślin przed różnymi patogenami. Opisujemy metodę znakowania zbliżeniowego opartą na TurboID w celu identyfikacji partnerów interakcji domeny receptora Toll / interleukiny-1 zawierającej NLR, takich jak receptory immunologiczne w roślinach Nicotiana benthamiana. Protokół ten stanowi ważne odniesienie do badania interakcji białko-białko u innych gatunków roślin i może być rozszerzony na dowolne białko będące przedmiotem zainteresowania w Nicotiana benthamiana.Podejście oparte na znakowaniu zbliżeniowym TurboID ma wyraźną przewagę nad tradycyjnymi podejściami, ponieważ może być wykorzystywane do wychwytywania przejściowych lub słabych interakcji białko-białko in vivo. Zacznij od uprawy nasion N.benthamiana w wilgotnej glebie o dużej gęstości. Przechowuj je w komorze klimatycznej z 18-godzinnym okresem świecenia i ośmiogodzinnym ciemnym okresem fotografowania w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza.Trzymaj rośliny w komorze przez około cztery tygodnie, aż osiągną fazę liści od czterech do ośmiu w celu późniejszej agroinfiltracji. Skonstruuj fuzje TurboID i przekształć plazmidy w kompetentne komórki Agrobacterium tumefaciens, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj jednomililitrowej strzykawki bezigłowej, aby nacieknąć inokulum naskórka osiowego w pełni dojrzałych liści N. benthamiana.Po 36 godzinach od filtracji naciekaj 200 mikromolową biotynę do liści i utrzymuj roślinę przez dodatkowe trzy do 12 godzin przed zebraniem tkanki liścia. Aby pobrać próbkę liści, odetnij naciekane liście u podstawy ogonka, usuń nerw liścia i błyskawicznie zamroź tkankę w ciekłym azocie. Zmiel tkankę liścia tłuczkiem i moździerzem i przechowuj proszek w 15 lub 50 mililitrowych tubkach Falcon w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby wyekstrahować całkowite białko, przenieś około 0,35 grama proszku z liści do dwumililitrowej probówki. Podczas tego procesu należy utrzymywać tkankę w niskiej temperaturze w ciekłym azocie. Do proszku dodać 700 mikrolitrów buforu do lizy RIPA.Wirować probówkę przez 10 minut i pozostawić próbkę na lodzie na 30 minut, mieszając zawartość co cztery do pięciu minut, odwracając probówki. Odwirować probówki z prędkością 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zbierz supernatant.Usuń wolną biotynę, przepuszczając próbkę przez kolumnę odsalającą. Usuń uszczelniacz z dołu kolumny i umieść go w 50-mililitrowej tubie. Następnie poluzuj nakrętkę i odwiruj kolumnę w temperaturze 1 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty.Umieść kolumnę odsalającą w świeżej 50-mililitrowej probówce i trzykrotnie zrównoważ kolumnę pięcioma mililitrami buforu do lizy RIPA. Odwirować go w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty i za każdym razem odrzucać przepływ. Dodaj 1,5 mililitra ekstraktu białkowego do górnej części żywicy w zrównoważonej kolumnie.A kiedy ekstrakt dostanie się do żywicy, dodaj kolejne 100 mikrolitrów buforu do lizy RIPA. Odwirować kolumnę przez dwie minuty i pozostawić odsolone próbki na lodzie do czasu dalszego użycia. Aby określić ilościowo odsolone ekstrakty białkowe, zmierz OD595 za pomocą spektrofotometru Bio-Rad.Narysować krzywą wzorcową na podstawie wartości gradientowego roztworu BSA i obliczyć stężenie odsolonych próbek białka. Zrównoważyć sprzężone kulki magnetyczne streptawidyny C1 z jednym mililitrem buforu do lizy RIPA przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Użyj stojaka magnetycznego, aby wchłonąć kulki przez trzy minuty i delikatnie zassać roztwór.Następnie powtórz pranie jeszcze raz. Przenieś ekstrakt białkowy do zrównoważonych kulek magnetycznych i inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na rotatorze, aby oczyścić białka z powinowactwa. Następnego dnia uchwyć koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj supernatant.Następnie umyj kulki 1,7 mililitra buforu do płukania, dodając go do probówki i inkubuj na wirniku przez osiem minut. Usunąć supernatant zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórzyć płukanie z 1,7 mililitra buforu do przemywania nr dwa i buforu do płukania nr 3. Dodaj 1,7 mililitra 50-milimolowego Tris HCL, aby usunąć detergent.Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Powtórz pranie z jednym mililitrem 50-milimolowego Tris HCL i przenieś kulki do nowej 1,5 mililitrowej tubki. Na koniec umyj kulki sześciokrotnie 50-milimolowym buforem wodorowęglanu amonu przez pięć minut na pranie.Użyj 100 mikrolitrów kulek do analizy immunoblot, aby potwierdzić wzbogacenie biotynylowanych białek i błyskawicznie zamroź resztę próbki, która ma być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Western blot wykorzystano do analizy ekspresji białek i biotynylacji w agroinfiltrowanych liściach N. benthamiana. Biotynylowane białka w naciekanych liściach zostały skutecznie wzbogacone o sprzężone kulki magnetyczne streptawidyny C1 w celu późniejszej analizy spektrometrii mas.Uchwycono różne białka o różnych rozmiarach, a analiza Western blot wzbogaconych białek wykazała rozmazane prążki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o usunięciu uszczelniacza z dna kolumny odsalającej i poluzowaniu nakrętek przed każdym wirowaniem. Protokół ten można łatwo dostosować do innych białek będących przedmiotem zainteresowania Nicotiana benthamiana i może być również stosowany do rozszerzania TurboID PL u innych gatunków roślin.

turboid-based-proximity-labeling-for-planta-identification-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Opisujemy metodę generowania indukowalnych stabilnych linii komórkowych oznaczonych znacznikami lokalizacji i powinowactwa (LAP) do badania funkcji białek, czasoprzestrzennej lokalizacji subkomórkowej i sieci interakcji białko-białko.

Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę znakowania zbliżeniowego TurboID do identyfikacji interakcji białko-białko u roślin Nicotiana benthamiana. Technika ta pozwala wykrywać przejściowe i słabe powiązania białek in vivo, wspierając badania immunologii roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Przeglądaj więcej filmów