Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Receptory immunologiczne NLR odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w obronie roślin przed różnymi patogenami. Opisujemy metodę znakowania zbliżeniowego opartą na TurboID w celu identyfikacji partnerów interakcji domeny receptora Toll / interleukiny-1 zawierającej NLR, takich jak receptory immunologiczne w roślinach Nicotiana benthamiana. Protokół ten stanowi ważne odniesienie do badania interakcji białko-białko u innych gatunków roślin i może być rozszerzony na dowolne białko będące przedmiotem zainteresowania w Nicotiana benthamiana.

Podejście oparte na znakowaniu zbliżeniowym TurboID ma wyraźną przewagę nad tradycyjnymi podejściami, ponieważ może być wykorzystywane do wychwytywania przejściowych lub słabych interakcji białko-białko in vivo. Zacznij od uprawy nasion N.benthamiana w wilgotnej glebie o dużej gęstości. Przechowuj je w komorze klimatycznej z 18-godzinnym okresem świecenia i ośmiogodzinnym ciemnym okresem fotografowania w temperaturze od 23 do 25 stopni Celsjusza.

Trzymaj rośliny w komorze przez około cztery tygodnie, aż osiągną fazę liści od czterech do ośmiu w celu późniejszej agroinfiltracji. Skonstruuj fuzje TurboID i przekształć plazmidy w kompetentne komórki Agrobacterium tumefaciens, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj jednomililitrowej strzykawki bezigłowej, aby nacieknąć inokulum naskórka osiowego w pełni dojrzałych liści N. benthamiana.

Po 36 godzinach od filtracji naciekaj 200 mikromolową biotynę do liści i utrzymuj roślinę przez dodatkowe trzy do 12 godzin przed zebraniem tkanki liścia. Aby pobrać próbkę liści, odetnij naciekane liście u podstawy ogonka, usuń nerw liścia i błyskawicznie zamroź tkankę w ciekłym azocie. Zmiel tkankę liścia tłuczkiem i moździerzem i przechowuj proszek w 15 lub 50 mililitrowych tubkach Falcon w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wyekstrahować całkowite białko, przenieś około 0,35 grama proszku z liści do dwumililitrowej probówki. Podczas tego procesu należy utrzymywać tkankę w niskiej temperaturze w ciekłym azocie. Do proszku dodać 700 mikrolitrów buforu do lizy RIPA.

Wirować probówkę przez 10 minut i pozostawić próbkę na lodzie na 30 minut, mieszając zawartość co cztery do pięciu minut, odwracając probówki. Odwirować probówki z prędkością 20 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie zbierz supernatant.

Usuń wolną biotynę, przepuszczając próbkę przez kolumnę odsalającą. Usuń uszczelniacz z dołu kolumny i umieść go w 50-mililitrowej tubie. Następnie poluzuj nakrętkę i odwiruj kolumnę w temperaturze 1 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty.

Umieść kolumnę odsalającą w świeżej 50-mililitrowej probówce i trzykrotnie zrównoważ kolumnę pięcioma mililitrami buforu do lizy RIPA. Odwirować go w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty i za każdym razem odrzucać przepływ. Dodaj 1,5 mililitra ekstraktu białkowego do górnej części żywicy w zrównoważonej kolumnie.

A kiedy ekstrakt dostanie się do żywicy, dodaj kolejne 100 mikrolitrów buforu do lizy RIPA. Odwirować kolumnę przez dwie minuty i pozostawić odsolone próbki na lodzie do czasu dalszego użycia. Aby określić ilościowo odsolone ekstrakty białkowe, zmierz OD595 za pomocą spektrofotometru Bio-Rad.

Narysować krzywą wzorcową na podstawie wartości gradientowego roztworu BSA i obliczyć stężenie odsolonych próbek białka. Zrównoważyć sprzężone kulki magnetyczne streptawidyny C1 z jednym mililitrem buforu do lizy RIPA przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Użyj stojaka magnetycznego, aby wchłonąć kulki przez trzy minuty i delikatnie zassać roztwór.

Następnie powtórz pranie jeszcze raz. Przenieś ekstrakt białkowy do zrównoważonych kulek magnetycznych i inkubuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na rotatorze, aby oczyścić białka z powinowactwa. Następnego dnia uchwyć koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj supernatant.

Następnie umyj kulki 1,7 mililitra buforu do płukania, dodając go do probówki i inkubuj na wirniku przez osiem minut. Usunąć supernatant zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórzyć płukanie z 1,7 mililitra buforu do przemywania nr dwa i buforu do płukania nr 3. Dodaj 1,7 mililitra 50-milimolowego Tris HCL, aby usunąć detergent.

Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Powtórz pranie z jednym mililitrem 50-milimolowego Tris HCL i przenieś kulki do nowej 1,5 mililitrowej tubki. Na koniec umyj kulki sześciokrotnie 50-milimolowym buforem wodorowęglanu amonu przez pięć minut na pranie.

Użyj 100 mikrolitrów kulek do analizy immunoblot, aby potwierdzić wzbogacenie biotynylowanych białek i błyskawicznie zamroź resztę próbki, która ma być przechowywana w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Western blot wykorzystano do analizy ekspresji białek i biotynylacji w agroinfiltrowanych liściach N. benthamiana. Biotynylowane białka w naciekanych liściach zostały skutecznie wzbogacone o sprzężone kulki magnetyczne streptawidyny C1 w celu późniejszej analizy spektrometrii mas.

Uchwycono różne białka o różnych rozmiarach, a analiza Western blot wzbogaconych białek wykazała rozmazane prążki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o usunięciu uszczelniacza z dna kolumny odsalającej i poluzowaniu nakrętek przed każdym wirowaniem. Protokół ten można łatwo dostosować do innych białek będących przedmiotem zainteresowania Nicotiana benthamiana i może być również stosowany do rozszerzania TurboID PL u innych gatunków roślin.