Name: Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek mięśniowych i nabłonkowych gruczołu mlekowego myszy poprzez różnicową trypsynizację. Technika umożliwia wytwarzanie trójwymiarowych organoidów do badań biologii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Benowi Abramsowi za pomoc techniczną i wsparcie ze strony Instytutu Biologii Komórek Macierzystych (IBSC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz (UCSC). Dziękujemy Susan Strome i Billowi Saxtonowi za korzystanie z mikroskopu konfokalnego Solamere Spinning Disk. Praca ta była częściowo wspierana przez granty dla UCSC z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa za pośrednictwem programu James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), z NIH (NIH GM058903) na inicjatywę na rzecz maksymalizacji rozwoju studentów (HM) oraz z National Science Foundation na stypendium badawcze dla absolwentów (O.C. DGE 1339067) oraz przez grant (A18-0370) z UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz.
1. Dzień 1: Trawienie gruczołu sutkowego
<ol>
	<li>Przygotuj się do zbioru MG od dojrzałych samic myszy w wieku 10-14 tygodni.
	<ol>
		<li>Zbiór należy wykonywać na otwartej ławce w warunkach aseptycznych.</li>
		<li>Wysterylizuj wszystkie materiały chirurgiczne, tablice korkowe i szpilki poprzez autoklawowanie i moczenie w 70% alkoholu przez 20 minut przed zabiegiem.</li>
		<li>Znieczulenie zwierząt pentobarbitalem sodu (2 razy większa dawka znieczulająca 0,06 mg/g masy ciała) podawanym we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Monitoruj poziom znieczulenia, ściskając palce u nóg zwierzęcia, aby sprawdzić reakcję odruchową i rozpocznij protokół dopiero po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia.</li>
		<li>Połóż zwierzę na grzbiecie, przypnij jego wyrostki do tablicy korkowej i przetrzyj brzuch i klatkę piersiową etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zebrać #2, 3, 4 i 5 MG od jednej myszy (tj. 8 MG, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A), zidentyfikuj linię środkową między dwiema tylnymi nogami i wykonaj małe nacięcie (1 cm) na skórze brzucha ostrymi nożyczkami, a następnie przedłuż cięcie aż do szyi18.</li>
	<li>Następnie wykonaj małe nacięcia bocznie w kierunku nóg i ramion, aby umożliwić uwolnienie skóry za pomocą bawełnianego wacika. Odciągnij skórę i rozciągnij ją mocno, zanim przyciśniesz ją z jednej strony (Rysunek 1B, krok 1)18. Usuń MG, przecinając je pod nimi, i usuń węzły chłonne z gruczołów #4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, kroki 2, 3)18. Powtórz procedurę po drugiej stronie ciała.</li>
	<li>Zebrać tkankę MG w 50 ml 4 °C Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 (F12) uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1X Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (Anty-Anty)18.</li>
	<li>Posiekaj gruczoły w naczyniu o średnicy 35 mm lub na płytce ceramicznej za pomocą żyletki lub rozdrabniacza do tkanek. Obracaj płytkę co pięć ręcznych siekań lub co rundę na rozdrabniaczu do tkanek, aż kawałki tkanki z łatwością zmieszczą się w końcówce mikropipety o pojemności 1 ml (~0,1 mm/fragment, <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Trawić MG w pożywce wytrawiającej (patrz Tabela 1) przez 14 godzin w 6-dołkowym naczyniu o niskiej przyczepności w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Dzień 2: Izolacja fragmentów tkanki nabłonkowej sutka
<ol>
	<li>Po 14 godzinach trawienia delikatnie wymieszać, pipetując strawioną tkankę 10X za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, aby rozbić pozostały zrąb lub tkankę tłuszczową, upewniając się, że nie powstają pęcherzyki ani nadmierna siła mechaniczna. 
	UWAGA: Jeśli po 14 godzinach trawienie jest niepełne, może to być spowodowane nagromadzeniem ściętego DNA. W takim przypadku należy dodać 1 μl 1 mg/ml deoksyrybonukleazy I (DNazy I) na 2 ml pożywki wytrawiającej. Inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zbierz tkankę do probówki o pojemności 15 ml i przepłucz studzienkę używaną do trawienia 2-3 ml soli fizjologicznej klasy 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) wolnej od Ca2+ i Mg2+. Wirować przy 600 x g przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant zawierający warstwę lipidową i pożywkę, a następnie ponownie zawiesić osad w 5 ml DPBS i przełączyć na nową probówkę o pojemności 15 ml. Wirować przy 600 x g przez 10 min.</li>
	<li>Podczas wirowania umieścić sitko o proporcjach 70 μm z komórek nylonowych w probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilżyć sitko za pomocą 10 ml DMEM/F12 o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić fragmenty tkanek z kroku protokołu 2.4 za pomocą 5 ml DPBS i przepuścić zawiesinę przez wstępnie zwilżone sitko do komórek nylonowych o grubości 70 μm w celu usunięcia komórek zrębu i pojedynczych komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Zbierz fragmenty tkanek na sitku do komórek. Przepłukać 4X 10 ml 37 °C DMEM/F12 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D). 
	UWAGA: Niepełne płukanie spowoduje zanieczyszczenie kultur komórkami nienabłonkowymi.</li>
	<li>Uwolnij fragmenty tkanki, przytrzymując zakładkę sitka palcami w rękawiczkach, odwracając sitko nad naczyniem do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm i przepuszczając 1 ml porcji pożywki konserwacyjnej (patrz Tabela 1) przez dno sitka 4X (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Sprawdź sitko pod kątem resztek fragmentów tkanek, które będą widoczne gołym okiem, i przepłucz sitko 1X więcej 1 ml pożywki konserwacyjnej, jeśli jakiekolwiek fragmenty nadal przylegają do sitka. Wypłukane fragmenty tkanek powinny być teraz wolne od komórek zrębu.</li>
	<li>Szybko zbadaj 60-milimetrową szalkę zawierającą fragmenty MG z kroku 2.9 protokołu pod odwróconym mikroskopem (obiektyw 4X lub 10X, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1F). Typowe przygotowanie ośmiu MG daje ~500 fragmentów. Poszukaj pojedynczych komórek lub kropelek tłuszczu i poszukaj komórek zanieczyszczających. 
	UWAGA: Jeśli znajdują się komórki zanieczyszczające, powtórzyć etap filtracji, zbierając pożywkę i fragmenty z naczynia o średnicy 60 mm za pomocą pipety o pojemności 5 ml i ponownie filtrując fragment przez świeże sitko o średnicy 70 μm, powtarzając kroki protokołu 2.6, 2.8-2.10.</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , pozwalając fragmentowi tkanki przylegać i generować dwuwarstwowe fragmenty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Jeśli fragmenty nie osiądną do 24 godzin, kontynuuj inkubację, aż do przylegania. Jeśli fragmenty nie przylegają dobrze, oddzielenie przedziałów komórek nie zadziała. Jeśli badacze obawiają się adhezji, płytki do hodowli tkankowej można poddać obróbce w celu pobudzenia przyczepiania fragmentów (np. poli-L-lizyny).</li>
</ol>
3. Dzień 3: Trypsyna różnicowa komórek nabłonka mięśniowego i luminalnego
<ol>
	<li>Aby oddzielić MyoEC od LEC, opróżnij pożywkę z naczynia, przepłucz 1x 1 ml DPBS i dodaj 1 ml świeżej trypsyny-EDTA (0,05%) i uważnie monitoruj trawienie pod mikroskopem odwróconym (obiektyw 10X lub 20X, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2B, C, F). Oderwanie zewnętrznej warstwy MyoEC będzie wymagało 3-6 minut, w zależności od siły trypsyny-EDTA (0,05%. 
	UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby zobaczyć reprezentatywne obrazy pokazujące ten proces. W jasnym polu oświetlonym, MyoEC wydają się zaokrąglone i mają jaśniejszy wygląd w porównaniu do LEC, które pozostają przylegające w środku i wydają się ciemniejsze.</li>
	<li>Zebrać frakcję MyoEC w 15 ml probówce zawierającej 2 ml 10% FBS/DPBS. Nie naruszając LECs, delikatnie przepłucz naczynie o średnicy 60 mm 2 ml DPBS, a następnie wyrzuć DPBS (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2H-I). 
	UWAGA: Typowy odzysk dla MyoEC mieści się w zakresie (3,5 x 10 6-1,5 x 106) w zależności od wielkości MG.</li>
	<li>Aby usunąć frakcję LEC, ponownie dodaj 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%) do naczynia i inkubuj 7-15 minut, uważnie monitorując, aby zapobiec nadmiernemu strawnieniu. Ugasić trypsynę-EDTA (0,05%) na talerzu za pomocą 2 ml 10% FBS/DPBS. Zbierz frakcję LEC do nowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Zwykły odzysk dla LEC mieści się w zakresie (2 x 10 6-4,2 x 106) w zależności od wielkości MG. Rutynowo czystość obu frakcji oznaczona za pomocą immunohistochemii wynosi ~90%19 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Odwirowywać każdą frakcję przez 5 minut przy 300 x g, aby usunąć trypsynę-EDTA (0,05%). Zawiesić osad w 250 μl pożywki konserwacyjnej i policzyć każdą populację komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Umieść komórki na lodzie podczas liczenia. 
	UWAGA: Jeśli pożądana jest manipulacja genetyczna frakcjami komórek, komórki pierwotne mogą być hodowane na szalkach o niskiej przyczepności i zakażone lentiwirusem20.</li>
</ol>
4. Dzień 3: Łączenie i osadzanie frakcji komórkowych w macierzy zewnątrzkomórkowej
UWAGA: Po zebraniu i zliczeniu frakcji MyoEC i LEC, można je połączyć. Typowy stosunek MyoEC/LEC wynosi 1:3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)19. Można przeprowadzić różne badania. Na przykład, aby przeprowadzić badania mozaiki, frakcje można wygenerować z myszy typu dzikiego (WT) i zmutowanego (Mut) oraz połączyć (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/MUT; Mut/WT; Mut/Mut)21, lub ułamki mogą być łączone przy użyciu różnych proporcji MyoECs/LECs19.
<ol>
	<li>Na podstawie liczby komórek oblicz liczbę studzienek (komora z 8 dołkami, patrz tabela materiałów), które należy przygotować na 12 000 komórek/studzienkę (np. 3 000 MyoEC: 9 000 LEC).</li>
	<li>Ustal warstwę bazową dla hodowli 3D, dodając 90 μl 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, bez czerwieni fenolowej - patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków, a studzienki są równomiernie pokryte. Aby zestalić warstwę podstawową, inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min. 
	UWAGA: ECM musi pozostać lodowaty do tego etapu, w przeciwnym razie ulegnie przedwczesnej polimeryzacji i doprowadzi do nierównej powłoki bazowej i polimeryzacji. Korzystanie z podstawowego ECM zwiększa wzrost organoidów w jednej płaszczyźnie, co pomaga w przechwytywaniu obrazu. Pozwala to również na szybszy wzrost organoidów i mniejsze zużycie ECM22.</li>
	<li>Podczas polimeryzacji przygotuj mieszanki komórek. Osadzaj frakcje MyoEC i LEC w 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś każdą frakcję komórkową w 10% pożywce ECM/90% wzrostu, tak aby każda studzienka miała 100 μl (patrz Tabela 1, aby dowiedzieć się, jak zrobić pożywkę wzrostową). 
	UWAGA: Dla ułatwienia przygotowania, powtórz studzienki przy użyciu tych samych mieszanek komórek. Można je łączyć i przygotowywać w jednej probówce (np. cztery studzienki tej samej mieszanki komórek można przygotować w 400 μl 10% ECM/90% pożywki wzrostowej).</li>
	<li>Dodać 100 μl każdej mieszanki komórek w 10% ECM/90% pożywce wzrostowej do każdej studzienki i pozostawić organoidy na 20 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki się usiądą, delikatnie dodaj 100 μl pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując ścianki komory każdej studzienki. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3A dla całkowitego składu każdej studzienki). 
	UWAGA: Inhibitor kinazy Rho, R-spondyna i Nrg1 to czynniki, które zostały zidentyfikowane jako ważne dla długoterminowej hodowli organoidów wyhodowanych zarówno z pierwotnych mysich komórek sutka, jak i ludzkich komórek raka piersi13,14. Ponadto czynniki komórek macierzystych B27 i N2 wydłużają czas, w którym organoidy mogą być hodowane.</li>
	<li>Obrazuj komórki co 24 godziny, aby śledzić ich wzrost i delikatnie odnawiaj pożywkę wzrostową co 2-3 dni przy użyciu 100 μL/studzienkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B-E). 
	UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas odnawiania podłoża. Przechyl szkiełka komory, aby zebrać pożywkę w jednym rogu studzienek. Usunąć ≤100 μl podłoża i ostrożnie uzupełnić, aby pozostawić warstwę ECM nienaruszoną.</li>
	<li>Jeśli badacze są zainteresowani badaniem laktacji/alweologenezy, przełącz się na pożywkę alweologenezy (patrz Tabela 1) w 5 dniu i kontynuuj odnawianie pożywki co 2-3 dni do dnia 10 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F) lub dłużej przez pasażowanie przy użyciu roztworu regeneracyjnego (patrz Tabela materiałów)13. 
UWAGA: W tym momencie organoidy można wyizolować z ECM poprzez inkubację w temperaturze 4 °C w 400 μl roztworu odzysku o temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o protokole i odczynniku).</li>
</ol>
5. Dzień 5 lub 10: Utrwalanie i barwienie immunologiczne organoidów
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń pożywkę, delikatnie pipetując pożywkę (najlepiej sprawdza się pipeta z gruszką). Wypłucz każdą studzienkę za pomocą 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS, patrz przepisy).</li>
	<li>Utrwalić organoidy za pomocą zimnego (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA, patrz przepisy) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: PFA jest niebezpieczny. Nosić środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne). Ten krok należy wykonać wewnątrz dygestorium. 
	UWAGA: ECM jest rozpuszczany przez obróbkę PFA. Niepełne usunięcie ECM może prowadzić do barwienia tła, gdy organoidy są analizowane za pomocą immunofluorescencji.</li>
	<li>Usunąć 4% PFA i dodać 200 μl 0,2% (w/v) glicyny/DPBS (patrz Tabela 1) do każdego dołka. Szkiełka należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub 4 °C przez noc na kołyszącej się powierzchni ustawionej na wolne ustawienie. 
	UWAGA: Organoidy można przechowywać przez 1-3 dni w DPBS w temperaturze 4 °C przed następnym etapem.</li>
	<li>Przepuszczalność organoidów za pomocą DPBS + 0,25% Triton X-100 (PBST, patrz Tabela 1) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj organoidy za pomocą 5% surowicy osła (DS) (lub innej surowicy pasującej do gatunku przeciwciała drugorzędowego) w DPBS przez 1 godzinę na kołyszącej się powierzchni. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać przez noc w temperaturze 4 °C na kołyszącej się powierzchni.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w 1% DS/DPBS. Użyj 125-200 μl na każdą studzienkę. Barwienie immunologiczne należy przeprowadzić przez inkubację organoidów w przeciwciałie pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na kołyszącej się powierzchni.</li>
</ol>
6. Dzień 11: Pełna immunofluorescencja
<ol>
	<li>Przemyj każdą studzienkę 2X 200 μL PBST przez 5 minut. Dodaj przeciwciało wtórne w 1% DS/DPBS, używając 125-200 μL dla każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej na kołyszącej się powierzchni przez 45 minut.</li>
	<li>Przemyj każdą studzienkę 2X przy użyciu 200 μL PBST na studzienkę.</li>
	<li>Wybarwić jądra za pomocą barwnika DNA Hoechst w DPBS (1:2 000 w DPBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń cały płyn pozostały na studzience, delikatnie odsysając próżnię.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij komory i uszczelkę, umieść jedną kroplę (~30 μL) podłoża montażowego (patrz Tabela Materiałów) na każdym dołku i szkiełku nakrywkowym, uważając, aby usunąć pęcherzyki. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia w ciemnym miejscu na 1-2 dni. Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Zobrazuj organoidy pod mikroskopem konfokalnym (<silna klasa="xfig">Ryc. 3E-F).</li>
</ol>

<ol><li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands%3A+a+serial+transplantation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li>
<li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIp%2C+MM+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research</a>. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. (2000).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li>
<li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li>
<li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata%3A+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li>
<li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression%3A+is+structure+the+message%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li>
<li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+and+Neuregulin1%2FErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207(2016).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li>
<li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li>
<li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li>
<li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179(2015).</li>
<li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLIT%2FROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li>
<li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079(2019).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661(2011).</li>
<li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).</li>
<li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li>
<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiono metodę szczegółowo opisującą, w jaki sposób naukowcy mogą generować hodowle organoidów 3D przy użyciu pierwotnych komórek MG. Różnica między tym a innymi protokołami polega na tym, że szczegółowo opisujemy metodę oddzielania dwóch, odrębnych przedziałów komórek MG: zewnętrznych podstawowych MyoEC i wewnętrznych LEC. Nasza metoda wykorzystuje dwuetapowe leczenie trypsyną-EDTA (0,05%), które nazywamy trypsynizacją różnicową19. Procedura ta pozwala naukowcom na izolację My...

Gruczoł sutkowy (MG) to drzewiasta, rurkowata struktura nabłonkowa osadzona w zrębie bogatym w adipocyty. Dwuwarstwowy nabłonek przewodowy składa się z zewnętrznej, podstawowej warstwy kurczliwych komórek mioepitelialnych (MyoECs) i wewnętrznej warstwy luminalnych, wydzielniczych komórek nabłonkowych (LEC), otaczających centralny lumen1. W okresie laktacji, gdy zewnętrzne MyoEC kurczą się, aby wycisnąć mleko z wewnętrznych pęcherzyków płucnych, MG ulega licznym zmianom, które są pod kontrolą czynników wzrostu (np. EGF i FGF) i hormonów (np. progesteronu, insuliny i prolaktyny). Zmiany te powodują różnicowanie wyspecjalizowanych struktur, pęcherzyków płucnych, które syntetyzują i wydzielają mleko w czasie laktacji1. Nabłonkiem sutka można eksperymentalnie manipulować za pomocą technik, w których fragmenty tkanki nabłonkowej, komórki, a nawet pojedyncza komórka podstawna są przeszczepiane do poduszeczek tłuszczowych sutka gospodarza, wstępnie oczyszczane z endogennego miąższu sutka i pozostawiane do wyrośnięcia, aby odtworzyć całe, funkcjonalne drzewo nabłonkowe2,3,4,5. Przeszczep jest potężną techniką, ale jest czasochłonny i niemożliwy, jeśli mutacja powoduje wczesną śmiertelność zarodka (przed E14), która uniemożliwia uratowanie przeszczepialnej brodawki sutka. Co więcej, badacze często chcą zbadać role dwóch różnych przedziałów, które pochodzą z komórek progenitorowych ograniczonych do linii. Chociaż technologia Cre-lox umożliwia różnicową manipulację genetyczną MyoEC i LEC, jest to również czasochłonne i kosztowne przedsięwzięcie. Tak więc od lat pięćdziesiątych XX wieku badacze stosowali organoidy sutka in vitro jako stosunkowo łatwy i skuteczny sposób rozwiązywania problemów dotyczących struktury i funkcji tkanek sutka6,7.
We wczesnych protokołach opisujących izolację i hodowlę pierwotnych komórek nabłonka sutka, badacze odkryli, że matryca błony podstawnej (BME), złożona z skrzepu osocza i ekstraktu z zarodka kurczaka, była wymagana dla fragmentów MG hodowanych na szalce6. W kolejnych dekadach opracowano macierze zewnątrzkomórkowe (ECM, kolagen i galaretowatą matrycę białkową wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm) w celu ułatwienia hodowli 3D i lepszego naśladowania środowiska in vivo7,8,9,10. Hodowla komórek w matrycach 3D ujawniła na podstawie wielu kryteriów (morfologia, ekspresja genów i reakcja hormonów), że takie mikrośrodowisko lepiej modeluje procesy fizjologiczne in vivo9,10,11,12. Badania z wykorzystaniem pierwotnych komórek mysich zidentyfikowały kluczowe czynniki wzrostu i morfogeny niezbędne do przedłużonego utrzymania i różnicowania organoidów13. Badania te przygotowały grunt pod przedstawiony tutaj protokół oraz dla hodowli ludzkich komórek piersi jako organoidów 3D, która jest obecnie nowoczesnym narzędziem klinicznym, pozwalającym na odkrywanie leków i testowanie leków na próbkach od pacjentów14. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla organoidów podkreśla zdolności komórek pierwotnych do samoorganizacji oraz ich wkład w morfogenezę i różnicowanie.
Prezentowany tutaj jest protokół hodowli nabłonka mysiego, który można podzielić na acini produkujące mleko. Technika trypsynizacji różnicowej jest stosowana do izolowania MyoEC i LEC, które składają się na dwa odrębne przedziały komórek MG. Te oddzielone frakcje komórkowe mogą być następnie genetycznie manipulowane w celu nadekspresji lub obniżenia funkcji genu. Ponieważ samoorganizacja jest wrodzoną właściwością komórek nabłonka sutkowego15,16,17, rekombinacja tych frakcji komórek pozwala badaczom na generowanie dwuwarstwowych, mozaikowych organoidów. Zaczynamy od enzymatycznego trawienia tkanki tłuszczowej, a następnie inkubacji fragmentów sutka na szalce do hodowli tkankowej przez 24 godziny (ryc. 1). Fragmenty tkanek osadzają się na płytkach polistyrenowych jako dwuwarstwowe fragmenty z ich organizacją in vivo: zewnętrzna warstwa mioepitelialna otaczająca wewnętrzne warstwy światła. Ta organizacja komórkowa pozwala na izolację zewnętrznych MyoEC przez leczenie trypsyną-EDTA (0,05%) przez 3-6 minut, a następnie drugą rundę leczenia trypsyną-EDTA (0,05%), która odłącza pozostałe wewnętrzne LEC (Figura 2). W ten sposób te typy komórek o różnej wrażliwości trypsyny są izolowane, a następnie mogą być mieszane i siane w ECM (ryc. 3). Komórki ulegają samoorganizacji, tworząc dwuwarstwowe kule, składające się z zewnętrznej warstwy MyoEC otaczających wewnętrzne LEC. Tworzenie się światła zachodzi, gdy komórki rosną w pożywce zawierającej koktajl czynników wzrostu (zobacz przepisy na pożywkę wzrostową)13. Po 5 dniach organoidy można różnicować w acini produkujące mleko, przechodząc na pożywkę alweorologenezy (patrz przepisy i rysunek 3F) i inkubować przez kolejne 5 dni. Alternatywnie, organoidy będą nadal się rozwijać i rozgałęziać w pożywce wzrostowej przez co najmniej 10 dni. Organoidy mogą być analizowane za pomocą immunofluorescencji (ryc. 3D-F) lub uwalniane z ECM za pomocą roztworu odzysku (patrz tabela materiałów) i analizowane innymi metodami (np. immunoblot, RT-qPCR).

<table><tbody><tr><td>15 ml polipropylenowa probówka stożkowa o wysokiej przejrzystości (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka mocująca o bardzo niskiej temperaturze (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka stożkowa z polipropylenu o wysokiej przejrzystości (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>60 mm naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; M nylonowe sitko do komórek (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep działa również</td></tr><tr><td>suplement B27 bez witaminy A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B6 ACTb-EGFP</td><td>myszy The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Strzykawka insulinowa 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Klasa 2 Dyspaza (Roche)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Klasa 3 Kolagenaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Recovery Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>354253</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkowania &ndash; Ekstrakcja struktur trójwymiarowych z Corning Matrigel Matrix</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-dołkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Maksametazon</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNaza (dezoksyrybonukleaza I)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21447</td><td>Stosować w 1:500, Partia: 1608641, zapas 2 mg / mL, RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>Osioł anty-Myszy 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>Użyj w 1:1000, Partia: 140554, zapas 1,4 mg / ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>Bez Mg2+/Ca2+</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu VWR</td><td>97068&ndash; 085</td><td>100% Pochodzenie z USA, klasa premium, Partia: 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>Określany jako nośnik montażowy w tekście</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>Użyj w 1:250, partia: J1011, zapas 200 i mikro; g / mL, RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>Użyj 1:2000, stan magazynowy to 20mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash; CreERtam</td><td>, The Jackson Laboratory</td>, <td>5107</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR); Bez czerwieni fenolowej; 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>Partia: 8204010, stężenie standardowe 8,9 mg/ml</td></tr><tr><td>MillexGV Jednostka filtrująca 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE 8-dołkowe szkło, sterylne</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>Te szkiełka komorowe świetnie nadają się do usuwania uszczelek, ale dobrze mogą działać inne marki (np. Lab Tek II).</td></tr><tr><td>Mysz anty-SMA</td><td>Millipore</td><td>Sigma A2547</td><td>Użyj w 1:500, Lot: 128M4881V, zapas 5,2 mg / mL, RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl Fisher</td><td>Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R& D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr><td>Krajowy program hormonów i peptydów</td><td>prolaktyny przysadki owczej</td><td>zakupiony od dr Parlowa w Instytucie Badań i Edukacji Harbor-UCLA</td>Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3 Pentobarbital Millipore Sigma P3761 R26R-EYFP Laboratorium Jacksona 6148 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor Rho Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondyna</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtrowane serum osła</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtrowane serum osła</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td>Trypsyna klasy laboratoryjnej</td></tr><tr><td>EDTA 0,05%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoidy oferują samoorganizujące się, trójwymiarowe struktury tkankowe, które podsumowują procesy fizjologiczne w wygodny sposób potrawy. Mysi gruczoł sutkowy składa się z dwóch odrębnych przedziałów komórek nabłonkowych, pełniących różne funkcje: zewnętrznego, kurczliwego przedziału mioepitelialnego i wewnętrznego, wydzielniczego przedziału świetlnego. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której komórki tworzące te przedziały są izolowane, a następnie łączone w celu zbadania ich indywidualnego wkładu w morfogenezę i różnicowanie gruczołu sutkowego. Metoda jest prosta i wydajna i nie wymaga zaawansowanych technologii separacji, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Zamiast tego zbieramy i enzymatycznie trawimy tkankę, wysiewamy nabłonek na przylegających szalkach do hodowli tkankowych, a następnie stosujemy trypsynizację różnicową, aby oddzielić komórki mioepitelialne od komórek luminalnych o czystości ~90%. Komórki są następnie siane w macierzy zewnątrzkomórkowej, gdzie organizują się w dwuwarstwowe, trójwymiarowe (3D) organoidy, które można różnicować w celu wytworzenia mleka po 10 dniach w hodowli. Aby przetestować efekty mutacji genetycznych, komórki mogą być zbierane z dzikich lub genetycznie modyfikowanych modeli myszy, lub mogą być genetycznie manipulowane przed hodowlą 3D. Technika ta może być wykorzystana do generowania organoidów mozaikowych, które umożliwiają badanie funkcji genów w szczególności w przedziale luminalnym lub mioepitelialnym.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania specyficznych wkładów linii komórkowych komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z wykorzystaniem organoidów mozaikowych. Aby uzyskać pierwotne komórki mysie do hodowli organoidów, należy najpierw wyizolować nabłonek gruczołu mlekowego z otaczającego go zrębu bogatego w adipocyty (Rysunek 1). Proces ten został tutaj krótko opisany, a szczegóły znajdują się w wcześniej opublikowanej pracy18</...

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Nasza metoda jest znacząca, ponieważ pozwala naukowcom izolować i manipulować różnymi typami komórek w celu zbadania ich indywidualnego wkładu w formę i funkcję tkanki. Technika ta jest delikatną i wydajną metodą oddzielania typów komórek, w wyniku czego integralność komórek jest zachowana w hodowli 3D. Technika ta może być również stosowana w innych systemach do izolowania komórek, które nie mają dobrze scharakteryzowanych biomarkerów.Aby zebrać gruczoły sutkowe numer dwa, trzy, cztery i pięć od 10 do 14-tygodniowej samicy myszy, najpierw wykonaj jednocentymetrowe nacięcie na linii środkowej między dwiema tylnymi kończynami. Rozciągnij cięcie aż do szyi i wykonaj małe boczne nacięcia od nacięcia w linii środkowej w kierunku kończyn. Następnie rozciągnij nauczoną skórę przed zabezpieczeniem jej szpilką z każdej strony zwierzęcia.Za pomocą kleszczy zbierz węzły chłonne z gruczołów numer cztery. Aby usunąć gruczoły sutkowe, użyj ostrych nożyczek, aby przeciąć każdy obszar tkanki, umieszczając tkanki w 50 mililitrach o temperaturze czterech stopni Celsjusza DMEM-F12 uzupełnionej 5% FBS i antybiotykiem przeciwgrzybiczym podczas ich zbierania. Po zebraniu wszystkich tkanek posiekaj gruc

generation-of-mosaic-mammary-organoids-by-differential-trypsinization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Dostępność somatycznych SC jest kluczowa dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i uzyskania wglądu we właściwości SC. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne strategie przeprogramowania, in vitro, zróżnicowanych dorosłych komórek w odpowiadające im ekspandowalne tkankowo specyficzne komórki macierzyste / progenitorowe poprzez przejściową ekspresję pojedynczego koaktywatora transkrypcji YAP.

De Novo Generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą YAP/TAZ

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Poznaj metodę izolacji komórek mięśniowych i nabłonkowych gruczołu mlekowego myszy poprzez różnicową trypsynizację. Technika umożliwia wytwarzanie trójwymiarowych organoidów do badań biologii tkanek.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Przeglądaj więcej filmów