Kwantyfikacja oporności na antybiotyki za pośrednictwem plazmidu w podejściu ewolucji eksperymentalnej

Plazmidy to elementy pozachromosomalne, które są wszechobecne w większości gatunków bakterii i siedlisk, gdzie są bardzo ważnymi czynnikami bocznego transferu genów, ponieważ mogą migrować między komórkami i między populacjami. Jednym z najbardziej uderzających i wybitnych przykładów takiego transferu jest rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki, które są kodowane w plazmidach. Aby zbudować modelowy plazmid, który koduje gen oporności na antybiotyki, wybierz szkielet plazmidu i PCR amplifikuj szkielet za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i starterów, które wiążą się na matrycy plazmidu. W naszym przypadku użyliśmy szkieletu plazmidu pBBR1. Następnie amplifikuj gen oporności nptII, w tym natywny promotor Tn5, za pomocą polimerazy o wysokiej wierności. Zaprojektuj startery dla genu oporności z około 20 parami zasad o komplementarności sekwencji ze szkieletem plazmidu. Po PCR połącz region homologii oczyszczonego produktu PCR z oczyszczonym szkieletem plazmidu za pomocą montażu izotermicznego w temperaturze 50 stopni przez 60 minut. Przekształć stopiony produkt w E.Coli DH5-Alpha za pomocą elektroporacji. Rozłóż 100 mikrolitrów mieszaniny na selektywnych podłożach i inkubuj w temperaturze 37 stopni przez około 24 godziny. Plazmid można następnie wyekstrahować, zwalidować i przekształcić w szczep E.coli typu dzikiego MG1655. W ten sposób powstaje szczep MG1655 pCON.Podczas ekspozycji na antybiotyk bakterie potrzebują plazmidu, aby przeżyć. W ten sposób plazmid jest poddawany selekcji pozytywnej. W warunkach nieselektywnych, a więc bez antybiotyków, plazmid jest jednorazowy dla komórki. Celem naszego badania było obserwowanie plazmidów w takich nieselektywnych warunkach w czasie. W tym celu wyposażyliśmy małe plazmidy w gen oporności na antybiotyki i wprowadziliśmy go do Escherichia coli. Przeprowadziliśmy eksperyment ewolucyjny i monitorowaliśmy częstotliwość plazmidów poprzez posiewanie replik. Szczep przenoszący plazmid mg1655 pCON został teraz wprowadzony do eksperymentu ewolucyjnego. Najpierw umieść mg1655 pCON na płytkach agarowych LB uzupełnionych antybiotykami i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni. Z tej płytki losowo wybierz 8 kolonii przodków i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni z ciągłym wstrząsaniem. Następnego dnia populacje są przenoszone do eksperymentu, który jest prowadzony w 96 płytkach studzienkowych. Bardzo ważne jest, aby losowo rozmieścić kontrpróby na płytce. Na przykład w podejściu szachownicy. W naszym eksperymencie kultury są rozcieńczane i przenoszone z różnymi szybkościami rozcieńczania i w dwóch temperaturach. Podczas każdego transferu stosuje się rozcieńczanie, a transfer szeregowy jest powtarzany w sumie przez 98 transferów. W trakcie eksperymentu ewolucyjnego częstość występowania plazmidów w populacji jest szacowana na podstawie proporcji komórek przenoszących plazmid. Repliki galwaniczne zostały spopularyzowane przez Esther i Joshuę Lederbergów w latach 50. XX wieku, gdzie używali ich do badania lekooporności bakterii. Metoda ta umożliwi im zwiększenie skali skanowania w poszukiwaniu fenotypów, a pod koniec badania ujawniła, że oporność na penicylinę może powstać u bakterii z powodu spontanicznych mutacji w genomie. Aby określić częstość występowania plazmidu w populacji podczas eksperymentu, stacjonarne kultury są seryjnie rozcieńczane i posiewane na nieselektywnych płytkach agarowych LB. Dostosuj rozcieńczenie zgodnie z wydajnością od 250 do 500 kolonii na płytkę. Posiewane populacje są inkubowane w celu wzrostu przez noc w temperaturze 37 stopni przez mniej niż 24 godziny. Kolonie najlepiej się replikują, gdy są jeszcze małe. Po nocnym wzroście policz wszystkie rodziny za pomocą automatycznego licznika kolonii wybranego przez czytelnika. W ten sposób uzyskuje się całkowitą wielkość populacji bakterii w kulturach. Należy pamiętać, że kolonie na krawędzi płytki należy pominąć. Aby odtworzyć płytki, potrzebne są selektywne płytki agarowe uzupełnione antybiotykami, okrągły blok, metalowy pierścień pasujący do bloku i sterylna aksamitna szmatka. Tkanina musi być w 100% bawełniana, ponieważ można ją sterylizować w autoklawie. Umieść szmatkę na bloku i przymocuj ją metalowym pierścieniem. Ostrożnie umieść talerz z policzonymi koloniami na zamocowanej powierzchni aksamitnej tkaniny. Postukaj w talerz okrężnymi ruchami, tak aby cała powierzchnia talerza dotykała tkaniny. Bardzo ważne jest, aby wszystkie kolonie dotykały aksamitu. Zdejmij płytkę LB i umieść płytkę selektywną na aksamicie. Powtórz ostrożne stukanie. Ponownie ważne jest, aby talerz całkowicie dotykał aksamitu. Następnie usuń płytkę selektywną. Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia do oceny potrzebna jest zarówno LB, jak i tabliczka z antybiotykami. Umieść talerze jedna nad drugą i porównaj wzrost. Możesz łatwo dostrzec przestrzenie wolne od kolonii. Są to kolonie, które nie są oporne na antybiotyki. W ten sposób kolonie te utraciły plazmid. Na koniec zaznacz, ile kolonii brakuje na tabliczce z antybiotykami. Ta liczba daje utratę plazmidu. Powtarzaj co tydzień posiewanie replik wszystkich populacji podczas eksperymentu ewolucyjnego. Utrata plazmidu może być spowodowana wieloma wadami rozwojowymi plazmidu. Podczas pracy nad konstrukcją plazmidu, powiedzmy, dla ekspresji danego genu w preferowanym szczepie gospodarza, natywne zachowanie plazmidu in vivo w odniesieniu do potwierdzenia, jakie stan może przyjąć, jest zwykle czymś, co jest pomijane. Jednak w kontekście ewolucyjnym takie potwierdzenie zmian może mieć bardzo duże znaczenie. Analiza potwierdzeń plazmidowych może być bardzo trudnym przedsięwzięciem. Szczególnie multimery plazmidowe są trudne do analizy, ponieważ nie można ich prawidłowo zidentyfikować za pomocą PCR lub sekwencjonowania. Z drugiej strony, multimery plazmidowe są trudne do analizy za pomocą elektroforezy żelowej ze względu na ich potencjalnie duże rozmiary i powolną ruchliwość elektroforetyczną. Nasz protokół oferuje prostą i nieskomplikowaną metodę badania przesiewowego i identyfikacji multimerów plazmidowych w każdym preparacie plazmidowym. Aby uwidocznić cząsteczki plazmidu, wyekstrahuj plazmid z 5 ml stacjonarnej hodowli komórkowej przez noc za pomocą lizy alkalicznej. Ekstrakcja plazmidów o niskiej kopii plazmidów często prowadzi do zanieczyszczenia chromosomalnym DNA gospodarza, które musi zostać strawione przed wizualizacją. Aby usunąć zanieczyszczenie chromosomalnym DNA, należy potraktować wyekstrahowane plazmidowe DNA za pomocą Plasmid-Safe