Name: Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych. Protokół zapobiega przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu i zapewnia ciągłą dostawność komórek z jednego dawcy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Noémie Gallorini za pomoc podczas przygotowania <silnej klasy="xfig">Rysunek 7. Prace te zostały wsparte grantem projektowym przyznanym DH przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (Project Grant 1099922) oraz dodatkowym finansowaniem otrzymanym od Queensland Eye Institute Foundation.

Ludzkie rogówki za zgodą dawcy do badań zostały uzyskane z Queensland Eye Bank i użyte za zgodą etyczną Komitetu Etyki Badań Naukowych Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Rogówki owiec zostały pozyskane od zwierząt poddanych eutanazji w Herston Medical Research Facility na Uniwersytecie Queensland w ramach umowy o podziale tkanek.
1. Przygotowanie narzędzi do preparacji
<ol>
	<li>Wysterylizuj dwie pary kleszczyków zegarmistrzowskich numer 4, mocząc je w roztworze 70% etanolu przez 5 minut lub autoklawując.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża hodowlanego i płytek do hodowli tkankowych
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml pożywki hodowlanej zawierającej Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% płodowej surowicy bydlęcej i 100 U/ml Pen/Strep. Ta pożywka hodowlana jest odpowiednia dla hodowli komórek śródbłonka rogówki owiec, jednak w przypadku hodowli ludzkich komórek śródbłonka rogówki pożywkę należy uzupełnić 50 μg/ml ekstraktu przysadki bydlęcej, 0,08% siarczanu chondroityny, 200 μg/ml chlorku wapnia i 0,3 mM 2-fosforanu L-askorbinowego. Pożywkę hodowlaną można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie.</li>
	<li>Pokryj studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej współczynnikiem przyłączenia zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do każdej powlekanej studzienki. Przygotuj jedną studzienkę na każdą rogówkę.</li>
</ol>
3. Sekcja eksplantacji i procedura hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Umieść rogówkę, śródbłonkiem do góry, na sterylnej szalce Petriego na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Dostosuj oświetlenie tak, aby powierzchnia rogówki była dobrze oświetlona z wystarczającym kontrastem, aby uwydatnić warstwę śródbłonka. Dostosuj powiększenie tak, aby krawędź i część środkowego śródbłonka rogówki były widoczne.</li>
	<li>Użyj wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich, aby delikatnie podnieść i oderwać błonę Descemeta od leżącego poniżej zrębu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Membrana odczepia się od zrębu jako pasek, który natychmiast się zwija. Umieść pasek w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, która została pokryta czynnikiem przyłączającym i zawiera 1 ml pożywki hodowlanej. Pokrywka płytki do hodowli tkankowej powinna być założona przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy dodaje się do niej eksplantaty, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.</li>
	<li>Najpierw usuń paski błony Descemeta ze skrajnego obrzeża śródbłonka, a następnie z obszarów centralnych. Umieść wszystkie paski z jednej rogówki w jednym dołku w 6-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować eksplantaty w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych przy temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C. Pozostawić kulturę w spokoju przez 2 dni, aby eksplantaty mogły się osiąść i przymocować do powierzchni płytki. Zazwyczaj do jednej trzeciej eksplantatów nie udaje się przymocować do płytki.</li>
	<li>Po 4 dniach usuń pożywkę i wszelkie nieprzyłączone eksplantaty z kultury i delikatnie dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej, uważając, aby nie naruszyć dołączonych eksplantatów. Pożywkę hodowlaną należy zmieniać dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
4. Ciągła produkcja komórek śródbłonka rogówki poprzez seryjną hodowlę eksplantatów
UWAGA: Eksplantaty mogą być przeniesione na świeże płytki hodowli tkankowych po 10 dniach, aby stworzyć dodatkowe hodowle komórek śródbłonka rogówki.
<ol>
	<li>Umieść kulturę eksplantatów na stoliku mikroskopu preparacyjnego i dostosuj oświetlenie i powiększenie tak, aby eksplantaty były widoczne.</li>
	<li>Używając wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich, delikatnie zerwij każdy eksplant z płytki hodowlanej i przenieś go do świeżej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, która została pokryta współczynnikiem przyłączenia i zawiera 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Pozwól eksplantatom osiąść na powierzchni nowej płytki przez 4 dni przed zastąpieniem pożywki hodowlanej 2 ml świeżej pożywki hodowlanej. Zmieniaj pożywkę zmienianą dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
5. Hodowla komórek śródbłonka rogówki na szklanych szkiełkach nakrywkowych do analiz immunofluorescencyjnych
UWAGA: Hodowle komórkowe, które są przeznaczone do analizy za pomocą immunofluorescencji, powinny być zakładane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, które mogą być zamontowane na szklanych szkiełkach mikroskopowych po procedurze barwienia.
<ol>
	<li>Wysterylizuj paczkę okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 13 mm w autoklawie lub mocząc w 70% etanolu przez 15 minut, a następnie trzykrotnie przepłucz w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Umieść pojedyncze szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, pokryj je współczynnikiem przyłączenia, a następnie dodaj 0,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich usuń eksplantaty z ich płytek hodowlanych i przenieś je do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe. Pozwól eksplantatom osiąść na szkiełkach nakrywkowych przez 4 dni przed zmianą podłoża.</li>
	<li>Po wymaganym okresie inkubacji utrwalić i wybarwić kultury szkiełek nakrywkowych w ich studzienkach hodowlanych. Zamontuj poplamione szkiełka nakrywkowe na szklanych szkiełkach mikroskopowych w celu analizy pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
6. Subkultura komórek śródbłonka rogówki za pomocą Dispase II
UWAGA: Duże komórki fibroblastyczne mogą być selektywnie usuwane z kultur eksplantacji na płytkach 6-dołkowych przed subkulturacją przy użyciu tej procedury. Jeśli wszystkie komórki mają być podhodowlane, nie należy wykonywać kroków od 6.2 do 6.4. Celem tej procedury jest przeniesienie komórek na świeże płytki przy jednoczesnym zachowaniu ich kontaktów międzykomórkowych w jak największym stopniu. Z komórkami należy obchodzić się delikatnie. Studzienki całkowicie zlewające się powinny być przepuszczane w stosunku 1:2, podczas gdy studnie subkonfluentne powinny być przepuszczane w stosunku 1:1 lub mniejszym.
<ol>
	<li>Usuń pożywkę z kultury i krótko spłucz DPBS.</li>
	<li>Dodaj 1 ml Versene. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s.</li>
	<li>Usuń Versene i dodaj 1 ml TrypLE. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 3 minuty.</li>
	<li>Obserwuj kulturę za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Delikatnie postukaj w kulturę, aby usunąć komórki z płytki. Jak tylko duże komórki fibroblastyczne oderwą się od płytki, usuń je i TrypLE za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zmyj resztki TrypLE z pozostałych komórek, spłukując dwukrotnie 2 ml DPBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 mg/ml leku Dispaza II do kultury i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 do 2 godzin lub do momentu, gdy wszystkie komórki oderwą się od płytki. Komórki powinny stopniowo odchodzić od płytki w kępkach.</li>
	<li>Zebrać komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przenieść do 20 ml DPBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy przez rozcieranie pipetą o pojemności 1 ml w 1 ml pożywki hodowlanej. Przenieść zawiesinę komórek do jednego lub dwóch dołków na płytce 6-dołkowej, do przejścia w stosunku odpowiednio 1:1 lub 1:2.</li>
	<li>Uzupełnić pożywkę w każdym dołku, aby uzyskać 2 ml i umieścić kultury w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zastąp pożywkę 2 ml świeżej pożywki dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
7. Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki na błonach biomateriału
UWAGA: Poniższa procedura opisuje kroki związane z montażem błoniastego biomateriału w specjalnie przygotowanym urządzeniu montażowym - zwanym mikrokomorą Boydena - do hodowli komórek. Zapoznaj się z naszą najnowszą publikacją6, aby uzyskać więcej informacji na temat urządzenia i szczegółów zakupu.
<ol>
	<li>Zamontuj górną komorę komory mikro-Boydena, umieszczając czerwony O-ring w jej środku.</li>
	<li>Użyj trepanacji o średnicy 18 mm, aby wyciąć krążek z arkusza biomateriału na desce do krojenia z politetrafluoroetylenu (PTFE). Umieść ten dysk na czerwonym O-ringu w górnej komorze komory mikro-Boydena.</li>
	<li>Przykręć dolną komorę do górnej komory, zabezpieczając krążek z biomateriału pomiędzy nimi.</li>
	<li>Namocz zmontowaną komorę mikro-Boydena w 70% etanolu na 1 godzinę, aby ją wysterylizować.</li>
	<li>Całkowicie zanurz zmontowaną komorę micro-Boydena w sterylnym HBSS na 10 minut, aby usunąć etanol. Powtórz ten krok prania dwukrotnie. Wykonać ostatni etap płukania przez 10 minut w nieuzupełnionej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Przenieś wysterylizowaną komorę mikro-Boydena na pożywkę hodowlaną w dołku 6-dołkowej płytki, upewniając się, że górna komora znajduje się najwyżej. Dostosuj poziom pożywki hodowlanej tak, aby stykała się z dolną powierzchnią błony biomateriału, ale nie wpływała do górnej komory.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek śródbłonka rogówki, stosując procedurę opisaną w punkcie 6. Gęstość komórek w zawiesinie powinna być osiągnięta, aby umożliwić gęstość wysiewu co najmniej 100 000 komórek nacm2 na membranie w komorze mikro-Boydena. Powierzchnia hodowli w komorze mikro-Boydena wynosi 0,5cm2 i może pomieścić objętość 100 μl. Dlatego należy przygotować zawiesinę zawierającą 500 000 komórek/ml.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek (50 000 komórek) na membranę w komorze mikro-Boydena. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 4 godziny, a następnie uzupełnić pożywkę, aby całkowicie zanurzyć komorę. Inkubuj kulturę przez wymagany okres czasu, wymieniając pożywkę dwa razy w tygodniu. 
	UWAGA: Gdy komórki śródbłonka rogówki przyczepią się do górnej powierzchni błony biomateriału, komorę mikro-Boydena można odwrócić w dołku hodowli, tak aby dolna komora znalazła się najwyżej. Następnie do komory można dodać więcej komórek, aby zainicjować hodowle komórkowe na drugiej powierzchni błony. Na przykład komórki zrębu rogówki można łatwo zastosować do alternatywnej powierzchni, naśladując w ten sposób względną lokalizację typów komórek rogówki, jak widać w tylnej części rogówki.</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+issues+for+human+corneal+endothelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regnerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).</li>
<li>Senoo, T., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle+Kinetics+in+Corneal+Endothelium+from+Old+and+Young+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).</li>
<li>Harkin, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+Biomaterials+for+Use+in+Ophthalmic+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies.</a> Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istotnym wyzwaniem technicznym związanym z tworzeniem i namnażaniem ludzkich komórek śródbłonka rogówki jest zapobieganie występowaniu EMT w hodowlach. EMT może być wyzwalany w komórkach śródbłonka rogówki przez utratę kontaktu między komórkami, jednak większość protokołów hodowli komórkowych dla tych komórek obejmuje dysocjację enzymatyczną do pojedynczych komórek podczas izolacji i subhodowli10. W tym miejscu przedstawiamy alternatywny protokół hodowli komórkowych komórek śródbłonka rogówki, któ...

Rogówka to przezroczysta tkanka, która znajduje się z przodu oka. Składa się z trzech głównych warstw: warstwy nabłonkowej na zewnętrznej powierzchni, środkowej warstwy zrębu i warstwy wewnętrznej zwanej śródbłonkiem rogówki. Śródbłonek rogówki jest monowarstwą komórek, która znajduje się na błonie podstawnej zwanej błoną Descemeta i utrzymuje przezroczystość rogówki poprzez regulację ilości płynu, który dostaje się do zrębu z leżącej poniżej cieczy wodnistej. Zbyt duża ilość płynu w zrębie powoduje obrzęk rogówki, zmętnienie i utratę wzroku. Śródbłonek jest zatem niezbędny do utrzymania wzroku.
Śródbłonek rogówki może stać się dysfunkcyjny z wielu powodów, w tym starzenia się, chorób i urazów, a jedynym obecnym sposobem leczenia jest operacja przeszczepu. Podczas tej operacji śródbłonek i błona Descemeta są usuwane z rogówki pacjenta i zastępowane przeszczepem śródbłonka i błoną Descemeta uzyskaną z rogówki dawcy. Wiele przeszczepów śródbłonka zawiera również cienką warstwę tkanki zrębu, która ułatwia przenoszenie i przyczepianie do rogówki gospodarza1.
Na całym świecie zapotrzebowanie na tkanki dawcy rogówki do operacji transplantacyjnych jest większe niż ilość, którą mogą dostarczyć banki oczu2. W związku z tym podjęto działania mające na celu opracowanie przeszczepów śródbłonka rogówki metodą inżynierii tkankowej, które mogłyby być wykorzystane do zniwelowania tego niedoboru3. Uzasadnieniem tego jest fakt, że obecnie śródbłonek z pojedynczej rogówki może być przeniesiony tylko do jednego pacjenta, jednak jeśli komórki śródbłonka rogówki zostaną najpierw namnażone i wyhodowane na rusztowaniach biomateriałowych w hodowli tkankowej, mogą być stosowane w leczeniu wielu pacjentów.
Główne wyzwania, które muszą zostać rozwiązane, zanim przeszczepy śródbłonka rogówki za pomocą inżynierii tkankowej staną się realną opcją dla chirurgów, obejmują: (1) ustanowienie technik rozszerzania komórek śródbłonka rogówki o wysokiej jakości oraz wytwarzania dojrzałych i funkcjonalnych warstw komórek śródbłonka rogówki in vitro, oraz (2) ustanowienie technik hodowli komórek na rusztowaniach z biomateriału w celu wytworzenia przeszczepów inżynierii tkankowej, które są równe, lub lepiej niż obecnie stosowane przeszczepy pochodzące z rogówki dawcy.
Komórki śródbłonka rogówki mają bardzo niski potencjał proliferacyjny in vivo, ale mogą być stymulowane do podziału in vitro4. Niemniej jednak mają silną tendencję do przechodzenia in vitro przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT), co zmniejsza ich zdolność do tworzenia dojrzałej, funkcjonalnej warstwy śródbłonka. Znane czynniki wyzwalające EMT w komórkach śródbłonka rogówki obejmują narażenie na niektóre czynniki wzrostu i utratę kontaktu między komórkami5. Jest zatem prawie nieuniknione, że hodowle komórek śródbłonka rogówki, które są enzymatycznie dysocjowane podczas subhodowli, ulegną zmianom związanym z EMT. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli komórkowej komórek śródbłonka rogówki ludzkiej lub owczej, która ma na celu zminimalizowanie zakłóceń kontaktów międzykomórkowych podczas etapów izolacji, ekspansji i subhodowli, w celu zmniejszenia potencjału EMT. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób przeszczepy inżynierii tkankowej, które przypominają przeszczepy śródbłonka / błony Descemeta / tkanki zrębu pochodzące z rogówki dawcy, mogą być wytwarzane przez hodowanie warstw komórek hodowlanych po obu stronach błony biomateriałowej w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu montażowym.

<table><tbody><tr><td>Czynnik przyłączenia</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>1X sterylny roztwór zawierający żelatynę, który służy do powlekania powierzchni kultur tkankowych. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Pojedyncza fiolka zawiera 25 mg. Zamrażać w porcjach.</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Sterylizacja filtra.</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan chondroityny</td><td>LKT Laboratories</td><td>C2960</td><td>To jest siarczan chondroityny bydlęcej. Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 0,08 g/ml. Przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w porcjach.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Rozpuścić w DPBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w porcjach.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>100% niedenaturowany etanol należy rozcieńczyć do 70% w wodzie dejonizowanej do sterylizacji narzędzi i powierzchni.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>Jest to marka HyClone płodowej surowicy bydlęcej.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe nr 1, i Oslash; 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>Wysterylizowane szkiełka nakrywkowe należy umieścić w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka, 1X, zawierający chlorek wapnia i chlorek magnezu.</td></tr><tr><td>2-fosforan kwasu L-askorbinowego</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>Rozpuścić w HBSS, aby uzyskać 150 mM roztwór podstawowy. Sterylizacja filtra.</td></tr><tr><td>Komora Micro-Boydena</td><td>CNC Components Pty. Ltd.</td><td>Pierścień górny: QUT-0002-0006, Pierścień podstawowy: QUT-0002-0007</td><td>Oba elementy są wykonane z politetrafluoroetelinu (PTFE).</td></tr><tr><td>O-ring do komory mikro-Boydena</td><td>Ludowici Sealing Solutions</td><td>RSB012</td><td>Składa się z gumy silikonowej.</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>Zredukowana pożywka surowicowa zawierająca glutaminę.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1X, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu.</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Roztwór antybiotyku 100X zawierający 10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>Sterylna szalka Petriego, 92 X 16 mm, do preparowania tkanek.</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej, 24-dołkowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>Płytka zawierająca 24 studzienki, każda o powierzchni 2 cm2.</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowa</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>Płytka zawierająca 6 studzienek, każdy o powierzchni 9 cm2.</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Roztwór enzymatyczny 1X do dysocjacji komórek.</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>Roztwór 1X EDTA do dysocjacji komórek.</td></tr><tr><td>Kleszcze zegarmistrzowskie</td> Kleszczyki zegarmistrzowskie <td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>Number 4 dobrze sprawdzają się przy usuwaniu pasków błony śródbłonka/Descemeta z rogówki.</td></tr></tbody></table>

wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Hodowle komórek śródbłonka rogówki mają tendencję do przechodzenia przejścia z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) po utracie kontaktu między komórkami. EMT jest szkodliwy dla komórek, ponieważ zmniejsza ich zdolność do tworzenia dojrzałej i funkcjonalnej warstwy. W tym miejscu przedstawiamy metodę zakładania i subkulturacji komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec, która minimalizuje utratę kontaktu między komórkami. Eksplantaty śródbłonka rogówki/błony Descemeta są pobierane z rogówki dawcy i umieszczane w hodowli tkankowej w warunkach, które umożliwiają komórkom wspólną migrację na powierzchnię hodowli. Po założeniu kultury eksplantaty są przenoszone na świeże talerze w celu zainicjowania nowych kultur. Lek Dispaza II służy do delikatnego usuwania grudek komórek z płytek do hodowli tkankowej w celu przeprowadzenia subhodowli. Hodowle komórek śródbłonka rogówki, które zostały ustalone przy użyciu tego protokołu, nadają się do przenoszenia do błon biomateriałowych w celu wytworzenia warstw komórek inżynierii tkankowej do przeszczepu w badaniach na zwierzętach. Opisano wykonane na zamówienie urządzenie do podtrzymywania błon biomateriałowych podczas hodowli tkankowej oraz przedstawiono przykład przeszczepu inżynierii tkankowej składającego się z warstwy komórek śródbłonka rogówki i warstwy komórek zrębu rogówki po obu stronach błony kolagenowej typu I.

Metoda izolacji i namnażania komórek endotelialnych rogówki z rogówek ludzkich lub owczych została przedstawiona w Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Większość eksplantów pochodzących z rogówek owiec w wieku od 1 do 2 lat lub dawców ludzkich poniżej 30 roku życia przytwierdza się do płytek hodowlanych pokrytych czynnikiem adhezyjnym (Attachment Factor) w ciągu tygodnia, jednak nie jest rzadkością, że do jednej trzeciej eksplantów nie udaje się przytwierdzić w tym czasie....

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Ten protokół hodowli komórkowej ma na celu zapobieganie przechodzeniu komórek śródbłonka rogówki z nabłonka do mezenchymów podczas izolacji, ekspansji i subhodowli. Hodowle komórkowe są tworzone z eksplantatów tkanki rogówki, które można ponownie wykorzystać, aby zapewnić ciągłe dostarczanie komórek pierwotnych od jednego dawcy. Rozpocznij od pokrycia studzienek sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej czynnikiem przyłączenia, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej zakodowanej studzienki. Umieść śródbłonek rogówki stroną do góry na sterylnej szalce Petriego na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Dostosuj oświetlenie tak, aby powierzchnia rogówki była dobrze oświetlona z wystarczającym kontrastem, aby uwydatnić warstwę śródbłonka, i dostosuj powiększenie tak, aby krawędź i część środkowego śródbłonka rogówki były widoczne.Użyj wysterylizowanych kleszczyków zegarmistrzowskich, aby delikatnie podnieść i oderwać błonę Descemeta od leżącego poniżej zrębu. Umieść pasek membrany w jednym z przygotowanych dołków płytki hodowlanej, pamiętając o natychmiastowej wymianie pokrywy płytki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Najpierw usuń paski błony Descemeta ze skrajnego obrzeża śródbłonka, a następnie z obszarów centralnych, umieszczając wszystkie paski z jednej rogówki w jednym dołku.Po zakończeniu inkubuj eksplantaty w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zamontuj górną komorę mikrokomory Boydena, umieszczając czerwony O-ring w jej środku. Użyj trepanacji o średnicy 18 milimetrów, aby wyciąć krążek z arkusza biomateriału na desce do krojenia z PTFE.Następnie umieść dysk na czerwonym O-ringu w górnej komorze mikro komory Boydena. Przykręć dolną komorę do górnej komory, zabezpieczając pomiędzy nimi krążek materiału biologicznego. I namocz zmontowaną mikro komorę Boydena w 70% etanolu na godzinę, aby ją wysterylizować.Po namoczeniu całkowicie zanurz komorę w sterylnym HBSS na 10 minut, aby usunąć etanol. Następnie umyj komorę w pożywce hodowlanej przez 10 minut. I przenieś do pożywki hodowlanej wewnątrz studzienki na płytce sześciodołkowej, upewniając się, że górna komora jest skierowana do góry.Dostosuj poziom pożywki tak, aby stykała się z dolną powierzchnią błony biomateriału, ale nie wpływała do górnej komory. Odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na membranę do mikrokomory Boydena i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych przez cztery godziny, przed dodaniem pożywki, aby całkowicie zanurzyć komorę. Większość eksplantatów, które pochodziły z rogówek jedno- lub dwuletnich owiec lub dawców ludzkich w wieku poniżej 30 lat, przyczepiono do płytki do hodowli tkankowej kodowanej czynnikiem przyczepienia w ciągu tygodnia.Po sześciu tygodniach obok eksplantatu znajdowało się wiele małych, ciasno upakowanych komórek. Małe, ciasno upakowane komórki w kulturach komórek śródbłonka rogówki są odporne na trawienie potrójnie, podczas gdy większe komórki fibroblastyczne są na nie bardziej wrażliwe. Różnica ta została wykorzystana do selektywnego usuwania dużych komórek z kultur przed przeniesieniem mniejszych komórek na nowe płytki.Analizy fluorescencji immunologicznej przeprowadzono na hodowlach komórek śródbłonka rogówki w celu zlokalizowania ZO-1, białka ścisłego połączenia, i N-kadheryny, białka połączenia adherencji. Te same przeciwciała zastosowano zarówno w komórkach owczych, jak i ludzkich, a oba białka wykryto w błonach plazmatycznych komórek obu gatunków. Wykonana na zamówienie mikrokomora Boydena pozwoliła na jednoczesne wykorzystanie obu stron membrany jako powierzchni hodowli komórkowych.Przekrój poprzeczny konstruktu komórkowego inżynierii tkankowej pokazuje pojedynczą warstwę komórek śródbłonka rogówki na jednej powierzchni i wielowarstwową hodowlę komórek zrębu rogówki na drugiej. Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby unikać skrobania śródbłonka kleszczami podczas odklejania błony Descemeta od rogówki. Po tej procedurze można sprawdzić integralność warstwy komórek śródbłonka rogówki na membranie, mierząc jej opór elektryczny.

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj metodę hodowli komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych. Protokół zapobiega przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu i zapewnia ciągłą dostawność komórek z jednego dawcy.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Przeglądaj więcej filmów