Name: Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj enzymatyczną polimeryzację białek z kontrolowaną liczbą monomerów do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Metoda zachowuje reszty funkcyjne cysteiny w badanych białkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 21771103, 21977047), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (Grant No. BK20160639) i program Shuangchuang w prowincji Jiangsu.

1. Produkcja białka
<ol>
	<li>Klon genu
	<ol>
		<li>Zakup genów kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania (POI): ubikwityna, rubredoksyna (RD)51, moduł wiążący celulozę (CBM), domena dokeryny X (XDoc) i kohezja z Ruminococcus flavefacience, proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV), polipeptydy podobne do elastyny (ELP).</li>
		<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy i użyj układu enzymatycznego trawienia z trzema ograniczeniami BamH I-Bgl II-KpnI do rekombinacji genu z różnych fragmentów białka.</li>
		<li>Potwierdź wszystkie geny za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i produkcja białek
	<ol>
		<li>Przekształć E. coli BL21(DE3) za pomocą plazmidu pQE80L-POI lub pET28a-POI w celu ekspresji.</li>
		<li>Wybierz jedną pojedynczą kolonię do 15 ml pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami (np. 100 μg/ml soli sodowej ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny). Potrząsać kulturami z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin.</li>
		<li>Rozcieńczyć nocne kultury w 800 ml pożywki LB (rozcieńczenie 1:50). W przypadku rubredoksyny odwirować kulturę przy 1 800 x g, a następnie ponownie zawiesić w 15 ml pożywki M9 (uzupełnionej 0,4% glukozy, 0,1 mM CaCl2, 2 mMMgSO4), a następnie rozcieńczyć ją do 800 ml pożywki M9.</li>
		<li>Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż kultura osiągnie gęstość optyczną 0,6 przy długości fali 600 nm (OD600). Zachowaj 100 μl próbki kultury jako kontrolę przed indukcją do badania ekspresji białka.</li>
		<li>Indukować ekspresję białka przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM i wstrząsać kulturą w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przy 200 obr./min. Zarezerwować 100 μl próbki kultury jako kontrolę po indukcji do badania ekspresji białek.</li>
		<li>Odwirować kulturę w temperaturze 13 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze -80 °C przed oczyszczeniem. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białka będącego przedmiotem zainteresowania
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 25 ml buforu do lizy (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 zawierające DNazę, RNazę, PMSF) i użyć sonikatora (amplituda 15%) do lizy przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Klarować lizat komórkowy w temperaturze 19 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Spakować 1 ml (objętość złoża) kolumny powinowactwa Co-NTA lub Ni-NTA i przemyć kolumnę 10 objętościami kolumny (CV) ultraczystej wody, a następnie 10 CV buforu do przemywania (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7,4) za pomocą przepływu grawitacyjnego.</li>
		<li>Przepuścić supernatant białkowy przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego trzy razy.</li>
		<li>Wlać bufor do przemywania na kolumnę z 50 CV, aby usunąć białka zanieczyszczające.</li>
		<li>Eluować związane białko za pomocą 3 CV lodowatego buforu elucyjnego (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 7,4). Jeśli chodzi o białka rubredoksyny, konieczne jest dalsze oczyszczanie anionitamiczne za pomocą kolumny anionowymiennej o pH 8,5 w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przeanalizuj próbkę za pomocą SDS-PAGE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych i powierzchni wspornikowej
<ol>
	<li>Funkcjonalne przygotowanie powierzchni szkiełka nakrywkowego
	<ol>
		<li>Rozpuść 20 g chromianu potasu w 40 ml ultraczystej wody. Powoli dodać 360 ml stężonego kwasu siarkowego do roztworu chromianu potasu za pomocą szklanej pałeczki, delikatnie wymieszać i przygotować kwas chromowy. 
		UWAGA: Zastosowana tutaj substancja chemiczna i końcowy kwas chromowy są silnie i kwaśne. Pracuj z odpowiednim sprzętem ochronnym. Roztwór uwalnia ciepło po dodaniu stężonego kwasu siarkowego, co oznacza powolne dodawanie i odpowiednią przerwę na schłodzenie.</li>
		<li>Oczyścić i aktywować szklane szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 °C przez 30 minut poprzez obróbkę kwasem chromowym. Całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 1% (v/v) roztworze toluenu APTES na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.</li>
		<li>Umyć szkiełko nakrywkowe toluenem i bezwzględnym alkoholem etylowym i osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.</li>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 °C przez 15 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Dodać 200 μl sulfo-SMCC (1 mg/ml) w roztworze dimetylosulfotlenku (DMSO) między dwoma unieruchomionymi szkiełkami nakrywkowymi i inkubować przez 1 godzinę chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Najpierw umyj szkiełko nakrywkowe DMSO, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym w celu usunięcia pozostałości sulfo-SMCC.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełko nakrywkowe pod strumieniem azotu.</li>
		<li>Odpipetować 60 μl 200 μM GL-ELP50nm-C roztworu białkowego na funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe i inkubować przez około 3 godziny.</li>
		<li>Umyj szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nieprzereagowany GL-ELP50nm-C. 
		UWAGA: Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe są zdolne do przechowywania przez około dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalizowane przygotowanie powierzchni wspornikowej
	<ol>
		<li>Wsporniki czyścić w temperaturze 80 °C przez 10 minut poprzez obróbkę kwasem chromowym.</li>
		<li>Funkcjonalizować wspornik przez aminosilanizację 1% (v/v) roztworem toluenu APTES, a następnie piec wspornik w temperaturze 80 °C przez 15 minut przed sprzężeniem do sulfo-SMCC.</li>
		<li>Połącz C-ELP50nm-NGL z powierzchnią za pomocą grupy maleimidowej sulfo-SMCC przez 1,5 godziny.</li>
		<li>Nieprzereagowany C-ELP50nm-NGL z szkiełka nakrywkowego zmyć ultraczystą wodą.</li>
		<li>Zanurzyć funkcjonalizowany wspornik w 200 μl 50 μM ROZTWORU BIAŁKA GL-CBM-XDoc zawierającego 200 nM OaAEP1 w temperaturze 25 °C na 20-30 minut. Następnie użyj buforu AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4), aby zmyć nieprzereagowane białko. 
		UWAGA: Skład chemiczny powierzchni wsporników i szkiełka nakrywkowego jest podobny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stopniowe przygotowanie poliprotein z kontrolowanymi sekwencjami
<ol>
	<li>Połączyć jednostkę ligacyjną Coh-tev-L-POI-NGL z GL-ELP50nm unieruchomionym na powierzchni szkiełka nakrywkowego przez OaAEP1 na 30 minut.</li>
	<li>Użyj 15-20 ml buforu AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4), aby zmyć wszelkie nieprzereagowane białka.</li>
	<li>Dodać 100 μl proteazy TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerolu, pH 8,0) w celu rozszczepienia jednostki białkowej w miejscu rozpoznania TEV przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Użyj 15-20 ml buforu AFM, aby zmyć resztki białek.</li>
	<li>Połącz jednostkę ligacyjną Coh-tev-L-POI-NGL ze szkłem GL-Ub-NGL-Glass za pomocą OaAEP1 na 30 minut.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3,3 do 3,5 N-1 razy, aby zbudować konstrukt białkowy GL-(Ub)n-NGL na powierzchni szkła. Pomiń ostatnią reakcję rozszczepienia TEV w celu zarezerwowania kohezyny na białku-polimerze jako Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.</li>
</ol>
4. Pomiar i analiza danych w eksperymencie AFM
<ol>
	<li>Pomiary AFM
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml buforu AFM do komory z 10 mM CaCl2 i 5 mM kwasem askorbinowym.</li>
		<li>Wybierz końcówkę D funkcjonalizowanej sondy AFM do eksperymentu. Użyj twierdzenia o ekwipartycji, aby skalibrować wspornik w buforze AFM z dokładną wartością stałej sprężystości (k) przed każdym eksperymentem.</li>
		<li>Przymocuj końcówkę wspornika do powierzchni próbki, aby utworzyć parę Cohesin/Dockerin.</li>
		<li>Wycofać wspornik ze stałą prędkością 400 nm·s−1 od powierzchni. W międzyczasie zapisz krzywą siła-wydłużenie przy częstotliwości próbkowania 4000 Hz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Użyj przetwarzania danych JPK, wybierz ślady wymuszenia-wydłużenia.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do analizy śladów. Dopasuj krzywe do modelu elastyczności polimeru o łańcuchu ślimakowym (WLC) i uzyskaj przyrost siły rozwijania i długości konturu dla poszczególnych pików rozwijania białka.</li>
		<li>Dopasuj histogramy sił rozwijania do modelu Gaussa, aby uzyskać najbardziej prawdopodobne wartości siły rozwijania (<Fu>) i przyrostu długości konturu (<ΔLc>).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy protokół enzymatycznej biosyntezy i immobilizacji poliproteiny oraz zweryfikowaliśmy projekt poliproteiny za pomocą SMFS opartego na AFM. Metodologia ta zapewnia nowatorskie podejście do budowy białka-polimeru w zaprojektowanej sekwencji, które uzupełnia poprzednie metody inżynierii poliproteinowej i immobilizacji 4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.<...

W porównaniu z syntetycznymi polimerami, naturalne białka wielodomenowe mają jednolitą strukturę z dobrze kontrolowaną liczbą i typem subdomen1. Ta cecha zwykle prowadzi do poprawy funkcji biologicznych i stabilności2,3. Wiele podejść, takich jak sprzęganie wiązań dwusiarczkowych na bazie cysteiny i technologia rekombinacji DNA, zostało opracowanych w celu zbudowania takiego spolimeryzowanego białka z wieloma domenami4,5,6,7. Jednak pierwsza metoda zawsze prowadzi do losowej i niekontrolowanej sekwencji, a druga prowadzi do innych problemów, w tym trudności z nadekspresją toksycznych i dużych białek oraz oczyszczania złożonych białek za pomocą kofaktora i innych delikatnych enzymów.
Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowujemy metodę enzymatyczną, która łączy monomer białka w polimer/polibiałko w sposób krokowy, używając ligazy białkowej OaAEP1 w połączeniu z proteazą TEV8,9. OaAEP1 jest ściśle i skuteczną endopeptydazą. Dwa białka mogą być kowalencyjnie połączone jako sekwencja Asn-Gly-Leu (NGL) przez dwa końce za pomocą OaAEP1 w czasie krótszym niż 30 minut, jeśli N-koniec to reszty Gly-Leu (GL), a drugi z których C-koniec to reszty NGL10. Jednak zastosowanie OaAEP1 tylko do łączenia monomeru białkowego prowadzi do powstania polimeru białkowego o niekontrolowanej sekwencji, takiej jak metoda sprzęgania oparta na cysteinie. Dlatego projektujemy N-koniec jednostki białkowej z usuwalnym miejscem proteazy TEV oraz resztą leucyny jako ENLYFQ / G-L-POI. Przed rozszczepieniem TEV N-koniec nie uczestniczyłby w podwiązaniu OaAEP1. A następnie reszty GL na N-końcu, które są zgodne z dalszym podwiązaniem OaAEP1, są odsłaniane po rozszczepieniu TEV. W ten sposób uzyskaliśmy sekwencyjną metodę biosyntezy enzymatycznej poliproteiny o stosunkowo dobrze kontrolowanej sekwencji.
Tutaj nasza metoda krokowej syntezy enzymatycznej może być stosowana w przygotowywaniu próbek poliprotein, w tym kontrolowanych sekwencyjnie i niekontrolowanych, a także immobilizacji białek do badań pojedynczych molekuł, szczególnie dla złożonych układów, takich jak metaloproteiny.
Ponadto, eksperymenty SMFS oparte na AFM pozwalają nam potwierdzić budowę i stabilność polimeru białkowego na poziomie pojedynczej cząsteczki. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek, w tym AFM, pęseta optyczna i pęseta magnetyczna, jest ogólnym narzędziem w nanotechnologii do mechanicznego manipulowania biomolekułami i mierzenia ich stabilności11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Jednocząsteczkowy AFM jest szeroko stosowany w badaniach nad (nie)fałdowaniem białek21,22,23,24,25, pomiar siły interakcji receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, nieorganiczne wiązanie chemiczne20,36,37,38,39,40,41,42,43 i wiązanie metal-ligand w metaloproteinie44,45,46,47,48,49,50. W tym przypadku jednocząsteczkowy AFM służy do weryfikacji zsyntetyzowanej sekwencji poliproteinowej w oparciu o odpowiedni sygnał rozwijania białka.

<table><tbody><tr><td>chlorek żelaza (III) sześciowodny</td><td>Energia chemiczna</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>100,00%</td></tr> <tr><td>hydrat chlorku wapnia</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>99,9965% agregat krystaliczny</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy Sigma</td><td>Life Science</td><td></td><td>Bio Xtra, &ge; 99,0%, krystaliczny</td></tr><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>sulfosuccinimidylo 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>90%</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Macklin</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>5,5'-ditiobis(kwas 2-nitrobenzoesowy)</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Genscript</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4 AFM</td><td>JPK Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLCT wspornik</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA System FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe</td><td>Marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żagiel Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Image System Tanon</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem oaaep1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Techniki chemiczne i bio-koniugacji zostały szybko rozwinięte w ostatnich latach i pozwalają na budowę polimerów białkowych. Jednak kontrolowany proces polimeryzacji białek jest zawsze wyzwaniem. W tym miejscu opracowaliśmy enzymatyczną metodologię konstruowania spolimeryzowanego białka krok po kroku w racjonalnie kontrolowanej sekwencji. W tej metodzie C-końcem monomeru białkowego jest NGL do koniugacji białek przy użyciu OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidazy) 1), podczas gdy N-koniec był rozszczepialnym miejscem rozszczepienia TEV (wirusa wytrawienia tytoniu) plus L (ENLYFQ / GL) do tymczasowej ochrony N-końca. W związku z tym OaAEP1 był w stanie dodać tylko jeden monomer białka na raz, a następnie proteaza TEV rozszczepiła N-koniec między Q i G, aby odsłonić NH 2-Gly-Leu. Następnie urządzenie jest gotowe do następnego podwiązania OaAEP1. Zmodyfikowana poliproteina jest badana poprzez rozwijanie pojedynczej domeny białkowej za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych (AFM-SMFS). Dlatego badanie to dostarcza użytecznej strategii inżynierii poliproteinowej i immobilizacji.

Pozostałości NGL wprowadzone między sąsiednimi białkami w wyniku ligacji OaAEP1 nie wpłyną na stabilność monomeru białkowego w polimerze, ponieważ siła rozwijania (&lt;Fu&gt;) oraz przyrost długości konturowej (&lt;ΔLc&gt;) są porównywalne z wynikami z poprzedniego badania (Rysunek 1). Wynik oczyszczania białka rubredoksyny przedstawiono na Rysunku 2. Aby udowodnić, że białko po cięciu TEV jest odpowiednie do następującej ligacji OaAEP1 w c...

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

W naszej metodzie enzymatycznej wykorzystuje się oligomer białkowy o kontrolowanym stopniu polimeryzacji. Jest to doskonałe przygotowanie próbki do badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, a także do budowy materiałów na bazie białek. Nasza metoda nie wprowadza cysteiny do białka docelowego.Ponieważ cysteina jest jedną z najważniejszych reszt funkcjonalnych białka, ułatwia budowę spolimeryzowanej materii, białka lub enzymów. Procedurę zademonstrują Yibing Deng i Shengchao Shi, absolwenci z mojego laboratorium. Na początek rozpuść 20 gramów chromianu potasu w 40 mililitrach ultraczystej wody w zlewce.Powoli dodaj 360 mililitrów stężonego kwasu siarkowego do roztworu dichromianu potasu i delikatnie wymieszaj szklaną pałeczką. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe w kwasie chromowym i przenieś je do piekarnika w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Wyczyść szkiełko nakrywkowe wodą, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym i osusz szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.Całkowicie zanurz szkiełko nakrywkowe w roztworze toluenu APTES o objętości 1% objętości na godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Umyć szkiełko nakrywkowe najpierw toluenem, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym i osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu. Inkubuj szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.Za pomocą pipety dodać 200 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr sulfo-SMCC w roztworze DMSO między dwoma unieruchomionymi szkiełkami nakrywkowymi i inkubować przez godzinę chroniąc przed światłem. Po godzinie umyj szkiełka nakrywkowe najpierw DMSO, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym, aby usunąć pozostałości Sulfo-SMCC. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe pod strumieniem azotu.Odpipetować 60 mikrolitrów 200-mikromolowego roztworu białka GL-ELP-50 na funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około trzy godziny. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nieprzereagowany GL-ELP-50-cys. Aby przygotować funkcjonalizowaną powierzchnię wspornika, najpierw zanurz wsporniki w kwasie chromowym i wyczyść wsporniki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut.Użyj wody i bezwodnego alkoholu etylowego, aby zmyć kwas. Zanurz wspornik w 1% objętościowo roztworze toluenu APTES, aby przeprowadzić zasolenie aminokwasów w plastikowej nasadce na jedną godzinę. Opłucz kantyl absolutnym alkoholem etylowym, a następnie piecz kantyl w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.Zanurzyć wspornik w roztworze Sulfo-SMCC na jedną godzinę, a następnie przepłukać wspornik absolutnym alkoholem etylowym. Aby połączyć cys-ELP-50-NGL z powierzchnią, zanurz wsporniki w cys-ELP-50-NGL z grupą maleimidową Sulfo-SMCC na 1,5 godziny. Następnie zmyć nieprzereagowany cys-ELP-50-NGL na wsporniku ultraczystą wodą.Następnie zanurz funkcjonalizowany wspornik w roztworze zawierającym 200 mikrolitrów 50-mikromolowego roztworu białka GL-CBM-XDockerin z 200 nanomolowymi OaAEP1 i umieść je w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut. Następnie użyj buforu AFM, aby zmyć nieprzereagowane białko. Bardzo ważne jest, aby wypłukać nieprzereagowane białko resztkowe przed eksperymentem AFM, ponieważ utworzy ono pary kohezyna-dokeryna i zablokuje wspornik, aby wchłonąć nowe białko na powierzchni.Aby połączyć jednostkę ligacji kohezyno-T-L-białko interesującego NGL z GL-ELP-50 unieruchomionym na powierzchni szkiełka nakrywkowego, dodaj 15 mikrolitrów OaAEP1 na szkiełko nakrywkowe i pozwól mu inkubować przez 30 minut. Użyj 15 do 20 mililitrów buforu AFM, aby zmyć wszelkie nieprzereagowane białka. Dodaj 100 mikrolitrów proteazy TEV, aby rozszczepić jednostkę białkową w miejscu rozpoznawania TEV przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie użyj 15 do 20 mililitrów buforu AFM, aby zmyć resztki białek. Połączyć jednostkę ligacji kohezynę-T-L-białko interesującego NGL ze szkłem GL-ubikwityny-NGL za pomocą OaAEP1 przez 30 minut. W zależności od konstruktów białkowych GL-ubikwityny-NGL, które mają być zbudowane na powierzchni szkła, powtórz kroki przygotowania poliproteiny n1 razy.Pomiń ostatnią reakcję rozszczepienia TEV w celu zarezerwowania kohezyny na polimerze białkowym w postaci szkła kohezynowo-TEV-L-ubikwityno-n-NGL. Dodaj jeden mililitr buforu AFM z 10 milimolowym chlorkiem wapnia i pięcioma milimolowymi kwasami askorbinowymi do komory płynu AFM. Wybierz końcówkę D funkcjonalizowanej sondy AFM do eksperymentu.Zanurz sondę w buforze AFM. Wycofaj wspornik ze stałą prędkością 400 nanometrów na sekundę od powierzchni. W międzyczasie zapisz krzywą wydłużenia siły z częstotliwością próbkowania 4 000 herców.Użyj twierdzenia o ekwipartycji, aby skalibrować wspornik w buforze AFM z dokładną wartością stałej sprężystości K przed każdym eksperymentem. Przymocuj końcówkę wspornika funkcjonalizowaną dokeryną do powierzchni osadzonej w białku funkcjonalizowanej kohezyną, tworząc parę kohezyna-dokeryna. Następnie otwieramy oprogramowanie do przetwarzania danych JPK i wybieramy krzywą wydłużenia siły o charakterystycznym wzorze piłokształtnym i dużej sile odrywania.W tym badaniu reszty NGL wprowadzone między sąsiednie białka przez ligację OaAEP1 nie wpłynęły na stabilność monomeru białka w polimerze, wyrażoną jako siła rozwijania i przyrost długości przeciwstawnej były porównywalne z poprzednim badaniem. Oczyszczanie rubretoksyny w formie żelazowej wykazało typowe piki absorpcji wizualizowane promieniami UV na 495 nanometrach i 575 nanometrach, podczas gdy forma nie. Wyniki etapowego trawienia i podwiązania w żelu SDS pokazują spoistą TEV-L-ubikwitynę, wynikową mieszaninę białkową rozszczepienia TEV, czystą proteazę GFP-TEV i oczyszczony produkt GL-ubikwitynę.Pokazano również rozszczepioną mieszaninę ligacji GL-ubikwityny i kohezyny-TEV-L-ubikwityny z lub bez OaAEP1 i czystym OaAEP1. Bardzo ważne jest funkcjonalizowanie powierzchni za pomocą aktywnego Sulfo-SMCC w celu skutecznego przyłączenia peptydów. Tutaj przedstawiamy nową metodę budowy spolimeryzowanego białka.Ułatwia to naukowcom badanie złożonych układów białkowych za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Kwas chromowy jest silnie i kwaśny. Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania i obchodzenia się z nim.

oaaep1-mediated-enzymatic-synthesis-immobilization-polymerized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Opisano nowatorskie podejście do budowy elektronicznego języka (eT), które znacznie upraszcza projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych, a także pozwala eT generować ciągłe profile ewolucji i krajobrazy dla próbek w cieczy. Uzyskany eT jest skuteczny w powszechnej analizie białek, takiej jak dyskryminacja.

Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej inkorporacji L-dihydroksyfenyloalaniny zsyntetyzowanej z prostych materiałów wyjściowych i jej zastosowania do koniugacji białek.

Genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej L-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i jej zastosowanie do koniugacji białek

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Poznaj enzymatyczną polimeryzację białek z kontrolowaną liczbą monomerów do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Metoda zachowuje reszty funkcyjne cysteiny w badanych białkach.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów