Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek
5 lutego 2020
Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.
W naszej metodzie enzymatycznej wykorzystuje się oligomer białkowy o kontrolowanym stopniu polimeryzacji. Jest to doskonałe przygotowanie próbki do badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, a także do budowy materiałów na bazie białek. Nasza metoda nie wprowadza cysteiny do białka docelowego.
Ponieważ cysteina jest jedną z najważniejszych reszt funkcjonalnych białka, ułatwia budowę spolimeryzowanej materii, białka lub enzymów. Procedurę zademonstrują Yibing Deng i Shengchao Shi, absolwenci z mojego laboratorium. Na początek rozpuść 20 gramów chromianu potasu w 40 mililitrach ultraczystej wody w zlewce.
Powoli dodaj 360 mililitrów stężonego kwasu siarkowego do roztworu dichromianu potasu i delikatnie wymieszaj szklaną pałeczką. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe w kwasie chromowym i przenieś je do piekarnika w temperaturze 80 stopni Celsjusza na 30 minut. Wyczyść szkiełko nakrywkowe wodą, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym i osusz szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu.
Całkowicie zanurz szkiełko nakrywkowe w roztworze toluenu APTES o objętości 1% objętości na godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Umyć szkiełko nakrywkowe najpierw toluenem, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym i osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem azotu. Inkubuj szkiełko nakrywkowe w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
Za pomocą pipety dodać 200 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr sulfo-SMCC w roztworze DMSO między dwoma unieruchomionymi szkiełkami nakrywkowymi i inkubować przez godzinę chroniąc przed światłem. Po godzinie umyj szkiełka nakrywkowe najpierw DMSO, a następnie bezwzględnym alkoholem etylowym, aby usunąć pozostałości Sulfo-SMCC. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe pod strumieniem azotu.
Odpipetować 60 mikrolitrów 200-mikromolowego roztworu białka GL-ELP-50 na funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około trzy godziny. Następnie umyj szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nieprzereagowany GL-ELP-50-cys. Aby przygotować funkcjonalizowaną powierzchnię wspornika, najpierw zanurz wsporniki w kwasie chromowym i wyczyść wsporniki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Użyj wody i bezwodnego alkoholu etylowego, aby zmyć kwas. Zanurz wspornik w 1% objętościowo roztworze toluenu APTES, aby przeprowadzić zasolenie aminokwasów w plastikowej nasadce na jedną godzinę. Opłucz kantyl absolutnym alkoholem etylowym, a następnie piecz kantyl w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Zanurzyć wspornik w roztworze Sulfo-SMCC na jedną godzinę, a następnie przepłukać wspornik absolutnym alkoholem etylowym. Aby połączyć cys-ELP-50-NGL z powierzchnią, zanurz wsporniki w cys-ELP-50-NGL z grupą maleimidową Sulfo-SMCC na 1,5 godziny. Następnie zmyć nieprzereagowany cys-ELP-50-NGL na wsporniku ultraczystą wodą.
Następnie zanurz funkcjonalizowany wspornik w roztworze zawierającym 200 mikrolitrów 50-mikromolowego roztworu białka GL-CBM-XDockerin z 200 nanomolowymi OaAEP1 i umieść je w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut. Następnie użyj buforu AFM, aby zmyć nieprzereagowane białko. Bardzo ważne jest, aby wypłukać nieprzereagowane białko resztkowe przed eksperymentem AFM, ponieważ utworzy ono pary kohezyna-dokeryna i zablokuje wspornik, aby wchłonąć nowe białko na powierzchni.
Aby połączyć jednostkę ligacji kohezyno-T-L-białko interesującego NGL z GL-ELP-50 unieruchomionym na powierzchni szkiełka nakrywkowego, dodaj 15 mikrolitrów OaAEP1 na szkiełko nakrywkowe i pozwól mu inkubować przez 30 minut. Użyj 15 do 20 mililitrów buforu AFM, aby zmyć wszelkie nieprzereagowane białka. Dodaj 100 mikrolitrów proteazy TEV, aby rozszczepić jednostkę białkową w miejscu rozpoznawania TEV przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Następnie użyj 15 do 20 mililitrów buforu AFM, aby zmyć resztki białek. Połączyć jednostkę ligacji kohezynę-T-L-białko interesującego NGL ze szkłem GL-ubikwityny-NGL za pomocą OaAEP1 przez 30 minut. W zależności od konstruktów białkowych GL-ubikwityny-NGL, które mają być zbudowane na powierzchni szkła, powtórz kroki przygotowania poliproteiny n1 razy.
Pomiń ostatnią reakcję rozszczepienia TEV w celu zarezerwowania kohezyny na polimerze białkowym w postaci szkła kohezynowo-TEV-L-ubikwityno-n-NGL. Dodaj jeden mililitr buforu AFM z 10 milimolowym chlorkiem wapnia i pięcioma milimolowymi kwasami askorbinowymi do komory płynu AFM. Wybierz końcówkę D funkcjonalizowanej sondy AFM do eksperymentu.
Zanurz sondę w buforze AFM. Wycofaj wspornik ze stałą prędkością 400 nanometrów na sekundę od powierzchni. W międzyczasie zapisz krzywą wydłużenia siły z częstotliwością próbkowania 4 000 herców.
Użyj twierdzenia o ekwipartycji, aby skalibrować wspornik w buforze AFM z dokładną wartością stałej sprężystości K przed każdym eksperymentem. Przymocuj końcówkę wspornika funkcjonalizowaną dokeryną do powierzchni osadzonej w białku funkcjonalizowanej kohezyną, tworząc parę kohezyna-dokeryna. Następnie otwieramy oprogramowanie do przetwarzania danych JPK i wybieramy krzywą wydłużenia siły o charakterystycznym wzorze piłokształtnym i dużej sile odrywania.
W tym badaniu reszty NGL wprowadzone między sąsiednie białka przez ligację OaAEP1 nie wpłynęły na stabilność monomeru białka w polimerze, wyrażoną jako siła rozwijania i przyrost długości przeciwstawnej były porównywalne z poprzednim badaniem. Oczyszczanie rubretoksyny w formie żelazowej wykazało typowe piki absorpcji wizualizowane promieniami UV na 495 nanometrach i 575 nanometrach, podczas gdy forma nie. Wyniki etapowego trawienia i podwiązania w żelu SDS pokazują spoistą TEV-L-ubikwitynę, wynikową mieszaninę białkową rozszczepienia TEV, czystą proteazę GFP-TEV i oczyszczony produkt GL-ubikwitynę.
Pokazano również rozszczepioną mieszaninę ligacji GL-ubikwityny i kohezyny-TEV-L-ubikwityny z lub bez OaAEP1 i czystym OaAEP1. Bardzo ważne jest funkcjonalizowanie powierzchni za pomocą aktywnego Sulfo-SMCC w celu skutecznego przyłączenia peptydów. Tutaj przedstawiamy nową metodę budowy spolimeryzowanego białka.
Ułatwia to naukowcom badanie złożonych układów białkowych za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Kwas chromowy jest silnie i kwaśny. Zachowaj ostrożność podczas przygotowywania i obchodzenia się z nim.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia enzymatyczną metodę koniugacji monomerów białkowych w polimery o kontrolowanej sekwencji. Powstałe polimery białkowe mogą zostać unieruchomione na powierzchniach w celu prowadzenia badań z zakresu spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Inżynieria białek
- Techniki pojedynczych cząsteczek
Wstęp
- Oligomery białek są niezbędne w wielu zastosowaniach w nauce o materiałach.
- Zachowanie reszt funkcjonalnych w białkach jest kluczowe dla ich aktywności.
- Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek dostarcza informacji na temat oddziaływań molekularnych.
- Metoda ta pozwala uniknąć wprowadzania cysteiny, co pozwala zachować ważne grupy funkcjonalne.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia polimerów białkowych o określonych sekwencjach.
- Ułatwienie badania oddziaływań białkowych na poziomie pojedynczej cząsteczki.
- Zapewnienie niezawodnej metody konstrukcji materiałów opartych na białkach.
Zastosowane metody
- Polimeryzacja enzymatyczna monomerów białkowych.
- Immobilizacja polimerów na powierzchniach.
- Przygotowanie próbek do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.
- Zastosowanie chromianu potasu w procesie przygotowania.
Główne wyniki
- Skuteczna koniugacja monomerów białkowych w polimery.
- Zachowanie reszt funkcjonalnych w białkach docelowych.
- Zaprezentowanie metody przez studentów studiów magisterskich.
- Przygotowanie odpowiednie do dalszych badań nad oddziaływaniami białek.
Wnioski
- Metoda ta stanowi solidne podejście do polimeryzacji białek.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w zakresie spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować zaawansowane materiały oparte na białkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda polimeryzacji enzymatycznej umożliwia kontrolowaną budowę polimerów białkowych do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, wspierając walidację celów poprzez precyzyjne pomiary rozfałdowania domen. Dzięki zachowaniu reszt funkcjonalnych i unikaniu modyfikacji cysteiny, metoda ta utrzymuje integralność białek, co pozwala na wiarygodną ocenę biofizyczną. Podejście to zapewnia powtarzalną platformę do oceny stabilności białek i siły ich oddziaływań w początkowych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie stabilności domen białkowych oraz sił rozwijania w celu walidacji hipotez mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na generowanie zdefiniowanych substratów polibiałkowych o kontrolowanej walencyjności, co zapewnia spójne odczyty w spektroskopii sił.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie unieruchomionych polimerów białkowych o jednolitej prezentacji, co umożliwia standaryzację pomiarów pojedynczych cząsteczek.
- Wartość operacyjna: Wspiera przygotowanie testów dzięki kowalencyjnemu, zorientowanemu unieruchomieniu za pomocą parowania kohezyny z dokeryną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka związanego z celami terapeutycznymi poprzez ilościowe określanie stabilności mechanicznej domen białkowych pod wpływem siły.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne porównanie białek typu dzikiego oraz ich wariantów w zdefiniowanym formacie polimerowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – dostarczając ilościowych danych biofizycznych na temat stabilności domen białkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez bezpośredni pomiar sił rozfałdowania białek oraz zmian długości konturowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych krzywych siła-wydłużenie do porównywania wariantów białek lub stanów związanych z ligandem.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze mechaniczne odciski palców (wzory piły, siły odrywania) wskazujące na stabilność specyficzną dla danej domeny.
- Badania translacyjne: Łączy metryki stabilności in vitro z potencjalnym zachowaniem in vivo poprzez korelację mechanistyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia strategię chemii powierzchni i immobilizacji z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować w odniesieniu do wielu celów białkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w ocenach stabilności białek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom enzymatycznej polimeryzacji i funkcjonalizacji powierzchni.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, zapewniając bezpośrednie odczyty mechaniczne dotyczące integralności konstruktu białkowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną stabilność domen w fizjologicznych warunkach siłowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu inżynierii białek, koniugacji enzymatycznej oraz spektroskopii sił opartej na AFM.
- Zależne od dostępu do systemów AFM z celami płynnymi, skalibrowanymi belkami oraz możliwości pomiaru siła-rozciągnięcie.
- Wymaga standaryzacji funkcjonalizacji powierzchni (Sulfo-SMCC, APTES) oraz aktywności proteazy/OaAEP1 w poszczególnych seriach pomiarowych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy zastosowaniu różnych konstruktów białkowych o zróżnicowanych końcach lub właściwościach strukturalnych.
- Ograniczone przez konieczność stosowania odczynników o wysokiej czystości oraz ostrożnego obchodzenia się z korozyjnym kwasem chromowym podczas przygotowania powierzchni.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Functionalization of Coverslip and Cantilever Surface
4:31
Stepwise Polyprotein Preparation with Controlled Sequences
5:44
AFM Experiment Measurement and Data Analysis
6:54
Results: AFM-based SMFS Measurements, UV-Vis Absorbance Spectra and SDS-PAGE Gel Results
7:51
Conclusion
