Obrazowanie hiperspektralne jako narzędzie do badania anizotropii optycznej w monokryształach molekularnych na bazie lantanowców

Obrazowanie hiperspektralne pozwala na pozyskiwanie informacji spektroskopowych w precyzyjnych lokalizacjach w próbce. Na przykład do odkrycia anizotropii optycznej na poziomie pojedynczego kryształu. Generowanie zarówno danych spektralnych, jak i przestrzennych próbki pozwala na bardziej szczegółowe badanie próbki niż jest to możliwe za pomocą samej spektroskopii lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Duża liczba regulowanych parametrów, które wpływają na rozdzielczość, może na początku wydawać się przytłaczająca. Jednak sporządzenie listy kontrolnej może pomóc w zapoznaniu się z systemem. Technika ta wymaga ręcznego dostrojenia sprzętu do obrazowania, a także manipulacji oprogramowaniem.

Niezbędne jest wizualne zilustrowanie obu aspektów, aby pokazać, w jaki sposób obie metody wzajemnie się uzupełniają. Procedurę z Nelsonem Rutajogą zademonstruje Emily Rodrigues, doktor habilitowany w moim laboratorium. Aby skonfigurować konfigurację kamery do mapowania obrazowania hiperspektralnego, zaczynając od stopnia mikroskopu i podążając ścieżką wiązki emisyjnej w kierunku detektorów, pozostaw wolne miejsce na sześcian optyczny tuż obok mikroskopu optycznego i umieść kostkę optyczną mikroskopu konfokalnego w tej pozycji, która kieruje emisję z próbki przez ścieżkę światła widzialnego.

Patrząc wzdłuż ścieżki optycznej w kierunku detektora, umieść widzialny sześcian optyczny zawierający zwierciadło dichroiczne i filtry do kierowania emisji widzialnej na ścieżkę detekcji w jej pozycji. Kontynuując ścieżkę w kierunku detektora, umieść konfokalny sześcian optyczny otworkowy we właściwej pozycji, aby skierować światło przez ścieżkę wykrywania światła widzialnego i podążając tą ścieżką, umieść kostkę optyczną spektrometru konfokalnego w odpowiedniej pozycji, tak aby emitowane światło docierało do detektora. Gdy wszystkie kostki są na swoim miejscu, ręcznie dostosuj otwór szczelinowy czujnika, aby dopasować go do rozmiaru wybranego otworu.

Następnie w oprogramowaniu PHySpec wybierz otwór otworu. W celu mapowania obrazowania hiperspektralnego monokryształu trifluoroacetyloacetonianu terbu europu bifluoroacetyloacetonianu, ręcznie ustaw 20-krotny obiektyw mikroskopu optycznego pod próbką i naciśnij biały przycisk po lewej stronie mikroskopu, aby włączyć białe światło. Obróć pokrętło pod przyciskiem, aby wyregulować jasność.

Ustaw przednie pokrętło po prawej stronie mikroskopu w pozycji R, aby wysłać 20% sygnału do kamery i 80% sygnału do detektora. Naciśnij przycisk odtwarzania w oknie kolorowej kamery w oprogramowaniu PHySpec, aby zainicjować skanowanie na żywo. Jeśli okno kamery kolorowej pokazuje zbyt ciemny lub obraz, zwiększ czas ekspozycji i/lub wartość wzmocnienia na karcie kamery kolorowej.

Jeśli obraz jest zbyt jasny, zmniejsz czas naświetlania i/lub wartość wzmocnienia. Aby ustawić ostrość na próbce, obróć pokrętła mikroskopu, aby wyregulować odległość między obiektywem w stoliku i otwórz migawkę lampy szerokopasmowej, aby umożliwić wzbudzenie próbki w promieniowaniu UV. Następnie przekręć pokrętło intensywności do żądanej pozycji, aby kontrolować intensywność wzbudzenia lampy szerokopasmowej.

Kliknij przycisk Pokaż/Ukryj podziałkę skali, aby dodać podziałkę liniową do obrazu kryształu z mikroskopii optycznej w jasnym polu i obserwować obraz kryształu w pełnym lub ograniczonym oświetleniu UV. Aby wybrać między oświetleniem ograniczonym a oświetleniem o szerokim polu, użyj drążka i pokręteł, aby dostosować rozmiar przysłony pola lampy UV. W zakładce SpectraPro SP 2300 wybierz długość fali, aby obserwować emisję próbki i dostosuj czas ekspozycji detektora.

Aby uzyskać sześcian hiperspektralny w sekwencerze, kliknij plus, aby dodać nowy węzeł, a następnie kliknij Confocal Imager. Kliknij opcję Multi-Spectrum Acquisition (Akwizycja wielu widm) i wprowadź żądaną liczbę pozycji X i Y, a także żądany rozmiar kroku. Wybierz opcję sprzętową synchronizacji kamery i mapowania emisji widocznej, a następnie kliknij przycisk OK.

W sekwencerze kliknij nowo dodaną linię akwizycji wielospektracyjnej, aby podświetlić węzeł, a następnie kliknij przycisk Odtwórz, aby uruchomić wybrany węzeł. W celu analizy przechwyconych danych obrazowania hiperspektralnego, na przykład dla rozkładu widmowego obrazu, w menu Przetwarzanie wybierz Dane oraz Przytnij i zagięcie, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu obrazu. Aby uzyskać profil intensywności emisji, kliknij prawym przyciskiem myszy obraz sześcianu i wybierz opcję Utwórz profil X dla analizy jednej linii.

Przeciągnij, aby zaznaczyć obszar i kliknij prawym przyciskiem myszy obszar zainteresowania. Aby wybrać opcję Dodaj do wykresu. Wyświetlanie intensywności emisji w funkcji fizycznego położenia obiektu.

Profil intensywności pojawi się na nowym wykresie. Aby uzyskać widmo emisyjne określonego obszaru próbki, najedź kursorem na obraz sześcianu, kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Wybór prostokąta. Przeciągnij i kliknij, aby narysować kształt zaznaczenia nad żądanym regionem.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy interesujący Cię obszar i wybierz Dodaj zaznaczenie do wykresu. W oknie Dodaj do wykresu wybierz opcję Utwórz nowy wykres, aby wyświetlić widma emisji celu, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie zapisz uzyskane widmo przed wybraniem nowego regionu.

Tutaj pokazany jest obraz kryształu w jasnym polu zarejestrowany po ustawieniu próbki w odpowiedniej ostrości. Wyraźnie można zaobserwować igiełkowatą morfologię kryształu. Tutaj można zaobserwować obrazy tego samego kryształu pod wpływem wzbudzenia UV z pełnym oświetleniem lub lokalnie ograniczonym oświetleniem.

Ograniczone oświetlenie może być wykorzystane do zbadania efektów transferu energii lub światła w krysztale, które mogą wyzwalać zachowanie podobne do falowody. Na przykład na tym zdjęciu silna emisja jest wykrywana w punkcie, który nie jest bezpośrednio wzbudzony, co sugeruje, że efektywna migracja energii odbywa się przez kryształ. Z pozyskanego sześcianu hiperspektralnego możliwe jest również uzyskanie rozkładu widmowego w postaci obrazu, reprezentującego określoną długość fali.

Profil intensywności określonej długości fali emisyjnej i widma emisyjne w dowolnym pikselu lub obszarze pozyskanego sześcianu hiperspektralnego. Na przykład widma emisyjne dla tej analizy pokazują najbardziej charakterystyczne pasma emisji jonu europu. Co więcej, profil przestrzenny wzdłuż różnych powierzchni kryształów wskazuje na jaśniejszą emisję na wierzchołku i powierzchniach bocznych i może być skorelowany z odległościami lantanowców/jonów lantanowców w trzech kierunkach przestrzennych.

Aby uzyskać dobry sygnał w rozsądnym czasie rejestracji sześcianu hiperspektralnego, ważne jest, aby dostosować konfiguracje mikroskopu, ostrość i czas ekspozycji detektora. Emisje wzbudzenia UV i emisji widzialnej, technika ta może być wykonywana przy użyciu wzbudzenia w bliskiej podczerwieni i wykrywania emisji w bliskiej podczerwieni. Dzięki temu można go stosować do szerokiej gamy materiałów luminescencyjnych.

Korelacja sygnałów optycznych z szeregiem cech zależnych sprawia, że technika ta jest bardzo interesująca dla badania relacji między strukturą a właściwościami, w tym oceny interakcji nano-bio in vitro.