Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji
27 kwietnia 2020
Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.
Komórki syntetyczne produkujące białka stanowią wszechstronną platformę do badania początków życia, a także terapii opartych na komórkach syntetycznych do zaawansowanego dostarczania leków. Metoda ta jest prosta i niedroga do ekspresji RNA i białek i może być stosowana do produkcji białek terapeutycznych na miejscu bezpośrednio w organizmie. Systemy te mogą być stosowane w leczeniu szerokiego zakresu chorób, od chorób metabolicznych i zamienników białek po raka i prawdopodobnie cukrzycę.
Ten wieloetapowy protokół ma zdefiniowany punkt zatrzymania. Wykonując go po raz pierwszy, zaleca się podzielenie pracy na kilka dni. Protokół syntetycznej produkcji komórek rozpoczyna się od przygotowania bezkomórkowego lizatu S30-T7.
Następnie przygotowuje się lipidy błonowe i komórkowy roztwór odżywczy, aby symulować środowisko wewnętrzne i wspierać produkcję białek. Ostatnim krokiem jest przygotowanie samych syntetycznych komórek. Przygotuj zduplikowane kultury starterowe w 100-mililitrowych kolbach Erlenmeyera.
Do każdej kolby dodać pięć mililitrów pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny i zaszczepić pojedynczą kolonią E. coli. Hoduj kulturę przez noc w wytrząsarce inkubatora podłogowego z prędkością 250 obr./min i 37 stopniami Celsjusza. Następnie przygotuj dwulitrowe kolby Erlenmeyera z przegrodami zawierające 500 mililitrów pożywki gruźliczej uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny.
Zaszczepić każdą dwulitrową kolbę pięciomililitrową kulturą starterową. Umieścić kolby w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min i 37 stopniami Celsjusza. Okresowo monitorować kultury za pomocą spektrofotometru i hodować kultury do OD600 między 0,8 a jeden.
Aby indukować ekspresję polimerazy RNA T7, dodaj do każdej kolby trzy mililitry 100 milimolowego IPTG, aby osiągnąć 0,6 milimola. Kontynuuj uprawę kultur, aż OD600 osiągnie około czterech. Gdy kultury osiągną pożądaną gęstość optyczną, przenieś zawiesinę z każdej kolby Erlenmeyera do dwóch 250 mililitrowych sterylizowanych probówek wirówkowych.
Odwirować probówki o ciśnieniu 7 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. W razie potrzeby ponownie zawiesić każdą granulkę w 250 mililitrach zimnego buforu lizatu S30 za pomocą mieszadła.
Wirować w temperaturze 7 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś wszystkie granulki razem w 15 mililitrach zimnego buforu lizatu S30. Przefiltrować zawiesinę za pomocą gazików.
Przed przejściem do następnego kroku należy wstępnie schłodzić końcówki w 1,5-mililitrowych fiolkach, które będą potrzebne do przechowywania lizatu. Zawiesinę homogenizować dwukrotnie. Użyj ciśnienia roboczego 15 000 PSI przy ciśnieniu powietrza wynoszącym cztery bary do uszkodzenia komórek.
Zebrać homogenat. Dodać 100 mikrolitrów 0,1 molowego DTT na 10 mililitrów homogenizowanej zawiesiny. Odwirować zawiesinę w temperaturze 24 700 g po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Naziemna terapia cyfrowa (DTT) i chloroform są klasyfikowane jako drażniące i szkodliwe, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Chloroform stosowany w dalszej części protokołu musi być stosowany w obszarze, w którym odbywa się ekstrakcja dymów. Aby zachować aktywność lizatu, wykonaj ten krok szybko.
Umieść 200 mikrolitrów podwielokrotności supernatantu we wstępnie schłodzonych fiolkach i natychmiast zamroź je ciekłym azotem. Przechowywać fiolki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Oddzielnie rozpuścić POPC i cholesterol w chloroformie do końcowego stężenia 100 miligramów na mililitr.
Wirować każdą fiolkę osobno. Połącz składniki w szklanej fiolce o pojemności dwóch mililitrów. Dodać 50 mikrolitrów roztworu cholesterolu i chloroformu, 50 mikrolitrów roztworu chloroformu POPC i 500 mikrolitrów oleju mineralnego.
Wirować fiolkę, a następnie, aby odparować chloroform, podgrzewać ją przez około godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza w kapturze chemicznym. Przed rozpoczęciem etapu produkcji komórek syntetycznych należy przygotować roztwory zewnętrzne, wstępne i zasilające zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie umieść 1,2 mililitra roztworu zewnętrznego w 15-mililitrowej probówce i powoli dodaj warstwę 500 mikrolitrów roztworu lipidów w oleju z pierwszej szklanej fiolki.
Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Aby sfinalizować przygotowanie roztworu wewnętrznego, wymieszać na lodzie do końcowej objętości 100 mikrolitrów, dodając lizat S30-T7 i plazmid DNA. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu wewnętrznego z lizatem i plazmidem do drugiej dwumililitrowej szklanej fiolki z 500 mikrolitrami roztworu lipidów w oleju.
Energicznie pipetuj w górę i w dół przez jedną minutę, a następnie wiruj przez kolejną minutę na poziomie piątym. Po inkubacji powstałej emulsji przez 10 minut na kruszonym lodzie, powoli dodaj emulsję na wierzch fazy olejowej w 15-mililitrowej probówce. Wirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 100 razy g i czterech stopniach Celsjusza.
Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 400 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Pod koniec wirowania na dnie probówki powinien być widoczny osad. Aby wydobyć granulkę, najpierw usuń nadmiar warstwy oleju.
Następnie załaduj przyciętą końcówkę pipety około 400 mikrolitrami roztworu zewnętrznego i użyj końcówki pipety do zebrania osadu, uwalniając zewnętrzny roztwór, gdy końcówka pipety przechodzi przez fazę olejową. Wytrzyj końcówkę pipety i przenieś granulkę do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować osad przez 10 minut w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach roztworu zasilającego. W celu ekspresji białka inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Plazmidy eksprymujące modelowe białko sfGFP i lucyferazy Renilla wprowadzono do bezkomórkowej syntezy białek, reakcji masowych CFPS i komórek syntetycznych.
Produkcję białka oceniano przy użyciu kilku metod. Analiza Western blot wykryła produkcję sfGFP His6 zarówno w reakcjach masowych CFPS, jak i w komórkach syntetycznych. Oczyszczony sfGFP His6 zastosowano jako kontrolę pozytywną.
Mikroskop fluorescencyjny z jasnym polem i filtrem GFP pokazuje syntetyczne komórki, które wytwarzają sfGFP. Do analizy komórek syntetycznych wytwarzających sfGFP wykorzystano cytometrię przepływową. Obliczenia aktywnej populacji komórek syntetycznych oparto na progu intensywności fluorescencji sfGFP określonym przez ujemną próbkę DNA reprezentowaną przez czerwony histogram.
Średnią intensywność fluorescencji komórek syntetycznych wytwarzających sfGFP obliczono na podstawie aktywnej populacji komórek syntetycznych i znormalizowano do ujemnej próbki DNA. Rozkłady średnic aktywnych ogniw syntetycznych obliczono na podstawie sygnału sfGFP. Aktywność lucyferazy Renilla określono ilościowo za pomocą pomiarów luminescencji.
Metoda ta jest bardzo wszechstronna i może być zoptymalizowana dla różnych białek docelowych poprzez zmianę pochodzenia lizatu, składu lipidów i stężeń roztworu wewnętrznego. Analiza FACS komórek syntetycznych wytwarzających białko markerowe fluorescencyjne może być przeprowadzona w celu uzyskania wartości ilościowej frakcji aktywnych komórek syntetycznych. Analiza Western blot mierzyłaby produkcję białka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznych komórek produkujących RNA i białka z wykorzystaniem metody transferu emulsji woda-w-oleju. Syntetyczne komórki zamykają lizat bakteryjny S30 wewnątrz lipidowej dwuwarstwy, stanowiąc platformę dla zastosowań terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Biologia syntetyczna
- Systemy bezkomórkowe
Wstęp
- Komórki syntetyczne mogą naśladować funkcje biologiczne.
- Są one użyteczne w badaniu początków życia.
- Komórki te mogą być wykorzystywane do produkcji białek terapeutycznych in situ.
- Zastosowania obejmują leczenie różnych chorób.
Cel badania
- Opracowanie metody wytwarzania syntetycznych komórek.
- Ułatwienie ekspresji RNA i białek.
- Zbadanie możliwości zastosowań terapeutycznych w dostarczaniu leków.
Zastosowane metody
- Przygotowanie bezkomórkowego lizatu S30-T7.
- Enkapsulacja lizatu w dwuwarstwach lipidowych.
- Zastosowanie metody transferu emulsji woda w oleju.
- Wieloetapowy protokół z określonymi punktami zatrzymania.
Główne wyniki
- Skuteczna enkapsulacja lizatu S30 w komórkach syntetycznych.
- Wykazanie potencjału do produkcji białek w miejscu zapotrzebowania.
- Wszechstronna platforma dla różnych zastosowań terapeutycznych.
- Protokół może być realizowany przez kilka dni w celu zwiększenia wydajności.
Wnioski
- Komórki syntetyczne stanowią obiecujące narzędzie w badaniach i terapii.
- Metoda jest prosta i kosztowo efektywna.
- Potencjalne zastosowania w leczeniu chorób metabolicznych i nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia montaż syntetycznych komórek metodą bottom-up w celu kontrolowanej produkcji białek, oferując wszechstronną platformę do walidacji celów oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w wczesnej fazie odkrywania leków. Poprzez enkapsulację bezkomórkowych systemów ekspresyjnych w pęcherzykach lipidowych, metoda ta zapewnia powtarzalne wyniki ilościowe niezbędne do opracowywania testów i screeningu fenotypowego. Podejście to ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po fazy przedkliniczne, szczególnie w zastosowaniach dotyczących produkcji białek terapeutycznych oraz dostarczania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów transkrypcyjnych i translacyjnych w odizolowanym środowisku naśladującym komórkę.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zdefiniowany układ do funkcjonalnej walidacji celu poprzez mierzalną produkcję białka.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących, umożliwiając szybkie testowanie wydajności ekspresji białek przez konstrukty genetyczne.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty fluorescencji i luminescencji do wysokoprzepustowego screeningu wariantów genetycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testów produkcji białek dzięki zastosowaniu enkapsulowanego lizatu i kontrolowanemu składowi roztworu wewnętrznego.
- Skalowalność: Ułatwia produkcję milionów syntetycznych komórek w celu odtwarzalnej oceny związków lub konstruktów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Służy jako kontrolowana platforma do produkcji białek terapeutycznych na żądanie, wspierając przedkliniczne potwierdzenie koncepcji (proof-of-concept).
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie aktywności białek/RNA w izolacji, co zmniejsza niejednoznaczność w interpretacji szlaków sygnałowych.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia ocenę wydajności i stabilności ekspresji przed integracją z systemem komórkowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania poprzez zapewnienie systemu ekspresji bezkomórkowej, który łączy projektowanie genetyczne z walidacją funkcjonalną, poprzedzając testy oparte na komórkach oraz modele przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących konstruktów genowych poprzez bezpośredni pomiar syntezy białek w systemie minimalnym.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy komórki syntetyczne z mierzalnymi wynikami (fluorescencja, luminescencja) do oceny wydajności ekspresji.
- Analityka: Umożliwia normalizację danych dotyczących produkcji białek za pomocą progów intensywności sfGFP oraz obliczeń populacji aktywnych komórek.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi, wykazując potencjał produkcji białek terapeutycznych w formacie zdolnym do dostarczania.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Tworzy reużywalną platformę do produkcji białek dla wielu celów dzięki zamienności lizatów i plazmidów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję złożoności komórkowej i izolację procesów transkrypcji i translacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów przygotowania lizatu, enkapsulacji lipidowej oraz przenoszenia emulsji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybką i niskokosztową iterację konstruktów ekspresyjnych przed zainwestowaniem w systemy komórkowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając wczesnych, ilościowych danych na temat wydajności i funkcjonalności białka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli bakterii, przygotowywaniu lizatów bezkomórkowych oraz pracy z lipidami.
- Zależy od dostępności aparatury, w tym spektrofotometru, wirówki, homogenizatora oraz detektorów fluorescencji/luminescencji.
- Wymaga standaryzacji aktywności lizatu, składu lipidów oraz formulacji roztworu wewnętrznego pomiędzy zespołami.
- Obejmuje kwestie adaptacji dla różnych konstruktów plazmidowych i białek docelowych poprzez dobór pochodzenia i stężenia lizatu.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność pracy w niskich temperaturach, stosowanie wyciągu oparów dla chloroformu oraz wyznaczenie punktów przerwania prac przy realizacji wielodniowej.
