Name: Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę przygotowania syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych S30-T7 i transferu emulsji woda-w-oleju. Ta technika umożliwia ekspresję RNA i białek w celach terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ERC-STG-2015-680242.
Autorzy dziękują również za wsparcie Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; izraelskiego Ministerstwa Gospodarki za grant Kamin (52752); izraelskiego Ministerstwa Nauki, Technologii i Przestrzeni Kosmicznej - Office of the Chief Scientist (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Izraelskie Stowarzyszenie Walki z Rakiem (2015-0116); Niemiecko-Izraelskiej Fundacji Badań Naukowych i Rozwoju za grant GIF Young (I-2328-1139.10/2012); Program Unii Europejskiej FP-7 IRG na rzecz stypendium na integrację zawodową (908049); grant Centrum Badań nad Fosfolipidami; Rosenblatt Foundation na rzecz badań nad rakiem, stypendium Mallat Family Foundation; oraz Fundacja Rodziny Ungerów. A. Schroeder dziękuje za stypendia Alon i Taub. O. Adir uznaje stypendia Shermana i Gutwirtha. G. Chen uznaje Stypendium Shermana. N. Krinsky dziękuje Baronessie Ariane de Rothschild Women Doctoral Program z Fundacji Rothschildów w Cezarei.

UWAGA: Ilustracja pełnego protokołu produkcji ogniw syntetycznych jest przedstawiona w Rysunek 1. W zależności od potrzeb użytkownika, części protokołu dotyczące ekspresji białek (sekcja 3.2) i tworzenia komórek syntetycznych (sekcja 4) mogą być również przeprowadzane niezależnie (z pewnymi adaptacjami).
1. Przygotowanie lizatu S30-T7
<ol>
	<li>Na płytce z agarem LB uzupełnionym ampicyliną o stężeniu 50 μg / ml ampicyliny w celu uzyskania pojedynczych kolonii przekształciła się w polimerazę RNA T7 wyrażającą plazmid pAR1219 na płytce LB-agar uzupełnionej ampicyliną o stężeniu 50 μg / ml w celu uzyskania pojedynczych kolonii.</li>
	<li>Przygotować roztwór startowy: Inokulować pojedynczą kolonię w 5 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny w 100 ml kolbie Erlenmeyera i hodować przez noc przy użyciu wytrząsarki w inkubatorze podłogowym przy 250 obr./min i temperaturze 37 °C. Przygotować duplikaty.</li>
	<li>Zaszczepić każdy 5 ml startera oddzielnie w 500 ml pożywki gruźliczej uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodami i hodować ją za pomocą wytrząsarki do inkubatora podłogowego z prędkością 250 obr./min i temperaturze 37 °C, aż osiągnie OD600 0,8-1. Okresowo monitorować za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Dodaj 2-3 ml 100 mM zapasu IPTG (aby osiągnąć 0,4 - 0,6 mM) w celu indukcji ekspresji polimerazy T7 RNA i kontynuuj hodowlę, aż osiągnie OD600≈4.</li>
	<li>Przenieść roztwór z każdej kolby Erlenmeyera do dwóch wysterylizowanych probówek wirówkowych o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Odwirować każdy z nich przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. 
	UWAGA: Na tym etapie osad bakteryjny można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni przed przejściem do kolejnych kroków.</li>
	<li>Ponownie zawiesić każdą osadkę w 250 ml zimnego (4 °C) buforu lizatu S30 i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Bufor lizatu S30 służy do utrzymania stabilności białka po przeprowadzeniu lizy komórek przy użyciu homogenizatora w kroku 1.9. Począwszy od tego kroku naprzód, wszystkie kroki aż do wersji 1.12 powinny być wykonywane kolejno i szybko. 
	UWAGA: Przed przejściem do następnego kroku należy wstępnie schłodzić końcówki i 1,5-mililitrowe fiolki, które będą potrzebne do przechowywania lizatu</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie granulki razem w 15 ml zimnego buforu lizatu S30. Przefiltrować zawiesinę za pomocą gaziku. 
	UWAGA: 15 ml roztworu odpowiada minimalnej objętości homogenizatora. Należy zauważyć, że ważne jest również stężenie bakterii.</li>
	<li>Homogenizować pod ciśnieniem roboczym 15 000 psi, przy ciśnieniu powietrza 4 bary (dwa przejścia) w celu rozbicia komórek. Unikaj rozcieńczania roztworu, aby uzyskać bardziej skoncentrowany i aktywny lizat.</li>
	<li>Dodać 100 μl 0,1 M DTT (UWAGA) na 10 ml homogenizowanej zawiesiny.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 24 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj szybko następujący krok, aby zachować aktywność lizatu: podzielić supernatant jeden po drugim na 200 μl podwielokrotności we wstępnie schłodzonych fiolkach o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić je ciekłym azotem. Przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. 
	UWAGA: Naziemna telewizja cyfrowa jest klasyfikowana jako drażniąca i szkodliwa i dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lipidów w roztworze oleju
<ol>
	<li>Rozpuścić POPC i cholesterol w chloroformie (UWAGA) oddzielnie, każdy do końcowego stężenia 100 mg/ml. Wirować każdą fiolkę osobno.
	<ol>
		<li>Połącz składniki w szklanej fiolce o pojemności 2 ml: dodaj 50 μl POPC w chloroformie, 50 μl cholesterolu w chloroformie i 500 μl oleju mineralnego. Na 100 μl komórek syntetycznych potrzebne są 2 fiolki lipidów w oleju.</li>
		<li>Wirować, a następnie ogrzewać przez około 1 godzinę w temperaturze 80 °C w okapie chemicznym w celu odparowania chloroformu. Upewnij się, że nastąpiło całkowite odparowanie, postępując zgodnie z określonym czasem/warunkami i monitorując objętość roztworu. 
		UWAGA: Powstały roztwór lipidowy w oleju można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni. W celu poprawy wyników zaleca się stosowanie świeżego preparatu przed każdym eksperymentem. Proporcje lipidów i cholesterolu można zmieniać w zależności od pożądanego składu błony. Wysokie stężenie cholesterolu może prowadzić do tworzenia się agregatów w końcowym syntetycznym roztworze komórkowym. 
		UWAGA: Chloroform jest klasyfikowany jako drażniący i szkodliwy i dlatego należy go traktować ostrożnie i w miejscach z ekstrakcją oparów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów zewnętrznych, pre-wewnętrznych i żywieniowych
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów podstawowych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe wymienione w Tabeli 2 przy użyciu wody ultraczystej (UPW). 
		UWAGA: Roztwory podstawowe należy przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Odczynnik 7 ma tendencję do tworzenia agregatów. Podgrzanie do 37 °C zmniejszy agregację. Niewielka agregacja nie wpłynie znacząco na reakcję. Roztwór odczynnika 8 jest mleczny i mętny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie zewnętrzne
	<ol>
		<li>Rozpuścić glukozę wH2Owolnym od DNaz/RNaz do końcowego stężenia 200 mM.</li>
		<li>Na 100 μl roztworu wewnętrznego przygotować 1,6 ml roztworu zewnętrznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie wstępne
	<ol>
		<li>Dodać odczynniki 1-14 zgodnie z ilościami i stężeniem wymienionymi w tabeli 2. Na przykład, aby uzyskać końcową syntetyczną objętość komórek 100 μl, przygotuj 100 μl roztworu wewnętrznego. 
		UWAGA: Upłu upłu należy dodać, aby uzupełnić ostateczną wymaganą objętość. Na tym etapie mieszaninę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie do karmienia
	<ol>
		<li>Dodać wszystkie odczynniki zgodnie z ilościami i stężeniami podanymi w tabeli 3. 
		UWAGA: Użyj stosunku 1:1 roztworu do karmienia: roztwór wewnętrzny. Aby uzyskać końcową syntetyczną objętość komórek wynoszącą 100 μl, przygotuj 100 μl roztworu do karmienia. Zaleca się przygotowanie niewielkiej nadmiaru roztworu zewnętrznego, wewnętrznego i paszowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek syntetycznych
UWAGA: Następujące objętości są dostosowane do przygotowania 100 μL syntetycznych komórek.
<ol>
	<li>Syntetyczne komórki produkujące białko
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 15 ml umieść 12 ml roztworu zewnętrznego i powoli dodaj na wierzch warstwę 500 μl lipidów w roztworze oleju. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Aby sfinalizować przygotowanie roztworu wewnętrznego: wymieszać składniki roztworu wewnętrznego na kruszonym lodzie do końcowej objętości 100 μl, rozmrażając i dodając lizat S30-T7 (odczynnik 15) i plazmid DNA (odczynnik 16) do przechowywanej mieszaniny.</li>
		<li>Do drugiej szklanej fiolki o pojemności 2 ml z 500 μl lipidów w roztworze oleju dodać 100 μl roztworu wewnętrznego. Energicznie pipetuj w górę i w dół przez 1 minutę i wiruj przez kolejną minutę na poziomie piątym.
		<ol>
			<li>Inkubować przez 10 minut na kruszonym lodzie i powoli dodawać otrzymaną emulsję na wierzch fazy olejowej w probówce o pojemności 15 ml (z 4.1.1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 100 x g i 4 °C, a następnie wirować przez 10 minut przy 400 x g i 4 °C. Pod koniec wirowania należy zaobserwować osad na dnie probówki. 
		UWAGA: Preferowane jest tutaj użycie wahadłowego wirnika wirówki kubełkowej w celu uzyskania lepszego pokrycia drugiej warstwy lipidów podczas przechodzenia kropelek wody w oleju przez interfazę. W przypadku, gdy nie ma obserwowalnego osadu, prędkość wirowania można zwiększyć do 1000 x g. W przeciwnym razie zapoznaj się z sekcją Dyskusja odnoszącą się do ciężaru właściwego roztworu zewnętrznego.</li>
		<li>Wyciągnij osad.
		<ol>
			<li>Usuń nadmiar warstwy oleju.</li>
			<li>Użyj przyciętej końcówki pipety wypełnionej około 400 μl roztworu zewnętrznego, aby usunąć osad. Uwolnić zewnętrzny roztwór podczas przechodzenia przez fazę olejową, aby zebrać tylko osad w fazie wodnej.
			<ol>
				<li>Wytrzyj końcówkę po wyjęciu granulki, aby uniknąć przenoszenia resztek oleju i przenieś granulkę do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu zasilającego (stosunek 1:1 roztworu wewnętrznego do karmienia). 
		UWAGA: Również w tym przypadku można zastosować wirnik wirówki o stałym kącie nachylenia.</li>
		<li>W celu ekspresji białka inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C bez wstrząsania. 
		UWAGA: Optymalny czas inkubacji różni się w zależności od różnych białek.</li>
		<li>Ocenić ilość wyprodukowanego białka za pomocą odpowiedniej metody zgodnie z docelowymi właściwościami białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zalecane grupy kontrolne
	<ol>
		<li>Potwierdzenie roztworu wewnętrznego i aktywności lizatu
		<ol>
			<li>Przygotuj kompletny roztwór wewnętrzny (z DNA i lizatem S30-T7).</li>
			<li>Natychmiast inkubować powyższą reakcję za pomocą wytrząsarki z inkubatorem podłogowym o prędkości 250 obr./min lub termomieszalnika przy 1200 obr./min, w stałej temperaturze 37 °C przez 2 godz. 
			UWAGA: Dostosuj czas inkubacji, aby odpowiadał czasowi inkubacji komórek syntetycznych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ogniwa syntetyczne
		<ol>
			<li>Ujemna grupa kontrolna: Przygotować protokół przedstawiony w ppkt 4.1 z roztworem wewnętrznym bez DNA.</li>
			<li>Kontrola pozytywna: Przygotować protokół przedstawiony w ppkt 4.1 z roztworem wewnętrznym zawierającym plazmid T7 kodujący gen reporterowy. 
			UWAGA: Dodaj pozytywną grupę kontrolną składającą się z genu reporterowego, takiego jak sfGFP, wraz z grupami testowymi, aby zapewnić etap skuteczności enkapsulacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Blain, J. C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+toward+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Progress toward synthetic cells.</a> Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).</li>
<li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition%2C+asymmetry%2C+and+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).</li>
<li>Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+division+of+cell-sized+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanical division of cell-sized liposomes.</a> ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).</li>
<li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).</li>
<li>Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Inside+Liposomes%3A+From+Early+Studies+to+Current+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry-A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols.</a> Chemistry-A European Journal. , (2019).</li>
<li>Lewandowski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+peptide+synthesis+by+an+artificial+small-molecule+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine.</a> Science. 339 (6116), 189-193 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+economical+and+highly+productive+cell-free+protein+synthesis+system+utilizing+fructose-1%2C6-bisphosphate+as+an+energy+source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source.</a> Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+DNA+to+protein%3A+No+living+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).</li>
<li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+without+boundaries%3A+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+semi-synthetic+minimal+cells%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review.</a> Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
<li>Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+Context+Dependency+of+Gene+Networks+Using+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).</li>
<li>Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+by+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Design by directed evolution.</a> Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+beta+cells+for+fusion-mediated+dynamic+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).</li>
<li>Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((While-you-wait+proteins%3F+Producing+biomolecules+at+the+point+of+need%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).</li>
<li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Cells+Synthesize+Therapeutic+Proteins+inside+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).</li>
<li>Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+milligram+quantities+of+proteins+in+a+batch+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).</li>
<li>Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assembly+of+monodisperse+vesosomes+as+artificial+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).</li>
<li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447(2016).</li>
<li>Göpfrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Pot+Assembly+of+Complex+Giant+Unilamellar+Vesicle-Based+Synthetic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+synthetic+biology%22%5BJournal%5D)">One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells.</a> ACS synthetic biology. , (2019).</li>
<li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+display+for+in+vitro+selection+and+evolution+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).</li>
<li>Periasamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+of+membrane+%281%2C3%29-beta-d-glucan+%28curdlan%29+synthase%3A+co-translational+insertion+in+liposomes+and+reconstitution+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).</li>
<li>Kalmbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell-free+synthesis+of+a+seven+helix+membrane+protein%3A+in+situ+insertion+of+bacteriorhodopsin+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes.</a> Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+inside+giant+unilamellar+vesicles+analyzed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry.</a> Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).</li>
<li>Rampioni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cells+produce+a+quorum+sensing+chemical+signal+perceived+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa.</a> Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).</li>
<li>Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStano%2C+P+%22Biosynthesis+of+proteins+inside+liposomes%22">Biosynthesis of proteins inside liposomes</a>. , Humana Press. 127-145 (2010).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Krinsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+Method+for+Preparing+a+Cell-Free+Bacterial+Lysate+for+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis.</a> PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).</li>
<li>Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).</li>
<li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).</li>
<li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li>
<li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).</li>
<li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167(2017).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten wprowadza prostą i niedrogą metodę produkcji dużych ilości syntetycznych komórek produkujących białka. Wydajność aktywnych komórek zależy od starannego i dokładnego wykonania protokołu z naciskiem na kilka krytycznych etapów. W sekcji przygotowania lizatu tej metody konieczne jest osiągnięcie odpowiedniej gęstości bakterii przed lizą komórek, aby uzyskać wystarczającą ilość białek w lizacie bakteryjnym. Po drugie, proces lizy należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C, a lizat szybko zamrozić ciekłym azotem w ...

Syntetyczne komórki to sztuczne cząsteczki podobne do komórek, naśladujące jedną lub wiele funkcji żywej komórki, takich jak zdolność do podziału, tworzenia interakcji błonowych i syntezy białek na podstawie kodu genetycznego1,2,3. Komórki syntetyczne, które otaczają systemy bezkomórkowej syntezy białek (CFPS), mają wysoką modułowość ze względu na ich zdolność do wytwarzania różnych białek i sekwencji RNA po zmianach w matrycy DNA. Stanowiąc atrakcyjną alternatywę dla obecnych podejść do produkcji białek, systemy CFPS opierają się na lizacie komórkowym, oczyszczonych składnikach lub składnikach syntetycznych i obejmują wszystkie mechanizmy transkrypcji i translacji wymagane do syntezy białek, takie jak rybosomy, polimeraza RNA, aminokwasy i źródła energii (np. 3-fosfoglicerynian i trifosforan adeniny)4,5,6,7,8,9. Enkapsulacja systemu CFPS wewnątrz pęcherzyków lipidowych umożliwia prostą i wydajną produkcję białek bez zależności od żywej komórki10. Co więcej, platforma ta umożliwia syntezę peptydów, które mogą ulegać degradacji w naturalnych komórkach, produkcję białek, które są toksyczne dla żywych komórek, oraz modyfikację białek za pomocą nienaturalnych aminokwasów11,12. Komórki syntetyczne zostały wykorzystane jako model do celów badawczych badających minimalne składniki komórkowe wymagane do umożliwienia życia komórkowego z perspektywy ewolucyjnej1,13. Syntetyczne komórki były również wykorzystywane do budowy i implementacji obwodu genetycznego oraz jako modele ukierunkowanej ewolucji14,15,16. Inne badania koncentrowały się na zdolności komórek syntetycznych do naśladowania aktywności biologicznej komórek naturalnych, mając na celu zastąpienie uszkodzonych komórek naturalnych, takich jak komórki beta u pacjentów z cukrzycą17. Co więcej, zdolność tych CFPS hermetyzujących syntetyczne komórki do produkcji różnorodnych białek terapeutycznych ilustruje ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach klinicznych18.
Tutaj opisujemy oddolny protokół laboratoryjny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) do produkcji RNA i syntetycznych komórek produkujących białka w oparciu o system CFPS zamknięty w pęcherzyku lipidowym. Pokazuje to potencjalne zastosowanie syntetycznych platform komórkowych jako nowatorskich systemów dostarczania leków do produkcji terapeutycznego leku białkowego na miejscu in vivo19. Wcześniejsze badania dotyczyły optymalizacji reakcji CFPS i procesów przygotowania lizatu komórkowego4,8,20. Ponadto do przygotowania liposomów wielkości komórki zastosowano kilka technik, takich jak metody stabilizacji kropel na bazie mikroprzepływów i polimerów21,22,23, które różnią się również składem lipidowym liposomów24,25,26. W przedstawionym protokole komórki syntetyczne są wytwarzane metodą transferu emulsji woda w oleju, a proces enkapsulacji odbywa się w niskich temperaturach (<4 °C)5,10,24,27,28. Stwierdzono, że te łagodne warunki sprzyjają zachowaniu biofunkcjonalnej integralności maszynerii molekularnej, a mianowicie rybosomów i białek27,29,30. Skład lipidowy cząstek składa się zarówno z cholesterolu, jak i 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC). Pierwszy z nich znajduje się we wszystkich błonach komórkowych ssaków i jest niezbędny do zmniejszenia stabilności, sztywności i przepuszczalności błony, a drugi naśladuje skład fosfolipidów ssaków11,13. Molekularna maszyneria transkrypcji i translacji komórkowej jest ekstrahowana ze szczepu BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), który jest przekształcany za pomocą plazmidu pAR1219 z nadekspresją polimerazy T7 RNA w celu zwiększenia siły działania CFPS i syntezy białek. System ten został wykorzystany do produkcji białek diagnostycznych i terapeutycznych o masie cząsteczkowej do 66 kDa in vitro i in vivo19,31. Poniższy protokół zapewnia prostą i skuteczną metodę produkcji syntetycznego systemu komórkowego, który może odpowiedzieć na szeroki zakres podstawowych pytań związanych z syntezą białek w przyrodzie, a także może być wykorzystany do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

<table><tbody><tr><td>A. Odczynniki wymagane do etapu 1 (przygotowanie lizatu S30-T7)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli BL21 (DE3)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>E.coli BL21 (DE3).</td></tr><tr><td>pAR1219</td><td>Sigma</td><td>T2076</td><td>Wektor TargeTron do transformacji.</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy 50 mg/ml ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>przechowywany w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>10 g/L Baktootrypton</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Do przygotowania płytki agarowej Luria Bertani (LB) (1,5%).</td></tr><tr><td>10 g/L Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowych</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>15 g/L Agar agarowy oczyszczony</td><td>Merck</td><td>1.01614.5007</td><td></td></tr><tr><td>50 &mikro; g/ml Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>10 g/L Bakto-trypton</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Do przygotowania pożywki Luria Bertani (LB) (20 ml).</td></tr><tr><td>10 g/L Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowych</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>50 & mikro; g/ml Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>12 g/L Bakto-trypton</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Do przygotowania pożywki Terrific Bulth (TB) (1 L).</td></tr><tr><td>24 g/L Ekstrakt z drożdży bakto-drożdżowych</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>4% (v/v) Glicerol bezwodny</td><td>Bio-Lab</td><td>7120501</td><td></td></tr><tr><td>2,32 g/L K2HPO4</td><td>Spektrum chemiczne</td><td>P1383</td><td></td></tr><tr><td>12,54 g/L KH2PO4</td><td>Spektrum chemiczne</td><td>P1380</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 50 &mikro; g/ml Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy 100 mM &&beta;-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG)&nbsp;</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>Filtrowane za pomocą 0,2 i mikro; m hydrofilowy filtr strzykawkowy PVDF.</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy 0,1 M ditiotreitolu (DTT)&nbsp;</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td>Filtrowane przy użyciu 0,2 i mikro; m hydrofilowy filtr strzykawkowy PVDF.</td></tr><tr><td>10 mM octan trisu przy pH = 7,4</td><td></td> Gürgen <td>Légétă T1503</td><td>S30 bufor lizatu (1,5 l)</td></tr><tr><td>14 mM octan magnezu</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td></td></tr><tr><td>60 mM octan potasu</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL/L 2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt wymagany do kroku 1</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml sterylizowane kolby Erlenmeyera</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-154-2846</td><td>2 kolby</td></tr><tr><td>2 L sterylizowane kolby Erlenmeyera z przegrodami</td><td>KIMAX-KIMBLE</td><td>25630</td><td>2 kolby</td></tr><tr><td>Wytrząsarka podłogowa</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>Wytrząsarka laboratoryjna 450x450mm, 400 obr./min, 70 stopni; </td></tr><tr><td>C Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003340) - Rotor o stałym kącie nachylenia Fiberlite F10-6 x 100 LEX. Powinien umożliwiać co najmniej 13 000 x g.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; * Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.</td></tr><tr><td>-80oC zamrażarka</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane plastikowe probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Najlepiej wstępnie schłodzone do -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>TECAN</td><td>IN-MNANO</td><td>Infinite M200 pro</td></tr><tr><td>96-dołkowa przezroczysta płytka</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowany cylinder z podziałką</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane probówki wirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Najlepiej wstępnie schłodzone do -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sterylizowane końcówki do pipet</td><td>Corning</td><td></td><td>Najlepiej wstępnie schłodzone do -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Wiadro na kruszony lód</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mały zbiornik ciekłego azotu</td><td>NALGENE</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>B. Odczynniki wymagane w kroku 3 (lipidy w przygotowaniu roztworu oleju):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Lipoid</td><td>556400</td><td>Cholesterol</td></tr><tr><td></td><td>w proszku Sigma</td><td>C8667</td><td>Chloroform w proszku</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Lab</td><td>3082301</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>Lekki olej</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt wymagany do kroku 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Przemysł naukowy</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>TECHNE</td><td>FDB03AD</td><td>Wstępnie podgrzany do 80 stopni C. Powinien umożliwiać kontrolowaną temperaturę.&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml szklane fiolki z zakręcaną szyjką</td><td>CSI Innowacje analityczne</td><td>VT009M-1232</td><td>Aby uzyskać większą skalę, użyj sokołów o pojemności 50 ml i odparuj chloroform za pomocą wyparki obrotowej.</td></tr><tr><td>Zakrętka 9mm</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>C395R-09LC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>C. Odczynniki wymagane do kroku 3 (mieszaniny reakcyjne wewnętrzne i zasilające):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Spectrum</td><td>H1089</td><td>1 M HEPES-KOH (pH = 8) - bufor pH</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Frutarom</td><td>55290</td><td></td></tr><tr><td>1 M Octan magnezu</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td>Kofaktor i stabilizor ładunku ujemnego.</td></tr><tr><td>1 M octan potasu</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td>Stabilizor ładunku ujemnego.</td></tr><tr><td>5,2 M octan amonu</td><td>Merck</td><td>1.01116.1000</td><td>Stabilizuje ładunek ujemny.</td></tr><tr><td>50% (w/v) Glikol polietylenowy 6000 (PEG)</td><td>Merck</td><td>8.07491.1000</td><td>Zwiększa stężenie makrocząsteczek.</td></tr><tr><td>0,5 M 3-fosfoglicerynian (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td>Wtórne źródło energii.</td></tr><tr><td>50 mM Mieszanina aminokwasów I</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>Dodatek aminokwasów. Zawiera: 50 mM każdego z następujących 17&nbsp; naturalnych aminokwasów - alaniny, argininy, asparaginy, kwasu asparaginowego, cysteiny, glutaminy, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, proliny, seryny, treoniny i waliny.</td></tr><tr><td>50 mM Mieszanina aminokwasów II</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>Dodatek aminokwasowy. Zawiera: 50 mM każdego z następujących 3 naturalnych aminokwasów - tryptofanu, fenyloalaniny i tyrozyny.</td></tr><tr><td>100 mM trifosforan adeniny (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A3377</td><td>Nukleotydy i źródło energii.</td></tr><tr><td>50 mM trifosforan guanidyny (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>Nukleotydy i źródło energii.</td></tr><tr><td>100 mM trifosforan urydyny (UTP)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>226310010</td><td>Dodatek nukleotydów.</td></tr><tr><td>100 mM Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>Indukcja ekspresji genów.</td></tr><tr><td>2 M Sacharoza</td><td>J.T. Baker</td><td>1933078</td><td>Generowanie gradientu gęstości.</td></tr><tr><td>2 M Glucose</td><td>Sigma</td><td>16301</td><td>Generowanie gradientu gęstości.</td></tr><tr><td>H2O Ultraczysta woda (UPW)</td><td>Bio-Lab</td><td>2321777500</td><td>DNaza i </td></tr><tr><td>Lizat S30-T7</td> wolny od RNazy<td>_</td><td>_</td><td>Przygotowany w kroku 1.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Źródło transkrypcji & komponenty tłumaczeniowe. Przechowywać pod kątem -80 stopni; c, rozmrozić na rozbitym lodzie tuż przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zapas plazmidu DNA do wyboru</td><td>_</td><td>_</td><td>Zawiera sekwencję żądanego białka. Pod promotorem T7</td></tr><tr><td>D. Sprzęt wymagany do kroku 4 (przygotowanie komórek syntetycznych)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka podłogowa lub Thermomixer</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>Wytrząsarka laboratoryjna 450x450mm, 400 obr./min, 70 & C</td></tr><tr><td>PHMT Grant Bio&nbsp;</td><td>PSC18</td><td>Wirówka do termomieszalnika</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003629) - TX-400 4 x 400 ml Wahadłowy wirnik kubełkowy. Nadaje się do probówek o pojemności 15 ml. Najlepiej wiadra wahadłowe. Powinny umożliwiać co najmniej 1000 x g. Wstępnie schłodzone do 4 & stopni C.</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td>(75003424) - rotor 24 x 1,5/2,0 ml z ClickSeal. Nadaje się do fiolek Eppendorf. Wstępnie schłodzony do 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Przemysł naukowy</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na kruszony lód</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>2 ml szklane fiolki z zakręcaną szyjką</td><td>CSI Innowacje analityczne</td><td>VT009M-1232</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe probówki 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane plastikowe probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane końcówki do pipet</td><td>Corning</td><td></td><td>Sterylizowane w autoklawie.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Podejście do montażu oddolnego do budowy syntetycznych komórek jest skutecznym narzędziem do izolowania i badania procesów komórkowych w środowisku naśladującym komórki. Co więcej, opracowanie bezkomórkowych systemów ekspresji wykazało zdolność do odtwarzania procesów produkcji, transkrypcji i translacji białek (DNA→RNA→białko) w kontrolowany sposób, wykorzystując biologię syntetyczną. Tutaj opisujemy protokół przygotowania bezkomórkowego systemu ekspresji, w tym produkcji silnego lizatu bakteryjnego i kapsułkowania tego lizatu w bogatych w cholesterol gigantycznych pęcherzykach unilamelarnych na bazie lipidów (GUV) (tj. stabilnych liposomów), w celu utworzenia komórek syntetycznych. W protokole opisano metody przygotowania składników komórek syntetycznych, w tym produkcję aktywnych lizatów bakteryjnych, a następnie szczegółowe przygotowanie komórek syntetycznych krok po kroku w oparciu o metodę transferu emulsji woda w oleju. Ułatwiają one produkcję milionów syntetycznych komórek w prosty i niedrogi sposób, przy zachowaniu dużej wszechstronności w produkcji różnych rodzajów białek. Uzyskane syntetyczne komórki mogą być wykorzystane do badania produkcji i aktywności białek/RNA w izolowanym środowisku, w ukierunkowanej ewolucji, a także jako platforma kontrolowanego dostarczania leków do produkcji białek terapeutycznych na żądanie wewnątrz organizmu.

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych komórek poprzez enkapsulację systemu CFPS S30-T7 opartego na E. coli BL21 wewnątrz pęcherzyków lipidowych. Schematyczny opis procesu przygotowania, zawierający obraz każdego etapu, zaprezentowano na Rysunku 2. Sukces procesu przygotowania syntetycznych komórek zależy od prawidłowego przeprowadzenia każdego etapu i jest wypadkową różnych parametrów. Protokół należy dostosować w zależności od produkcji konkretnego białka.
<p class...

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Komórki syntetyczne produkujące białka stanowią wszechstronną platformę do badania początków życia, a także terapii opartych na komórkach syntetycznych do zaawansowanego dostarczania leków. Metoda ta jest prosta i niedroga do ekspresji RNA i białek i może być stosowana do produkcji białek terapeutycznych na miejscu bezpośrednio w organizmie. Systemy te mogą być stosowane w leczeniu szerokiego zakresu chorób, od chorób metabolicznych i zamienników białek po raka i prawdopodobnie cukrzycę.Ten wieloetapowy protokół ma zdefiniowany punkt zatrzymania. Wykonując go po raz pierwszy, zaleca się podzielenie pracy na kilka dni. Protokół syntetycznej produkcji komórek rozpoczyna się od przygotowania bezkomórkowego lizatu S30-T7.Następnie przygotowuje się lipidy błonowe i komórkowy roztwór odżywczy, aby symulować środowisko wewnętrzne i wspierać produkcję białek. Ostatnim krokiem jest przygotowanie samych syntetycznych komórek. Przygotuj zduplikowane kultury starterowe w 100-mililitrowych kolbach Erlenmeyera.Do każdej kolby dodać pięć mililitrów pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny i zaszczepić pojedynczą kolonią E. coli. Hoduj kulturę przez noc w wytrząsarce inkubatora podłogowego z prędkością 250 obr./min i 37 stopniami Celsjusza. Następnie przygotuj dwulitrowe kolby Erlenmeyera z przegrodami zawierające 500 mililitrów pożywki gruźliczej uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Zaszczepić każdą dwulitrową kolbę pięciomililitrową kulturą starterową. Umieścić kolby w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min i 37 stopniami Celsjusza. Okresowo monitorować kultury za pomocą spektrofotometru i hodować kultury do OD600 między 0,8 a jeden.Aby indukować ekspresję polimerazy RNA T7, dodaj do każdej kolby trzy mililitry 100 milimolowego IPTG, aby osiągnąć 0,6 milimola. Kontynuuj uprawę kultur, aż OD600 osiągnie około czterech. Gdy kultury osiągną pożądaną gęstość optyczną, przenieś zawiesinę z każdej kolby Erlenmeyera do dwóch 250 mililitrowych sterylizowanych probówek wirówkowych.Odwirować probówki o ciśnieniu 7 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. W razie potrzeby ponownie zawiesić każdą granulkę w 250 mililitrach zimnego buforu lizatu S30 za pomocą mieszadła.Wirować w temperaturze 7 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś wszystkie granulki razem w 15 mililitrach zimnego buforu lizatu S30. Przefiltrować zawiesinę za pomocą gazików.Przed przejściem do następnego kroku należy wstępnie schłodzić końcówki w 1,5-mililitrowych fiolkach, które będą potrzebne do przechowywania lizatu. Zawiesinę homogenizować dwukrotnie. Użyj ciśnienia roboczego 15 000 PSI przy ciśnieniu powietrza wynoszącym cztery bary do uszkodzenia komórek.Zebrać homogenat. Dodać 100 mikrolitrów 0,1 molowego DTT na 10 mililitrów homogenizowanej zawiesiny. Odwirować zawiesinę w temperaturze 24 700 g po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Naziemna terapia cyfrowa (DTT) i chloroform są klasyfikowane jako drażniące i szkodliwe, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Chloroform stosowany w dalszej części protokołu musi być stosowany w obszarze, w którym odbywa się ekstrakcja dymów. Aby zachować aktywność lizatu, wykonaj ten krok szybko.Umieść 200 mikrolitrów podwielokrotności supernatantu we wstępnie schłodzonych fiolkach i natychmiast zamroź je ciekłym azotem. Przechowywać fiolki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Oddzielnie rozpuścić POPC i cholesterol w chloroformie do końcowego stężenia 100 miligramów na mililitr.Wirować każdą fiolkę osobno. Połącz składniki w szklanej fiolce o pojemności dwóch mililitrów. Dodać 50 mikrolitrów roztworu cholesterolu i chloroformu, 50 mikrolitrów roztworu chloroformu POPC i 500 mikrolitrów oleju mineralnego.Wirować fiolkę, a następnie, aby odparować chloroform, podgrzewać ją przez około godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza w kapturze chemicznym. Przed rozpoczęciem etapu produkcji komórek syntetycznych należy przygotować roztwory zewnętrzne, wstępne i zasilające zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie umieść 1,2 mililitra roztworu zewnętrznego w 15-mililitrowej probówce i powoli dodaj warstwę 500 mikrolitrów roztworu lipidów w oleju z pierwszej szklanej fiolki.Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Aby sfinalizować przygotowanie roztworu wewnętrznego, wymieszać na lodzie do końcowej objętości 100 mikrolitrów, dodając lizat S30-T7 i plazmid DNA. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu wewnętrznego z lizatem i plazmidem do drugiej dwumililitrowej szklanej fiolki z 500 mikrolitrami roztworu lipidów w oleju.Energicznie pipetuj w górę i w dół przez jedną minutę, a następnie wiruj przez kolejną minutę na poziomie piątym. Po inkubacji powstałej emulsji przez 10 minut na kruszonym lodzie, powoli dodaj emulsję na wierzch fazy olejowej w 15-mililitrowej probówce. Wirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 100 razy g i czterech stopniach Celsjusza.Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 400 razy g i czterech stopniach Celsjusza. Pod koniec wirowania na dnie probówki powinien być widoczny osad. Aby wydobyć granulkę, najpierw usuń nadmiar warstwy oleju.Następnie załaduj przyciętą końcówkę pipety około 400 mikrolitrami roztworu zewnętrznego i użyj końcówki pipety do zebrania osadu, uwalniając zewnętrzny roztwór, gdy końcówka pipety przechodzi przez fazę olejową. Wytrzyj końcówkę pipety i przenieś granulkę do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować osad przez 10 minut w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach roztworu zasilającego. W celu ekspresji białka inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Plazmidy eksprymujące modelowe białko sfGFP i lucyferazy Renilla wprowadzono do bezkomórkowej syntezy białek, reakcji masowych CFPS i komórek syntetycznych.Produkcję białka oceniano przy użyciu kilku metod. Analiza Western blot wykryła produkcję sfGFP His6 zarówno w reakcjach masowych CFPS, jak i w komórkach syntetycznych. Oczyszczony sfGFP His6 zastosowano jako kontrolę pozytywną.Mikroskop fluorescencyjny z jasnym polem i filtrem GFP pokazuje syntetyczne komórki, które wytwarzają sfGFP. Do analizy komórek syntetycznych wytwarzających sfGFP wykorzystano cytometrię przepływową. Obliczenia aktywnej populacji komórek syntetycznych oparto na progu intensywności fluorescencji sfGFP określonym przez ujemną próbkę DNA reprezentowaną przez czerwony histogram.Średnią intensywność fluorescencji komórek syntetycznych wytwarzających sfGFP obliczono na podstawie aktywnej populacji komórek syntetycznych i znormalizowano do ujemnej próbki DNA. Rozkłady średnic aktywnych ogniw syntetycznych obliczono na podstawie sygnału sfGFP. Aktywność lucyferazy Renilla określono ilościowo za pomocą pomiarów luminescencji.Metoda ta jest bardzo wszechstronna i może być zoptymalizowana dla różnych białek docelowych poprzez zmianę pochodzenia lizatu, składu lipidów i stężeń roztworu wewnętrznego. Analiza FACS komórek syntetycznych wytwarzających białko markerowe fluorescencyjne może być przeprowadzona w celu uzyskania wartości ilościowej frakcji aktywnych komórek syntetycznych. Analiza Western blot mierzyłaby produkcję białka.

preparing-protein-producing-synthetic-cells-using-cell-free-bacterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu ekstraktu z surowych komórek bakteryjnych

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj metodę przygotowania syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych S30-T7 i transferu emulsji woda-w-oleju. Ta technika umożliwia ekspresję RNA i białek w celach terapeutycznych.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Przeglądaj więcej filmów