Dostarczanie zmodyfikowanego mRNA w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Zmodyfikowane RNA to nowatorska metoda transferu genów do serca i innych narządów. Protokół ten zapewni dokładne podejście do dostarczania pożądanych genów przejściowo do serca po zawale mięśnia sercowego. Metoda ta nie ogranicza się do zawału mięśnia sercowego, ale może być również stosowana w modelach reperfuzji niedokrwiennej i poprzecznego zwężenia aorty.

Zmodyfikowane RNA jest wykorzystywane w kilku badaniach klinicznych na ludziach. Nie ma jednak ustandaryzowanego protokołu transferu genu do serca za pomocą tej metody. Demonstracja wizualna umożliwi naukowcom prawidłowe wstrzyknięcie zmodyfikowanego RNA w odpowiednie miejsca w sercu.

Uczestnicy projektu zademonstrują Ajit Magadum, adiunkt oraz Elena Chepurko, opiekunka zwierząt z naszego laboratorium. Na podstawie stężenia wcześniej przygotowanego w modRNA oblicz objętość modRNA potrzebną do wstrzyknięcia 100 mikrogramów. Wytwarza równe objętości roztworów sacharozy i cytrynianu.

Następnie dodaj obliczoną objętość modRNA i tyle roztworu soli fizjologicznej, aby doprowadzić objętość wstrzyknięcia do 60 mikrolitrów. Po znieczuleniu zwierzęcia należy je umieścić brzuszną stroną do góry, z pyskiem skierowanym w stronę eksperymentatora. Następnie, aby utrzymać otwarte drogi oddechowe poprzez wykonanie intubacji dotchawiczej, delikatnie wyciągnij język.

Dostosuj kąt nachylenia szyi, aby wyprostować ścieżkę intubacji, i wepchnij kaniulę intubacyjną. Obserwuj ruch klatki piersiowej myszy, aby sprawdzić, czy oba płuca otrzymują tlen. Częstość oddechów powinna wynosić około 120 oddechów na minutę.

Aby rozpocząć podwiązanie LAD, ostrożnie obróć mysz na prawy bok. Podnieś skórę i wykonaj torakotomię lewostronną między trzecim a czwartym żebrem. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową, nie dotykając płuc żadnymi ostrymi przedmiotami.

Umieść retraktory w nacięciu, aby jama klatki piersiowej była otwarta, zapewniając wyraźny widok serca. Następnie przesuń płuca do krawędzi nacięcia i usuń część worka osierdziowego, która pokrywa serce. Ostrożnie zidentyfikuj LAD, ciemnoczerwone naczynie, znajdujące się między tętnicą płucną a lewą małżowiną uszną.

Podwiązać proksymalny LAD za pomocą pojedynczego szwu jedwabnego. Za pomocą strzykawki insulinowej dostarcz łącznie 60 mikrolitrów roztworu modRNA do serca. Wstrzyknąć 20 mikrolitrów domięśniowo, w trzech różnych miejscach.

Po jednym miejscu z każdej strony podwiązania i jednym w wierzchołku serca. Najlepszym sposobem na wstrzyknięcie zmodyfikowanego RNA w odpowiednie miejsca, jest obserwacja przebarwień tkanki pod mikroskopem, po zamknięciu LAD. Również po wstrzyknięciu nie należy wchodzić zbyt głęboko w tkankę, aby dotrzeć do komór serca do krążenia.

Zamknij nacięcie klatki piersiowej warstwami. Pierwszym zastosowaniem były jedwabne szwy biegowe 6-0 w celu dostosowania żeber. Następnie użyj jedwabnych szwów biegowych 5-0, aby zamknąć skórę.

W fazie rekonwalescencji wyjmij kaniulę i pozwól na spontaniczne oddychanie. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aż odzyska przytomność. Nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie zostanie całkowicie rozbudzone.

Aby poradzić sobie z bólem pooperacyjnym, buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w odstępach 12-godzinnych przez trzy dni. W dawce 0,1 miligrama na kilogram masy ciała. 24 godziny po ligacji LAD i wstrzyknięciu modRNA lucyferazy myszom CFW, transfekcję zwalidowano, sprawdzając ekspresję białka lucyferazy za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego.

Sygnał lucyferazy można wyraźnie wykryć na obrazach porównujących myszy kontrolne z myszami, którym wstrzyknięto modRNA lucyferazy. Kwantyfikacja sygnału lucyferazy wykazuje znacznie wyższą ekspresję białka u leczonych myszy niż u myszy kontrolnych. Ekspresję Cre modRNA zwalidowano, sprawdzając jego translację i dystrybucję biologiczną u transgenicznych myszy mTmG ROSA26.

24 godziny po operacji i wstrzyknięciu cre modRNA, ARTS zostały utrwalone i przetworzone do barwienia immunologicznego za pomocą markera kardiomiocytów, troponiny sercowej I i markera jąder DAPI. Udana ekspresja cre była widoczna ze względu na pojawienie się kardiomiocytów o zielonym kolorze. Scalony obraz pokazuje komórki aktywowane cre wokół dwóch widocznych miejsc wstrzyknięcia.

Niebieski to plama jądrowa DAPI. Zmodyfikowana platforma RNA może dostarczyć pojedynczy gen lub kombinacje genów w różnych narządach. A co za tym idzie, może być stosowany w celach terapeutycznych, takich jak korygowanie zaburzeń genetycznych lub aktywacja korzystnych mechanizmów w organizmie.

Unikalna farmakokinetyka zmodyfikowanego RNA pozwala nam ocenić funkcję genu natychmiast po jego wstrzyknięciu. Dzięki temu badacz może skupić się na szlakach sygnałowych, które są zmieniane w ciągu pierwszych kilku godzin po zawale.