Name: Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Naucz się techniki in situ perfuzji dolnych narządów jamy brzusznej u myszy w obiegu zamkniętym. Metoda umożliwia badanie dostarczania leków i interakcji immunologicznych w tkankach bez ograniczeń metod ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez CA194058 grantu NIH dla DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (grant nr 31771093), projekt współpracy międzynarodowej prowincji Jilin (nr 201180414085GH), fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych, program dla innowacyjnego zespołu badawczego JLU Science and Technology (2017TD-27, 2019TD-36).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado (IACUC).
1. Podgrzej system perfuzyjny
<ol>
	<li>Przygotuj system perfuzyjny przed operacją, uruchamiając kąpiel w wodzie obiegowej o temperaturze 37 °C dla wszystkich elementów z płaszczem wodnym (zbiornik perfuzyjny, komora wilgoci i pokrywa), jak pokazano w niestandardowej konfiguracji w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Upewnij się, że rurka jest czysta i wymień w razie potrzeby. Aby ograniczyć objętość perfuzatu, użyj pułapki bąbelkowej w wilgotnej komorze jako zbiornika perfuzatu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B-6).</li>
</ol>
2. Cewnikowanie naczyniowe
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie u 8-10-tygodniowej myszy BALB/c za pomocą urządzenia do znieczulenia weterynaryjnego izofluranu z 3-5% izofluranem i natężeniem przepływu tlenu 0,3 l/min. Alternatywnie należy zastosować ketaminę/ksylazynę lub inny rodzaj znieczulenia dootrzewnowego. Oceń głębokość znieczulenia 2 metodami: szczypanie palców u nóg i odruch rogówkowy.</li>
	<li>Wstępnie zwilż jedwabny szew 4-0 z igłą w podwójnie destylowanej wodzie.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na styropianowej desce z głową skierowaną w stronę chirurga i unieruchamij kończyny przednie i tylne taśmą. Przetrzyj brzuch alkoholem izopropylowym i przetnij brzuch wzdłuż linii środkowej w kształcie litery "T" nożyczkami. Zatrzymać krwawienie wokół krawędzi nacięcia przez elektrokoagulację (kauteryzację).</li>
	<li>Wypchnij żołądek, jelito czcze i okrężnicę na prawą stronę brzucha, aby odsłonić aortę brzuszną, żyłę główną oraz tętnice i żyły biodrowe i biodrowo-lędźwiowe wspólne.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym znajdź i podwiąż tętnicę/żyłę biodrowo-lędźwiową u mężczyzny oraz tętnicę/żyłę jajnika i tętnicę/żyłę biodrowo-lędźwiową u kobiety za pomocą jedwabnych szwów 4-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 żółte linie).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym zawiąż dwa jedwabne szwy 4-0 pod aortą brzuszną i żyłą główną dolną (około 1 cm powyżej tętnicy biodrowej i żyły biodrowej, w odległości 1 mm od siebie, <silna klasa = "xfig" >Ryc. 2) i wykonaj luźny węzeł w szwie najbliżej naczyń biodrowych (<silna klasa = "xfig" >Rycina 2, biała przerywana linia). Alternatywnie do tego węzła można użyć jedwabnego szwu 6-0.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wyrównaj poziomo i rozciągnij zarówno żyłę główną dolną, jak i aortę brzuszną za pomocą porte-aiguille. Użyj cewnika dożylnego 24 G ze skrzydłami, aby nakłuć aortę brzuszną, naciśnij przycisk, aby cofnąć rdzeń igły i wprowadź cewnik na około 5 mm do naczynia.
	<ol>
		<li>Powtórz tę samą procedurę z żyłą główną dolną i zawiąż węzły obu szwów wokół cewnikowanych naczyń. 
		UWAGA: Igła może łatwo przebić się przez naczynie krwionośne; Dlatego utrzymuj naczynia rozciągnięte i igłę równolegle do naczynia. Wycofać rdzeń igły, gdy tylko igła wbije się na około 1 mm w naczynie. Aorta brzuszna znajduje się pod żyłą główną dolną i jest znacznie cieńsza i bardziej elastyczna, ponieważ jest otoczona tkanką łączną. Dlatego aorta może "trzymać się" cewnika i dlatego powinna być cewnikowana przed żyłą główną, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wysunięcia się cewnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż klej błyskawiczny, aby unieruchomić cewniki do prostownika grzbietu, wymienić narządy jamy brzusznej i zakończyć operację, zachowując znieczulenie. 
	UWAGA: Narządy, których nie można całkowicie zastąpić w jamie brzusznej, będą musiały być okresowo nawilżane środkiem perfuzyjnym podczas procesu perfuzji.</li>
</ol>
3. Konfiguracja systemu perfuzji
<ol>
	<li>Przenieść mysz do wilgotnej komory z płaszczem wodnym, rozgrzanej do temperatury 37 °C na podkładce silikonowej i unieruchomić skrzydełka cewnika do podkładki za pomocą igieł 19 G.</li>
	<li>Napełnij koniec (wlot) cewnika tętniczego wstępnie podgrzanym buforem perfuzyjnym (roztwór mleczanu Ringera uzupełniony 5% BSA), a następnie połącz koniec cewnika z rurką perfuzyjną wlotową za pomocą przykręcanego łącznika (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B, czerwona strzałka). 
	UWAGA: Przytrzymaj złącze kleszczami hemostatycznymi i unieruchom rurkę taśmą, aby uniknąć przesuwania cewników.</li>
	<li>Dostosuj natężenie przepływu perystaltycznego do 0,6 ml / min i utrzymuj odpływ perfuzji (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B, niebieska strzałka) otwarty przez 5-10 minut, aby wypłukać krew przez cewnik żylny. W cewniku wylotowym pojawią się skrzepy; Wypłukać skrzepy buforem perfuzyjnym przed zamknięciem obwodu perfuzyjnego.</li>
	<li>Połącz koniec cewnika żylnego z rurką wylotową za pomocą przykręcanego złącza, aby zamknąć obwód (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). W tym momencie należy przeprowadzić eutanazję gazem CO2 i zweryfikować przez nakłucie klatki piersiowej lub inną metodę.</li>
	<li>Przykryj wilgotną komorę podgrzaną pokrywką. Okresowo sprawdzaj poziom perfuzatu i w razie potrzeby dodawaj więcej. Perfuzję można wykonywać do 2 godzin. 
	UWAGA: 5 ml perfuzatu będzie potrzebne do ustawienia zamkniętego systemu perfuzji. Jeśli nie ma wycieku ani obrzęku, objętość perfuzatu zmniejszy się o mniej niż 1 ml i dodatkowy bufor nie będzie potrzebny. Aby uniknąć obrzęku wywołanego przez skrzeplinę krążącą obwodowo, bufor perfuzyjny zawierający 0,002% heparyny można zastosować w ciągu pierwszych 10 minut perfuzji, ale należy go zmienić na bufor bez heparyny, aby uniknąć wycieku na krawędzi nacięć.</li>
	<li>W razie potrzeby dodaj wybrany odczynnik do zbiornika perfuzyjnego lub do portu iniekcyjnego w dowolnym momencie (Rysunek 1B-5). Na przykład 10 μl 10 mg/ml Hoechst33342 można dodać do perfuzatu w celu wybarwienia jąder komórkowych na 2 godziny przed końcem perfuzji lub 50 μl 1 mg/ml lektyny DyLight 649 w celu wybarwienia komórek śródbłonka naczyń krwionośnych 30 minut przed końcem perfuzji. 
	UWAGA: W przypadku próby barwienia szpiku kostnego roztworem Hoechst, myszy będą musiały zostać wstępnie wstrzyknięte 30 minut przed zabiegiem.</li>
	<li>Po perfuzji z odczynnikami fluorescencyjnymi przemyć buforem perfuzyjnym przez kolejne 10 minut, aby zminimalizować fluorescencję tła.</li>
</ol>
4. Analiza perfuzji narządów
<ol>
	<li>Zbierz narządy, w tym jądra, prostatę, pęcherz moczowy, kość udową, mięśnie i skórę (np. stopy). Wyciąć kawałek narządu na około 1 mm3 i spłaszczyć między dwoma szkiełkami.
	<ol>
		<li>Badania pod odwróconym fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym z wykorzystaniem filtrów wzbudzenia i emisji DAPI/Cy5 (lasery wzbudzające: DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Użyj obiektywu z co najmniej 200-krotnym powiększeniem i aperturą numeryczną 0.45.</li>
		<li>Alternatywnie, utrwalić narządy 4% roztworem formaldehydu przez 24 godziny i wykonać barwienie hematoksyliną-eozyną19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby stworzyć okienko kostne do obserwacji nienaruszonego szpiku kostnego, unieruchomij oba końce kości udowej lub piszczelowej i zeskrob kość korową boczną krawędzią igły 19 G, aby odsłonić okostną; należy zachować cienką warstwę resztkowej kości. Umieść kość na szkiełku nakrywkowym z oknem skierowanym w stronę szkła i zobrazuj za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego przy użyciu kanałów DAPI i Cy5, jak opisano powyżej. Komórki i sieć naczyniową w jamie szpiku kostnego można łatwo zaobserwować.</li>
</ol>

<ol><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Kabagambe, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Ex+vivo+Hypothermic+and+Normothermic+Perfusion+for+Assessment+of+High-risk+Deceased+Donor+Human+Kidneys+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation.</a> Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).</li>
<li>Knaak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+subnormothermic+ex+vivo+liver+perfusion+for+the+storage%2C+assessment%2C+and+repair+of+marginal+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).</li>
<li>Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+in+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis in the perfused rat liver.</a> Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).</li>
<li>Nielsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+increases+water+permeability+of+kidney+collecting+duct+by+inducing+translocation+of+aquaporin-CD+water+channels+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Schreiter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+perfusion+system+emulating+in+vivo+conditions+in+noncirrhotic+and+cirrhotic+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors%3A+effect+of+hematocrit+on+intratumor+blood+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.</a> Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).</li>
<li>Duyverman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+tumor+perfusion+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An isolated tumor perfusion model in mice.</a> Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).</li>
<li>Sears, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+a+tumor-containing+colon+with+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody.</a> J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).</li>
<li>Duda, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+cells+facilitate+lung+metastasis+by+bringing+their+own+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).</li>
<li>Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+reduces+the+interstitial+fluid+pressure+in+a+human+colon+adenocarcinoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft.</a> Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors+perfused+ex+vivo%3A+effects+of+tumor+size+and+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure.</a> Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).</li>
<li>Zhang, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Maintenance+of+Primary+Human+Multiple+Myeloma+Cells+through+the+Optimization+of+the+Osteoblastic+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+flow+chamber+for+engineering+bone+marrow+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function.</a> Biomaterials. 146, 60-71 (2017).</li>
<li>Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+isolated+limb+infusion+model+for+investigation+of+drug+delivery+kinetics+to+solid+tumors+by+thermosensitive+liposomes+and+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).</li>
<li>Tietjen, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+targeting+to+the+endothelium+during+normothermic+machine+perfusion+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys.</a> Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).</li>
<li>Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+human+skin+flap+model%3A+A+missing+link+in+skin+penetration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).</li>
<li>Hekman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Dual-Modality+Imaging+in+Renal+Cell+Carcinoma%3A+An+Ex+vivo+Kidney+Perfusion+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study.</a> Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).</li>
<li>Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+the+study+of+tumor+metabolism+by+nuclear+magnetic+resonance%3A+characterization+of+the+phosphorus-31+spectrum+of+the+isolated+perfused+Morris+hepatoma+7777%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777.</a> Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany obwód może być wykorzystany do zgłębienia różnych pytań badawczych, na przykład roli różnych składników surowicy i barier tkankowych w dostarczaniu leków, czy też o transport komórek immunologicznych i macierzystych. Do perfuzatu można dodać różne systemy dostarczania leków (np. liposomy i nanocząstki) w celu zrozumienia roli czynników fizjologicznych i biochemicznych w dostarczaniu. Czas trwania perfuzji może się różnić w zależności od badanej tkanki, celów naukowych i składu perfuzatu. Prezentujemy tutaj wyniki...

Izolowana perfuzja narządów została pierwotnie opracowana do badania fizjologii narządów do transplantacji1,2,3, i umożliwiła zrozumienie funkcji organów bez ingerencji ze strony innych układów ciała. Na przykład izolowana perfuzja nerek i serca była niezwykle przydatna w zrozumieniu podstawowych zasad hemodynamiki i działania czynników wazoaktywnych, podczas gdy perfuzja wątroby była ważna dla zrozumienia funkcji metabolicznej, w tym metabolizmu leków w zdrowych i chorych tkankach4,5,6,7. Ponadto badania perfuzji miały kluczowe znaczenie dla zrozumienia żywotności i funkcji narządów przeznaczonych do przeszczepów. W Cancer Researchearch, izolowana perfuzja guza została opisana przez kilka grup przy użyciu myszy, szczurów i świeżo wyciętych tkanek ludzkich8,9. W przypadku niektórych izolowanych perfuzji guzów, guz został wszczepiony w poduszeczkę tłuszczową jajnika, aby wymusić wzrost guza zaopatrującego naczynia krwionośne z tętnicy krezkowej10. Grupa dżinistyczna przeprowadziła pionierskie badania z wykorzystaniem izolowanej perfuzji gruczolakoraków jelita grubego, aby zrozumieć hemodynamikę guza i przerzuty8,11,12,13. Inne innowacyjne konfiguracje zaprojektowane ex vivo obejmują 96-dołkowe urządzenie perfuzyjne oparte na płytce do hodowli pierwotnych ludzkich komórek szpiczaka mnogiego14 oraz modułową komorę przepływową do inżynierii architektury i badań nad funkcją szpiku kostnego15.
Oprócz badań nad fizjologią i patologią, perfuzja narządów została wykorzystana do zbadania podstawowych zasad dostarczania leków. Tak więc jedna grupa opisała izolowaną perfuzję kończyn szczura i badała akumulację liposomów w zagnieżdżonych mięsakach16, podczas gdy inna grupa przeprowadziła wypreparowaną perfuzję ludzkiej nerki w celu zbadania ukierunkowania nanocząstek na śródbłonek17. Ternullo i wsp. wykorzystali izolowany perfundowany płat ludzkiej skóry jako model penetracji skóry zbliżony do in vivo przez lek18.
Pomimo tych postępów w perfuzji dużych organów i tkanek, nie było doniesień o modelach perfuzji in situ u myszy, które: a) omijają narządy oczyszczające, takie jak wątroba, śledziona i nerki; b) obejmują narządy miednicy, skórę, mięśnie, narządy rozrodcze (u mężczyzn), pęcherz moczowy, prostatę i szpik kostny. Ze względu na mały rozmiar tych narządów i zaopatrujące je naczynia krwionośne, kaniulacja ex vivo i utworzenie obwodu perfuzyjnego nie było możliwe. Mysz jest najważniejszym modelem zwierzęcym w badaniach nad rakiem i immunologią oraz w dostarczaniu leków. Zdolność do perfuzji małych narządów myszy pozwoliłaby na udzielenie odpowiedzi na interesujące pytania dotyczące dostarczania leków do tych narządów, w tym do nowotworów zagnieżdżonych w miednicy (pęcherz moczowy, prostata, jajnik, szpik kostny), a także badania nad podstawową fizjologią i immunologią chorób tych narządów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy obwód perfuzji in situ u myszy, który może potencjalnie uniknąć uszkodzenia tkanek i znacznie lepiej nadaje się do badań funkcjonalnych niż perfuzja izolowanych narządów.

<table><tbody><tr><td><silny>Sprzęt< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mikroskop stereoskopowy 3,5x-90x z zoomem na stojaku na wysięgniku ze światłem LED</td><td>Amscope</td><td>SKU: SM-3BZ-80S</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla, USP</td><td>Airgas healthcare</td><td>19087-5283</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>NIKON</td><td>ECLIPSE Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy sterylny długopis kauteryzacyjny o wysokiej temperaturze</td><td>FIAB</td><td>F7244</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa z wilgotną komorą (część 6 na rysunku 1)</td> <td>Aparatura Harvarda</td><td>733692</td><td>Dostosowana jako pojemnik na perfisat; umożliwiła również perfuzję pod stałym ciśnieniem</td></tr><tr><td>Pokrywa komory wilgotnej z okienkiem kwarcowym (część 3 na rysunku 1)</td> <td>Aparat Harvarda</td><td>733524</td><td>utrzymanie temperatury komory</td></tr><tr><td>Wilgotna komora z wymiennikiem ciepła z metalową rurką</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>732901</td><td>Komora nawilżana z płaszczem wodnym z pokrywą do utrzymywania temperatury perfuzatu i myszy</td></tr><tr><td>Uchwyty igieł Olsen-Hegar z obcinakami do szwów</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>125014</td><td></td></tr><tr><td>Sprężony tlenem, USP</td><td>Airgas</td><td>healthcare C2649150AE06</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa (część 4 na rysunku 1)</td><td>Aparat Harvarda</td><td>730113</td><td>dostarczania perfuzatu do kaniuli w komorze</td></tr> <tr><td>wilgotnościowejSterowanie serwomechanizmem SCP plugsys F/Perfuzja (część 1 na rysunku 1)</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>732806</td><td>kontroli prędkości purfuzji</td></tr><tr><td>Podkładka silikonowa</td><td>Aparat</td><td></td><td></td>Harvarda</tr><tr><td>Zestaw silikonowych rurek (strzałki na rysunku 1)</td><td>Aparat Harvarda (TYGON)</td><td>733456</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze studenckie</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej (FST)</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>chirurgiczneFine Science Tools (FST)</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Stół do komory wilgotnej</td><td>Aparat Harvard 734198</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocyrkulator (część 2 na rysunku 1)</td><td>Aparat Harvard</td><td>724927</td><td>kąpieli wodnej z cyrkulacją dla wszystkich elementów z płaszczem wodnym</td></tr><tr><td>Zawór trójdrogowy (część 5 na rysunku 1)</td> <td>Cole-Palmer</td><td>30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do znieczulenia weterynaryjnego</td><td>Highland</td><td>HME109</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19-G Igła PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305186</td><td>Do unieruchamiania igły Insyte Autoguard Winged i drapania kości korowej</td></tr><tr><td>4-0 nici jedwabne</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>6-0</td> Filtr <td>427401</td><td></td><td>Keebomed-Hopemedical</td></tr><tr><td>( 0,2 &mikro; m)</td> <td>Filtr ThermoFisher</td><td>42225-CA</td><td>do 5% BSA-RINGER' S</td></tr><tr><td>Marker permanentny</td><td>Staedtler</td><td>342-9</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (10 ml)</td>Strzykawka <td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2E</td><td></td></tr><tr><td>(60 mL)</td><td>Filtr 309653 BD</td><td></td><td>do 5% BSA-RINGER' S</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% błękit Evansa (w/v) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,5)</td><td>Sigma</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>10% buforowana formalina</td><td>velleyvet</td><td>36692</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c myszy (8-10 tygodni)</td> <td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baxter Viaflex mleczan roztwór Ringera</td><td>EMRN Medical Supplies Inc.</td><td>JB2324</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Thermo Fisher</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DyLight-649-lektyna</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>ZB1214</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% (vol/vol))Pharmco</td><td></td> <td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Enterprises Limited</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Perfuzja ex vivo jest ważnym fizjologicznym narzędziem do badania funkcji izolowanych narządów (np. wątroby, nerek). Jednocześnie, ze względu na mały rozmiar narządów myszy, perfuzja ex vivo kości, pęcherza moczowego, skóry, prostaty i narządów rozrodczych jest trudna lub niewykonalna. Tutaj po raz pierwszy zgłaszamy obwód perfuzji dolnej części ciała in situ u myszy, który obejmuje powyższe tkanki, ale omija główne narządy klirensu (nerki, wątrobę i śledzionę). Obwód jest ustanawiany przez kaniulację aorty brzusznej i żyły głównej dolnej powyżej tętnicy biodrowej i żyły oraz kauteryzację obwodowych naczyń krwionośnych. Perfuzja odbywa się za pomocą pompy perystaltycznej z przepływem perfuzatu utrzymywanym do 2 godzin. Barwienie in situ fluorescencyjną lektyną i roztworem Hoechsta potwierdziło, że mikrokrążenie zostało skutecznie perfundowane. Ten mysi model może być bardzo przydatnym narzędziem do badania procesów patologicznych, a także mechanizmów dostarczania leków, migracji/przerzutów krążących komórek nowotworowych do/z guza oraz interakcji układu odpornościowego z perfundowanymi narządami i tkankami.

Ustanowiliśmy zamknięty układ perfuzyjny poprzez kaniulację aorty brzusznej i żyły głównej dolnej u myszy w wieku 8–10 tygodni, utrzymując objętość buforu perfuzyjnego poniżej 10 mL. Rycina 3A przedstawia obrazy konfokalne po perfuzji tkanek roztworem Ringera zawierającym Hoechst 33342 i DyLight 649-lectin. Mięśnie, szpik kostny, jądra, pęcherz moczowy, prostatę oraz skórę stopy wykazano efektywne barwienie jąder komórkowych i naczyń. Rycina 3B przedstawia barwi...

Protokół jest opisany dla perfuzji in situ dolnej części ciała myszy, w tym pęcherza, prostaty, narządów płciowych, kości, mięśni i skóry stóp.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Protokół ten może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące dostarczania leków i interakcji immunologicznych w narządach wchodzących w skład naszego obwodu. Technika ta pozwala na perfuzję narządów, które nie są możliwe do perfuzji tradycyjnymi metodami ex-vivo, przy jednoczesnym uniknięciu głównych narządów klirensowych. Przed rozpoczęciem zabiegu należy ustawić kąpiel wodną z krążącą wodą i wszystkimi elementami z płaszczem wodnym na 37 stopni Celsjusza.Upewnij się, że rurka jest wyczyszczona i użyj pułapki bąbelkowej w wilgotnej komorze jako zbiornika perfuzatu, aby ograniczyć objętość perfuzatu. Aby wykonać procedurę cewnikowania, potwierdź brak odpowiedzi na odruch pedałowania, w ośmio- do 10-tygodniowej męskiej znieczulonej żarówce zobacz mysz. I ułóż mysz w pozycji leżącej na styropianowej desce, z głową na godzinie szóstej.Unieruchomij kończyny zwierzęcia taśmą i przetrzyj brzuch alkoholem izopropylowym. Wykonaj nacięcie w kształcie litery T w jamie brzusznej, używając elektrokoagulacji, aby zatrzymać krwawienie wokół krawędzi nacięcia. Wypchnij żołądek, jelito czcze i okrężnicę na prawą stronę brzucha, aby odsłonić aortę brzuszną, żyłę główną oraz tętnice i żyły biodrowe i biodrowo-lędźwiowe wspólne.Pod mikroskopem preparacyjnym zlokalizuj i podwiąż tętnice i żyły jajnikowe i biodrowo-lędźwiowe za pomocą jedwabnych szwów 4-O. Zapętl dwa jedwabne szwy 4-O pod aortą brzuszną i żyłą główną dolną około jednego centymetra powyżej tętnicy biodrowej i żyły biodrowej, w odległości jednego milimetra od siebie. Następnie wykonaj luźne skinienie w szwie znajdującym się najbliżej naczyń biodrowych.Użyj uchwytu na igłę, aby wyrównać i rozciągnąć zarówno żyłę główną dolną, jak i aortę brzuszną. I, utrzymując naczynia rozciągnięte, użyj cewnika dożylnego ze skrzydełkami o średnicy 24 rozmiarów, aby nakłuć aortę brzuszną. Gdy tylko igła wbije się na około jeden milimetr w naczynie, naciśnij przycisk, aby cofnąć rdzeń igły i włóż cewnik około pięciu milimetrów do naczynia.W ten sam sposób wprowadzić cewnik na pięć milimetrów do żyły głównej dolnej. I zawiąż oba szwy wokół cewnikowanych naczyń. Następnie nałóż klej błyskawiczny, aby unieruchomić cewniki do prostownika spin a i wymienić narządy jamy brzusznej.Aby skonfigurować system perfuzyjny, umieść mysz na silikonowej podkładce w komorze nawilżanej z płaszczem wodnym i unieruchamij skrzydełka cewnika do podkładki za pomocą igieł o rozmiarze 19. Napełnij wlot cewnika tętniczego wstępnie podgrzanym buforem perfuzyjnym. Użyj kleszczyków hemostatycznych i przykręcanego łącznika, aby przymocować wlot cewnika do rurki i unieruchomić rurkę perfuzyjną wlotową taśmą.Dostosuj natężenie przepływu perystaltycznego do 0,6 mililitra na minutę i utrzymuj odpływ perfuzyjny otwarty przez pięć do 10 minut, aby wypłukać krew przez cewnik żylny. Niektóre skrzepy będą obecne w cewniku wylotowym, wypłucz skrzepy buforem perfuzatu i użyj przykręcanego łącznika, aby przymocować do końca cewnika żylnego do rurki wylotowej, aby zamknąć obwód. Następnie przykryj wilgotną komorę wstępnie podgrzaną pokrywką na maksymalnie dwie godziny perfuzji, okresowo sprawdzając poziom perfuzatu.Tutaj pokazane są obrazy konfokalne po perfuzji roztworem dzwonka zawierającym lektynę Hoechst 33342 i DyLight-649. Mięśnie, szpik kostny, jądra, pęcherz moczowy, prostata i skóra stóp zazwyczaj wykazują skuteczne barwienie jądrowe i naczyniowe. Zabarwienie tych tkanek hematoksyną i eozyną po trzech godzinach normalnej perfuzji termicznej ujawnia skuteczne płukanie narządów, bez widocznego uszkodzenia tkanek.Model ten może być wykorzystany do zrozumienia ścieżek wchłaniania leków w fizjologicznie nieistotnym środowisku. Na przykład, aby zrozumieć rolę składników surowicy w akumulacji leków. Używamy tego systemu, aby zrozumieć mechanizm akumulacji liposomów w skórze.

establishing-situ-closed-circuit-perfusion-lower-abdominal-organs

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Wykorzystanie świń domowych i miniaturowych w nauce znacząco wzrosło w ostatnich latach. Poprzez zaprezentowanie sposobu przeprowadzania intubacji, cewnikowania pęcherza przezcewkowej, cewnikowania tętnicy i żyły udowej, a także perfuzji przezsercowej, dążymy do dalszego zwiększenia wartości miniswiń rasy Göttingen w badaniach biomedycznych.

Podstawowe techniki chirurgiczne u miniorśca göttingenskiego: intubacja, cewzowanie pęcherza moczowego, kaniulacja naczyń udowych oraz perfuzja transkardialna

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. i technika chirurgiczna są szczegółowo opisane.

Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który demonstruje technikę i niezbędne kontrole dla laserowego obrazowania perfuzjowego Dopplera do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy.

Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Niniejszy artykuł opisuje zmodyfikowaną technikę heterotopowego przeszczepu unaczynionego serca z zaktualizowaną techniką aseptyczną, analgezją i znieczuleniem.

Zmodyfikowany protokół przeszczepu serca heterotopowego u myszy zgodny ze współczesnymi standardami techniki aseptycznej, anestezjologii i analgezji

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Dla mysich wątrob stworzono normotermiczny system perfuzji wątroby ex vivo (NEVLP). System ten wymaga doświadczenia w mikrochirurgii, ale pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników perfuzji. Możliwość wykorzystania wątroby myszy ułatwia badanie szlaków molekularnych w celu identyfikacji nowych dodatków perfuzatu i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów skoncentrowanych na naprawie narządów.

Normothermiczna perfuzja płuc ex vivo w wątrobie u myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Klirens insuliny wątrobowej jest kluczowy dla regulacji homeostazy glukozy. W tym artykule opisano przyjazną dla użytkownika procedurę perfuzji wątroby do bezpośredniej oceny szybkości klirensu insuliny w wątrobie in situ u myszy.

Ocena klirensu insuliny u myszy za pomocą perfuzji wątrobowej in situ

Naucz się techniki in situ perfuzji dolnych narządów jamy brzusznej u myszy w obiegu zamkniętym. Metoda umożliwia badanie dostarczania leków i interakcji immunologicznych w tkankach bez ograniczeń metod ex vivo.

Ustalanie in situ perfuzji w obiegu zamkniętym dolnych narządów jamy brzusznej i kończyn tylnych u myszy

Przeglądaj więcej filmów