Name: Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę bezmarkerowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasetach floksowanych. Technika ta umożliwia precyzyjne usuwanie genów bez wpływu na sąsiednie sekwencje.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Publicznej Służby Zdrowia z National Institute of Health, NIAID (granty A1065530 i Al124649), dla K.A. Fields.

1. Projektowanie i montaż pSUmC-4.0 z ramionami homologicznymi specyficznymi dla interesującego genu
<ol>
	<li>Zidentyfikuj regiony ~ 3 kb bezpośrednio przed i za genem docelowym do delecji, aby służyć jako ramiona homologii 5' i 3' dla rekombinacji homologicznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zaprojektuj startery PCR, aby 1) amplifikować ramię homologii 3 kb 5' z genomowego DNA chlamydii i 2) zawierać zwis 15-30 pz specyficzny dla pSUmC-4.0 po strawieniu w miejscu enzymu restrykcyjnego Salla. Upewnij się, że obszary podkładu nakładające się na pSUmC-4.0 mają temperaturę topnienia 55 °C, a temperatury topnienia spinki do włosów dla całego podkładu wynoszą <35 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj startery PCR, aby 1) amplifikować ramię homologii 3' o wielkości 3 kb z genomowego DNA chlamydii i 2) zawierać zwis 15-30 pz specyficzny dla pSUmC-4.0 po strawieniu w miejscu enzymu restrykcyjnego SbfI. Upewnij się, że obszary podkładu nakładające się na pSUmC-4.0 mają temperaturę topnienia 55 °C, a temperatury topnienia spinki do włosów dla całego podkładu wynoszą <35 °C.</li>
	<li>Zaprojektuj startery przesiewowe PCR, które wzmocnią insercję każdego ramienia homologicznego do wektora pSUmC-4.0 po reakcji składania DNA16. Zaprojektuj te startery tak, aby wyżarzały ~ 500 pz poza miejscami ograniczenia, aby umożliwić łatwą wizualizację produktu PCR, nawet jeśli wprowadzenie nie powiodło się (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Amplifikować ramiona homologii 3 kb 5' i 3' ze świeżo wyekstrahowanego genomowego DNA chlamydiowego metodą PCR w jednej lub dwóch reakcjach, aby uzyskać wystarczającą ilość fragmentu do późniejszego złożenia DNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta polimerazy DNA, aby uzyskać określone warunki konfiguracji reakcji i cyklu.</li>
	<li>Sprawdź, czy oba produkty PCR mają odpowiednią wielkość i czy reakcje nie zawierają żadnych zanieczyszczających prążków. Przeprowadź 5 μl każdej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym DNA.</li>
	<li>Oczyścić i zagęścić fragmenty PCR przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu.
	<ol>
		<li>Zebrać wszystkie 3' reakcje PCR razem w probówce o pojemności 1,5 ml i doprowadzić do końcowej objętości 200 μl za pomocą H2O bez nukleaz. Powtórz ten proces dla reakcji 5' PCR.</li>
		<li>Dodaj 200 μl fenolu do każdej probówki i wiruj przez 30–60 s. Wiruj każdą probówkę w mikrowirówce przy >21 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Przenieś górną warstwę fazy wodnej każdej probówki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj jedną dziesiątą objętości 3 M octanu sodu do każdej probówki, a następnie przesuń, aby wymieszać.</li>
		<li>Dodaj 3 objętości 100% etanolu do każdej probówki i przesuń, aby wymieszać. Inkubować obie probówki w temperaturze -80 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Osadzać DNA, obracając każdą probówkę w temperaturze >21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Przemyć osad DNA 100 μl 70 % etanolu. Wirować każdą probówkę w temperaturze >21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie przemyć osad DNA 100 μl 100% etanolu. Wirować każdą probówkę w temperaturze >21 000 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Pozostaw osad do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, a następnie delikatnie zawieś DNA w 12 μl H2O bez nukleaz, przesuwając w celu wymieszania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrawić 500 ng wektora pSUmC-4,0 w reakcji 20 μl z 1 jednostką Sall i 1 jednostką SbfI zgodnie z protokołem producenta. Inkubować reakcję przez około 3 godziny lub przez noc, aby zapewnić całkowite trawienie wektora.</li>
	<li>Oczyść i zagęścić strawiony szkielet przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu, jak opisano wcześniej (etap 1.7.1–1.7.9).</li>
	<li>Połącz strawiony wektor pSUmC-4.0 i produkty PCR ramienia homologii 5' i 3' w stosunku 0,01 pmol pSUmC-4,0 do 0,09 pmol każde ramię homologii. Złóż fragmenty w reakcji składania DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przekształć 50 μl elektrokompetentnych bakterii E. coli w 1 μl reakcji składania DNA. Przekształcić E. coli na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml spektynomycyny, rozprowadzając 150 μl na płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia przebadaj kolonie pod kątem zielonej i czerwonej fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Oczekuje się, że na jedną płytkę agarową przypadnie łącznie 5–30 kolonii.</li>
	<li>Wybierz 5-10 kolonii, aby zaszczepić 4 ml bulionu LB uzupełnionego 100 μg/ml spektynomycyny. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min.</li>
	<li>Korzystając z nocnych kultur E. coli, przeprowadź oczyszczanie DNA na małą skalę. Eluować DNA za pomocą 50 μlH2Owolnego od nukleaz.</li>
	<li>Potwierdź wstawienie każdego ramienia homologicznego do wektora pSUmC-4.0 za pomocą starterów przesiewowych PCR (zaprojektowanych w kroku 1.4) w celu amplifikacji każdej insercji. Jeśli składanie DNA zakończy się pomyślnie, należy zaobserwować produkt PCR o wielkości ~4 kb w 1% żelu agarozowym DNA zarówno dla regionów ramienia 5', jak i 3'. Produkt PCR o objętości ~1 kb wskazuje na brak insercji. 
	UWAGA: Jeśli wstawienie ramion homologii nie powiedzie się w reakcji składania podwójnych fragmentów, wykonaj dwie reakcje montażu, aby indywidualnie wstawić ramię 5', a następnie ramię 3'. Przetraw wektor za pomocą samego Salla przed złożeniem za pomocą ramienia 5', a następnie przetraw wektor za pomocą SbfI, aby złożyć ramię 3'.</li>
	<li>Przekształć E. coli kompetentną przez zaporę / dcm z 200 ng pSUmc-4.0 połączonym z obydwoma ramionami homologicznymi. Utrzyj przekształcone bakterie na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml spektynomycyny, rozprowadzając 25 μl na płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Spodziewanych jest łącznie 20–200 kolonii.</li>
	<li>Przesiać płytki pod kątem kolonii czerwonej i zielonej fluorescencji, jak opisano w kroku 1.13.</li>
	<li>Stwórz kulturę do oczyszczania DNA na dużą skalę, zaszczepiając 100 ml bulionu LB zawierającego 100 μg/ml spektynomycyny czerwonymi i zielonymi koloniami. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 250 obr./min.</li>
	<li>Zbierz kulturę i oczyść DNA za pomocą oczyszczania DNA na dużą skalę.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić oczyszczony plazmidowy DNA w 100 μl NF-H2O. Całkowita wydajność DNA wynosząca co najmniej 2 μg/μl jest idealna do transformacji C. trachomatis.</li>
		<li>Zsekwencjonuj regiony ramienia homologii 5' i 3', aby zapewnić prawidłowe złożenie w pSUmC-4.0 przed przekształceniem C. trachomatis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transformacja C. trachomatis za pomocą pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion przez wymianę alleliczną
<ol>
	<li>Nasiona komórek McCoya, mysich fibroblastów standardowo używanych do hodowli Chlamydii, na dwie 6-dołkowe płytki (1 x 106 komórek / dołek) z pożywką wzrostową #1. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do zlewania się monowarstwy (około 24 godziny).</li>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj objętość serowarów L2 (EB) C. trachomatis WT serowarów L2, która jest wystarczająca do zakażenia 12 dołków płytki 6-dołkowej przy MOI wynoszącym 2. Granulować EB w ilości >20 000 x g przez 30 minut, a następnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zainicjuj transformację chlamydiową, delikatnie zawieszając EB w 600 μl buforu CaCl2, a następnie dodaj 24 μg ramion homologii pSUmC-4.0 + do probówki. Delikatnie wymieszaj roztwór, trzepając. Inkubować probówkę w temperaturze RT przez 30 minut i mieszać co 10 minut.</li>
	<li>Dodaj roztwór transformacyjny do 24 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) i wymieszaj, delikatnie pipetując. Przenieść 2 ml inokulum do każdej studzienki z przenikającymi się komórkami McCoya w 6 dołkach i zainfekować przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usuń inokulum i zastąp go 2 ml / studzienkę pożywką wzrostową RPMI #2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po minimum 7 godzinach, ale nie więcej niż 12 godzinach, zastąp pożywkę 2 ml / studzienkę pożywki selekcyjnej #1. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 48 godzin od momentu zakażenia.</li>
	<li>Zbierz i przenieś bakterie na świeżą monowarstwę komórek McCoya.
	<ol>
		<li>Za pomocą skrobaka do komórek delikatnie zeskrob monowarstwę McCoya, aby podnieść komórki do podłoża. Przenieść materiał z każdej studzienki do probówki o pojemności 2 ml. Osadzać materiał komórkowy w temperaturze >20 000 x g w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml HBSS, delikatnie pipetując.</li>
		<li>Osadzać resztki komórek w odległości 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej studzienki z przenikającymi się komórkami McCoya. Dodaj dodatkowy 1 ml HBSS do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml / studzienkę.</li>
		<li>Zakażenie przeprowadzić przez odwirowanie w temperaturze 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Natychmiast po zakażeniu zastąpić inokulum pożywką selekcyjną #1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj przenoszenie bakterii na świeżą monowarstwę komórek McCoya (sekcja 2.7) co 48 godzin przez trzy lub więcej pasaży, aż do wykrycia czerwonych i zielonych wtrąceń za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego 24 godziny po zakażeniu (24 hpi).</li>
	<li>Po wykryciu czerwonych i zielonych inkluzji kontynuuj przechodzenie przez monowarstwę (sekcja 2.7) za pomocą pożywki selekcyjnej #2.</li>
	<li>Kontynuuj przechodzenie przez monowarstwę, aż zostaną wykryte inkluzje tylko zielone 24 hpi (przejście #3 lub późniejsze), co wskazuje na utratę wektora pSUmC-4.0 i włączenie kasety selekcyjnej loxP do genomu.</li>
	<li>Wybierz jedną studzienkę z inkluzjami tylko zielonymi, aby wzbogacić ją przez pasażowanie. Zbierz i zamroź wszelkie inne studnie, które również zawierają tylko zielone inkluzje w buforze sacharozowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG).
	<ol>
		<li>Aby wzbogacić inkluzje zawierające tylko zieleń, należy przepuścić monowarstwę z jednego dołka płytki 6-dołkowej, jak to zrobiono w kroku 2.7, ale po osadzeniu resztek komórek (krok 2.7.3), przenieść supernatant do stożka z 12 ml HBSS. Użyj tego inokulum, aby zainfekować dwie płytki 6-dołkowe, dodając 2 ml na studzienkę, a następnie wirować płytki przy 900 x g przez 60 minut w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Aby zamrozić dodatkowe studzienki, zbierz monowarstwę jak w kroku 2.7.1, ale ponownie zawieś granulki w 1 ml SPG zamiast HBSS. Osadzać resztki komórek (krok 2.7.3) i przenieść supernatant do krioprobówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać materiał w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wzbogaceniu inkluzji tylko zielonych do MOI 0,5–1,0 (jeszcze jedno do dwóch przejść po wykryciu), zbierz monowarstwy do SPG, jak opisano w kroku 2.11.2. Otrzymać podwielokrotności 50 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Miano bakterii tylko zielonych do określenia inkluzji, tworząc jednostki/μl, zgodnie ze standardowym protokołem miareczkowania17.</li>
</ol>
3. Izolacja klonalna C. trachomatis Mutant delecji tylko w kolorze zielonym zawierający kasetę selekcyjną z bokami loxP poprzez ograniczenie rozcieńczenia
<ol>
	<li>Wysiewaj 384-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z 50 μl komórek McCoya w ~ 2,000 komórek / dołku w pożywce wzrostowej #1. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez ~24 godziny lub do momentu zlewu.</li>
	<li>Rozcieńczyć podwielokrotność bakterii zawierających tylko zielone składniki w HBSS, aby uzyskać ~50 EB na 20 ml. Przenieść rozcieńczone inokulum do tacki zbiornika.
	<ol>
		<li>Wyjmij pożywkę z płytki 384-dołkowej, mocno przesuwając całą płytkę do góry nogami do pojemnika na odpady. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl inokulum C. trachomatis do każdej studzienki. Zakażenie przeprowadzić przez odwirowanie w temperaturze 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie trzepać tak mocno, że monowarstwa się odczepi. Jeśli komórki są nadmiernie zlewające się, łatwiej się odłączają.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć inokulum przez strzepnięcie i zastąpić 50 μl / studzienką pożywką wzrostową #2. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Na tym etapie integracja kasety selekcyjnej z genomem jest stabilna, więc selekcja antybiotyków za pomocą spektynomycyny nie jest już wymagana.</li>
	<li>Po inkubacji płytki przez 5–12 dni zidentyfikuj poszczególne studzienki z zielonymi inkluzjami fluorescencyjnymi za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub platformy przesiewowej o wysokiej zawartości.</li>
	<li>Zbieraj studnie z wtrąceniami tylko zielonymi, zeskrobując monowarstwę końcówką p-10 i przenosząc całą zawartość studzienki do probówki zawierającej 2 ml HBSS. Delikatnie wymieszaj i nałóż 2 ml inokulum na świeżą, zlewającą się monowarstwę McCoya w 6-dołkowej płytce do infekcji. 
	UWAGA: Podczas identyfikowania poszczególnych studzienek z inkluzjami, inkluzje będą znajdować się w klastrze ze względu na ekspansję od początkowego włączenia. Jeśli studnia ma wiele klastrów, jest prawdopodobne, że więcej niż jeden EB początkowo zainfekował tę studnię. Studzienki te nie powinny być zbierane, a w niektórych przypadkach może być konieczne wielokrotne przeprowadzanie izolacji klonalnej przez seryjne rozcieńczanie.</li>
	<li>Zainfekować 6-dołkową płytkę przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Zastąp inokulum 2 ml / studzienkową pożywką wzrostową #2. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.11–2.13, aby wzbogacić, zamrozić i mianować populacje klonów.</li>
	<li>Potwierdź delecję docelowych genów z klonalnie izolowanego C. trachomatis za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej12.</li>
</ol>
4. Transformacja C. trachomatis FRAEM Mutant z pSU-Cre w celu zainicjowania usuwania kasety selekcyjnej z boków loxP
<ol>
	<li>Powtórz proces transformacji na płytce 6-dołkowej, jak opisano wcześniej (kroki 2.1–2.8) przy użyciu klonalnie izolowanego mutanta C. trachomatis FRAEM, wektora pSU-Cre i pożywki selekcyjnej #3. 
	UWAGA: Na udaną transformację wskazują inkluzje, które są czerwoną i zieloną fluorescencyjną.
	<ol>
		<li>Przejść przez monowarstwę, aż zostaną wykryte inkluzje tylko na czerwono za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, co wskazuje na utratę kasety selekcyjnej (dwa do trzech pasaży). Kontynuuj przechodzenie monowarstwy, aż wtrącenia tylko czerwone zostaną wzbogacone do MOI ~0,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonalnie wyizoluj inkluzje tylko w kolorze czerwonym, ograniczając rozcieńczenie w płytce 384-dołkowej, jak opisano wcześniej (kroki 3.1–3.8); jednak użyj pożywki selekcyjnej #3 dla wszystkich kroków.</li>
	<li>Wzbogać populacje klonów przez pasażowanie do MOI 0,1. Po wzbogaceniu zastąp pożywkę sekcyjną pożywką wzrostową #2, aby zainicjować utratę wektora pSU-Cre (około trzech do czterech pasaży).</li>
	<li>Klonalnie wyizoluj bakterie niefluorescencyjne (kroki 3.1–3.8); jednak ręcznie zeskanuj płytkę za pomocą mikroskopu jasnego pola, aby wykryć inkluzje. Wzbogać i zamrozić bakterie (krok 2.11–2.12).</li>
	<li>Badanie przesiewowe zmutowanego szczepu za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, Western blotting i sekwencjonowania DNA całego genomu, jak opisano wcześniej12.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Incidence+and+Prevalence+of+Selected+Curable+Sexually+Transmitted+Infections%3A+2008%3A+World+Health+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+and+Reproductive+Health+Matters%22%5BJournal%5D)">Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).</li>
<li>Stephen, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Paradigm+of+Chlamydial+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis.</a> Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).</li>
<li>Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Frontiers+in+Type+III+Secretion+Biology%3A+the+Chlamydia+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective.</a> Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+genomes+and+plasmids+within+Chlamydia+trachomatis+and+the+emergence+in+Sweden+of+a+new+variant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain.</a> BMC Genomics. 10, 239(2009).</li>
<li>Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+obstacles+in+genetic+dissection+of+chlamydial+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+Intracellular+bacteria%3A+progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).</li>
<li>Rahnama, M., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Chlamydia%3A+current+approaches+and+impact+on+our+understanding+of+chlamydial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology.</a> Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).</li>
<li>Kari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+targeted+Chlamydia+trachomatis+null+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).</li>
<li>LaBrie, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+Mutagenesis+in+Chlmaydia+trachomatis+Identifies+CT339+as+a+ComEC+Homolog+Important+for+DNA+Uptake+and+Later+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer.</a> mBio. 10 (4), 01343(2019).</li>
<li>Johnson, C. M., Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+insertional+inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+using+a+group+II+intron%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron.</a> PLoS One. 8, 83989(2013).</li>
<li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7, 01817(2016).</li>
<li>Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floxed+cassette+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Enables+Markerless+Gene+Deletion+in+Chlamydia+trachomatis+and+can+Reverse+Cassette-Induced+Polar+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects.</a> Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).</li>
<li>Yarmolinsky, M., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THe+legacy+of+Nat+Sternberg%3A+the+genesis+of+Cre-lox+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology.</a> Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).</li>
<li>McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Reveals+a+Role+for+Chlamydia+trachomatis+TmeA+in+Invasion+that+is+Independent+of+Host+AHNAK%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK.</a> Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+Plasmid-Encoded+Pgp4+is+a+Transcriptional+Regulator+of+Virulence-Associated+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes.</a> Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).</li>
<li>Silayeva, O., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibson+Assembly+facilitates+bacterial+allelic+exchange+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis.</a> Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-Infected+Cells%3A+Directed+Trafficking+of+Golgi-Derived+Sphingolipids+to+the+Chlamydial+Inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+phenotypic+characterization+of+in+vitro-generated+Chlamydia+trachomatis+recombinants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants.</a> BMC Microbiology. 13, 142(2013).</li>
<li>Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rifampin-resistant+RNA+polymerase+mutants+of+Chlamydia+trachomatis+remain+susceptible+to+the+ansamycin+rifalazil%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil.</a> Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół generowania bezmarkerowych delecji genów u C. trachomatis za pomocą FLAEM umożliwia celowaną delecję nieistotnych genów i eliminuje efekty biegunowe wywołane przez kasetę. Protokół opiera się na starannym zaprojektowaniu ramion homologii 5' i 3' wprowadzonych do wektora samobójczego pSUmC 4.0, skutecznej transformacji C. trachomatis i starannym badaniu przesiewowym izolowanych zmutowanych szczepów. Skuteczna inżynieria genomu za pomocą tej metody skutkuje bakteriami, które nie są ...

Chlamydia trachomatis jest główną przyczyną bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i stanowi znaczące obciążenie dla zdrowia ludzkiego. Każdego roku ponad 100 milionów ludzi zaraża się C. trachomatis1. Około 70% zakażeń u kobiet przebiega bezobjawowo pomimo szkodliwych skutków dla zdrowia reprodukcyjnego, takich jak zapalenie miednicy, ciąża pozamaciczna i/lub niepłodność. Następstwa choroby są bezpośrednio związane z immunopatologią zainicjowaną przez zakażenie C. trachomatis2. Skuteczna szczepionka nie została jeszcze opracowana; Dlatego zrozumienie funkcji bakteryjnych czynników wirulencji i innych produktów genów bakteryjnych jest ważnym i pilnym pytaniem badawczym.
Jako bakterie wewnątrzkomórkowe, inwazja komórek gospodarza, replikacja wewnątrzkomórkowa, uwalnianie potomstwa i unikanie odpowiedzi immunologicznych gospodarza są krytycznymi procesami. C. trachomatis tworzy wakuolę związaną z błoną przyzytoforyczną, zwaną inkluzją, do rozwoju wewnątrzkomórkowego. Ustanowienie inkluzji i wiele innych krytycznych procesów osiąga się poprzez wydzielanie białek efektorowych za pośrednictwem systemu sekrecji typu III (T3SS)3. Wyjaśnienie funkcji tych wydzielanych efektorów było ograniczone przez wiele lat ze względu na genetyczną nieuleczalność C. trachomatis. W przeciwieństwie do E. coli, wiele klasycznych technik klonowania nie ma zastosowania do Chlamydii. Kilka głównych ograniczeń dotyczy wydajności transformacji, braku reporterów kontrselekcji, takich jak sacB, i konserwacji plazmidu. Podczas gdy plazmidy E. coli mogą być na ogół utrzymywane w nieskończoność z początkiem replikacji i odpowiednim ciśnieniem selekcyjnym, plazmidy C. trachomatis wymagają dodatkowych ośmiu otwartych ramek odczytu (pgp1-8) do utrzymania, które znajdują się na natywnym plazmidzie pL2 w serovar4.
W ostatnich latach powstało wiele narzędzi genetycznych, które uwzględniają unikalną biologię Chlamydii, jednak nadal istnieją ograniczenia5,6,7. Mutageneza chemiczna przez leczenie metanosulfonianem etylu (EMS) może wprowadzać mutacje typu missense lub (rzadziej) może powodować przejścia nukleotydowe wprowadzające przedwczesny kodon stop, co daje mutację nonsensowną8. Insercja transpozonów jest skuteczna w przypadku rozerwania genów, ale obecna technologia w badaniach nad Chlamydią jest pracochłonna i czasochłonna9. Zarówno leczenie EMS, jak i techniki mutagenezy transpozonów generują losowe mutacje i wymagają rygorystycznych metod przesiewowych w celu wyizolowania zmutowanych szczepów. Metoda rozbijania genów poprzez insercję intronów grupy II (np. TargeTron) pozwala na ukierunkowaną mutagenezę; Jednak ta metoda jest ograniczona wydajnością, a miejsce wstawienia nie zawsze jest prawidłowo przewidziane10.
Mutageneza wymiany allelicznej zgłaszana przez fluorescencję (FRAEM) to strategia stosowana do celowanej delecji genów w połączeniu z wstawieniem kasety selekcyjnej zapewniającej oporność na antybiotyki i reportera fluorescencji11. Projekt FRAEM komplikuje jednak potencjalny wpływ biegunowy indukowany kasetą na geny znajdujące się w dalszych etapach łańcucha dostaw, zwłaszcza w przypadku celowania w geny w operonach policistronicznych. Mutageneza wymiany alleli w kasecie floksowanej (FLAEM) to nowatorskie podejście genetyczne opracowane w celu złagodzenia efektów biegunowych wywołanych przez kasetę, które wcześniej obserwowano w przypadku selekcji FRAEM cassette12. FLAEM wykorzystuje edycję genomu Cre-loxP w celu usunięcia kasety selekcyjnej i przywrócenia ekspresji dalszych genów. Kaseta selekcyjna zawierająca oporność na antybiotyki i białko zielonej fluorescencji (GFP) została przeprojektowana z flankującymi miejscami loxP. Te miejsca loxP mogą rekombinować w obecności rekombinazy Cre i powodować wycięcie kasety z genomu13. Wykazano, że ta strategia łagodzi efekty biegunowe wywołane kasetą, gdy celuje w tmeA do usunięcia12,14.
Obie metody FRAEM i FLAEM wykorzystują ten sam wektor samobójczy, pSUmC 4.0, który może być warunkowo podtrzymywany poprzez indukowaną ekspresję pgp6. Wcześniej wykazano, że ekspresja pgp6 jest niezbędna do retencji plazmidu i dlatego jest wykorzystywana do kontrolowania konserwacji plazmidu11,15. Gdy C. trachomatis jest hodowany w pożywkach uzupełnionych bezwodną tetracykliną (aTc) w celu wywołania ekspresji pgp6, wektor jest utrzymywany. W przypadku braku aTc wektor jest tracony. Celowa delecja genu osiąga się poprzez alleliczną wymianę genu na kasetę selekcyjną. Regiony 3 kb bezpośrednio przed i za docelowym genem służą jako ramiona homologii do rekombinacji. Ramiona te są klonowane do wektora pSUmC 4.0 otaczającego kasetę wyboru. Udane zdarzenia transformacji i rekombinacji C. trachomatis obserwuje się poprzez raportowanie fluorescencji. Ekspresja mCherry na szkielecie wektora i gfp w kasecie selekcyjnej daje czerwone i zielone inkluzje fluorescencyjne. Po usunięciu aTc z pożywki hodowlanej, inkluzje tylko zielone wskazują na udane zdarzenia rekombinacji z utratą wektora samobójczego i integracją kasety selekcyjnej z genomem bakteryjnym.
FLAEM reprezentuje rozszerzenie FRAEM poprzez późniejszą transformację wektora wyrażającego rekombinazę Cre, pSU-Cre, w nowo utworzony zmutowany szczep. Rekombinaza Cre ułatwia rekombinację między miejscami loxP i wycięcie kasety selekcyjnej. Zdarzenia rekombinacji są sygnalizowane za pomocą raportowania fluorescencji. Wektor pSU-Cre koduje mCherry; Tak więc udana transformacja jest wskazywana przez dodanie czerwonej fluorescencji do inkluzji wyrażających GFP. Uprawa przy braku nacisku selekcyjnego na kasetę powoduje rekombinację za pośrednictwem Cre w miejscach loxP, a utrata kasety jest sygnalizowana przez inkluzje tylko w kolorze czerwonym. Podobnie jak w przypadku pSUmC-4.0, indukowana ekspresja pgp6 jest wykorzystywana do warunkowego utrzymania pSU-Cre. Po usunięciu aTc i selekcji antybiotyków, plazmid jest utwardzany, a powstały szczep delecji bez markerów jest niefluorescencyjny. Metoda ta rozwiązuje problem efektów biegunowych wywołanych przez kasetę.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>KSE Scientific</td><td>BMK-A1705</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>Chlorowodorek anhydrotetracykliny</td><td>ACROS Organics</td><td>233131000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Bufor</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 50 mM Dwuwodny chlorek wapnia Dwuwodny</td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Nadaje się do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>dam-/dcm- Kompetentny E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2925H</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>Sterylna przefiltrowana hodowla komórkowa testowana</td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Sigma</td><td>G8415-100G</td><td>Kwas L-glutaminowy</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa #1</td><td></td><td></td><td>Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10 % (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS).</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa #2</td><td></td><td></td><td>Pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% (obj./obj.) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz 1 &mikro; g / ml cykloheksymidu</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca kwalifikowana jednorazowy strzał (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>A38402-02</td><td></td></tr><tr><td>McCoy Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1696</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy Monarch Plasmid</td><td>New England BioLabs</td><td>T1010S</td><td>Oczyszczanie</td></tr> <tr><td>DNA na małą skalęNaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139-250G</td><td>Monozasadowy fosforan sodu</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td></tr><tr><td>NEB 10-beta Elektrokompetentny E. coli Komórki</td><td>New England BioLabs</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi Zestaw do klonowania</td><td>DNA Nowy Anglia BioLabs</td><td>E5520S</td><td>Zestaw montażowy Gibsona</td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td>Bioodczynnik odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>Oczyszczanie DNA na dużą skalę</td></tr><tr><td>Q5 Gorący start Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0515</td><td>Fragment polimerazy PCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (1x)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Zawierający 2mM L-glutamina</td></tr><tr><td>Sall-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sbfl-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3642S</td><td></td></tr><tr><td>Selection Media #1</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny i 50 ng/ml bezwodnej tetracykliny rozpuszczonej w DMSO</td></tr><tr><td>Selection Media #2</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &mikro; g/ml cykloheksymidu, 500 i mikro; g/ml spektynomycyny</td></tr><tr><td>Pożywka selekcyjna #3</td><td></td><td></td><td>RPMI 10 % FBS, 1 i mikro; g/ml cykloheksymidu, 50 ng/ml aTc oraz 0,6 &mikro; g / ml penicyliny</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy octanu sodu</td><td>Sigma</td><td>S7899-100ML</td><td>3M</td></tr><tr><td>SOC Outgrowth Medium</td><td>New England BioLabs</td><td>B9020SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>Pentahydrat dichlorowodorku spektynomycyny, klasa hodowli komórkowej</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61820</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S1888-1KG</td><td>Bioreagent odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Bufor sacharozowo-fosforanowo-glutaminianu (SPG)</td><td></td><td></td><td>37.5 g sacharozy, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, kwas glutaminowy 0.36 na 500 ml wody do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Tris</td><td>AMRESCO</td><td>0497-5KG</td><td>Ultraczysta</td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25%</td></tr> <tr><td>Woda</td><td>Sigma</td><td>W3500-500ML</td><td>Sterylnie filtrowany, BioReagent, Nadaje się do hodowli komórkowych</td></tr></tbody></table>

bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w chlamydia trachomatis

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis jest obligatoryjnym patogenem wewnątrzkomórkowym, który historycznie był trudny do genetycznego manipulowania. Zdecydowany postęp w wyjaśnianiu mechanizmów, które C. trachomatis wykorzystuje do tworzenia i utrzymywania uprzywilejowanej niszy wewnątrzkomórkowej, był ograniczony z powodu braku narzędzi genetycznych. Na szczęście w ostatnim czasie pojawiło się kilka nowych postępów w technikach manipulacji genetycznej. Jednym z nich jest rozwój mutagenezy allelowej wymiany zgłaszanej przez fluorescencję (FRAEM). Metoda ta umożliwia celowaną delecję genu w połączeniu z insercją kasety selekcyjnej kodującej oporność na antybiotyki i białko zielonej fluorescencji (GFP). Poleganie na tej strategii może być skomplikowane w przypadku celowania w geny w operonach policistronicznych ze względu na potencjał efektów biegunowych na geny niższego szczebla. Mutageneza allelicznego wymiennika kasetowego z klapkami (FLAEM), której protokół opisano tutaj, została opracowana w celu złagodzenia efektów biegunowych wywołanych przez kasetę. FLAEM wykorzystuje edycję genomu Cre-loxP do usunięcia kasety selekcyjnej po docelowej delecji przez wymianę alleli. Otrzymane szczepy zawierają bezmarkerowe delecje genów jednej lub więcej sekwencji kodujących. Technika ta ułatwia bezpośrednią ocenę funkcji genów i rozszerza repertuar narzędzi do manipulacji genetycznej u C. trachomatis.

Metoda bezmarkerowej delecji genów w C. trachomatis przy użyciu FLAEM opiera się na starannych technikach klonowania i transformacji. Pomyślna rekombinacja alleliczna jest kluczowym pierwszym krokiem i wymaga identyfikacji oraz insercji ramion homologii do wektora klonującego pSUmC-4.0 (Rycina 1). Niezbędnym drugim krokiem w procesie bezmarkerowej delecji genu jest usunięcie reportera fluorescencyjnego i kasety selekcji antybiotykowej za pomocą edycji genomu Cre-lox, przedstawionej ...

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Mutageneza wymiany alleli w kasecie floksowanej jest ważną metodą, ponieważ delecja genów jest cennym narzędziem, które można wykorzystać do zrozumienia funkcji produktów genowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona celowaną delecję genów bez wywoływania polarnych skutków dla genów znajdujących się w dalszej części łańcucha dostaw. Zidentyfikuj około trzech regionów kilozasad bezpośrednio przed i za genem docelowym do delecji, aby służyły jako pięć pierwszych i trzy pierwsze ramiona homologii dla rekombinacji homologicznej i przypisz startery, jak wskazano w protokole tekstowym.Amplifikować trzy kilozasady, pięć pierwszych i trzy pierwsze ramiona homologii ze świeżo wyekstrahowanego genomowego DNA chlamydii za pomocą PCR w jednej lub dwóch reakcjach, aby uzyskać wystarczającą ilość fragmentu do późniejszego złożenia DNA. Po oczyszczeniu i zagęszczeniu fragmentów PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przetrawić 500 nanogramów wektora pSUmC-4,0 w reakcji o objętości 20 mikrolitrów z jedną jednostką komórki pierwszej i jedną jednostką SBF jedną zgodnie z protokołem producenta. Połącz strawiony i oczyszczony wektor pSUmC-4.0 oraz zarówno pięć głównych, ja

markerless-gene-deletion-floxed-cassette-allelic-exchange-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.

Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku. Jeśli interesujący nas gen jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku, przeszczep szpiku kostnego pozwala na zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku bez zmiany genotypu komórek niepochodzących ze szpiku.

Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Poznaj metodę bezmarkerowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasetach floksowanych. Technika ta umożliwia precyzyjne usuwanie genów bez wpływu na sąsiednie sekwencje.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Przeglądaj więcej filmów