Name: Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji fibroblastów i miofibroblastów z serca myszy w celu badania mechanizmów gojenia ran i zwłóknienia. Technika zapewnia wysoką czystość próbek i elastyczność w zastosowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Ivo Kalajzic za myszy αSMA-GFP. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) w ramach nagrody numer R01GM118300 (SS), Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii NIH w ramach nagrody numer R21EB019509 (P.P.Y.) oraz Grant Rozwoju Naukowca Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego w ramach nagrody o numerze 17SDG33630187 (SS). Analizy cytometrii przepływowej przeprowadzono w VUMC Flow Cytometry Shared Resource, który jest wspierany przez Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) i Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Fibroblasty to niejednorodna grupa komórek, identyfikowana za pomocą zróżnicowanego zestawu markerów. Markery białkowe, które zostały wykorzystane do identyfikacji fibroblastów, to receptor domeny dyskoidyny 2 (DDR2), fibronektyna, wimentyna, kolagen I i III oraz Thy1 15,16,17,18,19,20. Podczas gdy wimentyna była używana do i...

Fibroblasty serca, komórki pochodzenia mezenchymalnego, odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu przewodnictwa elektrycznego i sił mechanicznych w sercu, a także w utrzymaniu architektury serca podczas homeostazy1. Po urazie komórki te są aktywowane, rozszerzają się i wytwarzają białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)2. Wiele badań przedklinicznych ujawniło istnienie fibroblastów jako krytycznych regulatorów komórkowych, które utrzymują integralność strukturalną uszkodzonego serca3, a także głównych komórek efektorowych odpowiedzialnych za niekontrolowaną produkcję i odkładanie się białek ECM, co powoduje powstawanie sztywnych blizn i niewydolność serca4. Fibroblasty to niejednorodna grupa komórek, co utrudnia oddzielenie ich funkcji naprawczej od profibrotycznych nieprzystosowawczych właściwości. Niedawno zdefiniowano funkcjonalną heterogeniczność dwóch odrębnych podtypów fibroblastów po uszkodzeniu mięśnia sercowego, co wskazuje na możliwość wyizolowania różnych podtypów fibroblastów i zbadania ich roli w gojeniu się ran5.
Uzyskanie populacji czystych fibroblastów jest kluczowe dla określenia ich funkcjonalnej roli w naprawie i zwłóknieniu. Jednak obecność wielu markerów fibroblastów, które rozpoznają inne typy komórek, sprawia, że trudno jest wyizolować zasadniczo czystą populację fibroblastów6. W kilku eleganckich badaniach opracowano sprytne sposoby izolowania fibroblastów serca od nieuszkodzonego i uszkodzonego mięśnia sercowego. Najpopularniejszą i najbardziej ugruntowaną metodą wzbogacania fibroblastów jest selektywna adhezja po enzymatycznym trawieniu tkankowym7.
Dodatkowo, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) fibroblastów na podstawie antygenów powierzchniowych komórek zostało pomyślnie opisane8. W badaniu, po trawieniu enzymatycznym, komórki mezenchymalne posortowano jako ujemne pod względem linii (Lin: Ter119−CD45−CD31−) i gp38-dodatnie (gp38+) z serc myszy. Potwierdzono, że komórki Gp38 + ve są fibroblastami na podstawie ich koekspresji col1α1 i innych markerów mezenchymalnych. Chociaż większość trawienia tkanek jest zakończona po wypreparowaniu komory na szalce Petriego, w niedawnym badaniu zbadano użycie bezpośredniej perfuzji enzymatycznej lewej komory igłowej do wyizolowania miocytów i niemiocytów, które obejmują fibroblasty9. W tym przypadku fibroblasty zostały następnie wyizolowane przez selektywną adhezję.
Ten protokół opisuje izolację i wzbogacanie fibroblastów przy użyciu trzech metod. Pierwszą z nich jest znana już metoda polegająca na selektywnej adhezji fibroblastów po trawieniu enzymatycznym. Druga metoda jest stosowana przede wszystkim do izolowania miofibroblastów mięśni gładkich alfa wywołanych urazem. Trzecia metoda polega na sekwencyjnym, magnetycznym zubożeniu trawionej enzymatycznie zawiesiny komórek serca komórek krwiotwórczych i śródbłonka. Po wyczerpaniu fibroblasty/miofibroblasty są izolowane na podstawie obecności antygenu MEFSK4 za pomocą kulek magnetycznych. Ostatnio MEFSK4 został opisany jako antygen obecny zarówno na fibroblastach w stanie spoczynku, jak i aktywowanym, co czyni go odpowiednim markerem do identyfikacji i izolacji fibroblastów. Oczywiście wszystkie opisane tutaj metody mają unikalne ograniczenia. Dlatego zdecydowanie zaleca się sprawdzenie czystości izolowanej populacji komórek za pomocą analizy przepływu, barwienia immunologicznego i półilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Jednak metodologie te można rozszerzyć, a dodatkowe markery mogą zostać dodane w celu wykluczenia innych zanieczyszczających populacji przed wykorzystaniem populacji fibroblastów i miofibroblastów do kluczowych eksperymentów.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwgrzybicze (amfoterycyna B-rozpuszczona; Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>Albumina seromy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td></td><td>cytrynianu</td></tr><tr><td>chlorku</td><td></td><td></td><td></td>wapnia</tr><tr><td>Mieszanka kolagenazy (Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>DI</tr><tr><td>DMEM-F12 z technologiami L-Glutaminy i HEPES</td><td>Life</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnazy I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (dPBS) bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70% bloker FC na etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(oczyszczony anty-mysie CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Technologie życia</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10% kozia surowica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) z Ca2+ i Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Bufor w proszku</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma profilaktyczny (Plasmocin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik</td><td></td> <td>montażowy o spowolnionym blaknięciu</td><td></td></tr><tr><td>Azydek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu Wodorowęglan</td><td></td><td></td><td></td>sodu</tr><tr><td>TGF&beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanowa niebieska plama (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Typ 1 Szczurzy kolagen</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><silny>Przeciwciała</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (zapas: 1 mg/ml roztwór w DMSO)</td><td>Sondy molekularne</td><td>A1310</td><td>rozcieńczenie = 1:1000; RRID =</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>rozcieńczenie = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>rozcieńczenie = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alpha; 1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>rozcieńczeniu = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Barwnik duchowy fioletowy 510 (Formulacja: 1 uL/test w DMSO)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>rozcieńczenie = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr>Kozie <td>sondy molekularne</td> <td>anty-mysie Alexa Fluor 488</td><td>Rozcieńczenie A11029</td><td>= 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>Koza anty-króliczo-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik-FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr>Kozie <td>sondy molekularne</td><td>przeciw szczurom Alexa Fluor 488</td><td>A11006</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>Koza przeciw szczurom Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>rozcieńczenie = 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alfa;-aktyna mięśni gładkich (&alfa;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>rozcieńczenie = 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>Białko specyficzne dla fibroblastów 1 (FSP1)</td><td>Milipor 07-2274</td><td>07-2274</td><td>rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>Kulki magnetyczne CD45</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Koraliki magnetyczne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa antypodajnikowe-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>kulki anty-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>IgG-APC Szczur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>rozcieńczenie = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>Osioł anty-szczur Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>rozcieńczenie = 1:100</td></tr><tr><td>anty-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>rozcieńczenie = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td><silny>Inne materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do cytometrii przepływowej</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze jednoostrzowe</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>GFP-&alpha;SMA Reporter Myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Separator MACS Pole</td><td></td><td></td><td></td>magnetyczne</tr><tr><td>Kolumna</td><td></td><td></td><td></td>separacyjna MACS</tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td><td></td>nakrywkowe</tr><tr><td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do całkowitej izolacji mikro roztworów</td> wodnych <td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA BioRad iScript</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G Igła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Laserowa cytometria przepływowa (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Przepływ laserowy Maszyna do cytometrii (BD FACSAria III)</td>Oprogramowanie do pozyskiwania danych o <td>przepływie BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(BD FACSDiva Software v8.0a)</td>Oprogramowanie do analizy danych przepływu <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(oprogramowanie FlowJo)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Zwłóknienie serca w odpowiedzi na uraz jest fizjologiczną reakcją na gojenie się ran. Podjęto wysiłki w celu zbadania i ukierunkowania na podtypy fibroblastów, które łagodzą zwłóknienie. Jednak badania nad fibroblastami są utrudnione ze względu na brak powszechnie akceptowalnych markerów fibroblastów do identyfikacji fibroblastów w stanie spoczynku, jak i aktywowanych. Fibroblasty są niejednorodną populacją komórek, co utrudnia ich wyizolowanie i scharakteryzowanie. Przedstawiony protokół opisuje trzy różne metody wzbogacania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy. Zastosowanie standardowego i niezawodnego protokołu izolacji fibroblastów umożliwi badanie ich roli w homeostazie, a także modulacji zwłóknienia.

Schemat bramowania przepływu demonstrujący izolację miofibroblastów z wykorzystaniem myszy reporterowych αSMA-GFP 
W modelu mysim reporterowym αSMA-GFP w nieuszkodzonych sercach nie stwierdzono komórek GFP+; dlatego posłużyły one do ustanowienia bramki dla sygnału tła kanału GFP po kompensacji (Rysunek 2). Komórki αSMA+ zostały wyselekcjonowane na podstawie ekspresji GFP z uszkodzonej lewej komory 10 dni po MI. Niewielki odsetek komórek śródbłonka (k...

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Protokół ten pozwala nam wyizolować zarówno spoczynkowe, jak i wywołane urazem aktywowane populacje fibroblastów ze znaczną czystością. Główną zaletą tej techniki jest jej elastyczność w improwizacji. W przypadku izolacji przepływowej, a także izolacji opartej na kulkach, można włączyć przeciwciała przeciwko zanieczyszczającym komórkom, aby wykluczyć je z izolowanych komórek docelowych.Technika ta jest stosowana przede wszystkim do izolacji fibroblastów serca. Można go jednak wykorzystać do izolowania fibroblastów z innych tkanek. Tę procedurę zademonstrują Meiling Melzer, stażystka na studiach licencjackich, i David Beier, asystent naukowy z mojego laboratorium.Aby przygotować sześciodołkową płytkę do przechowywania sześciu serc podczas sekcji, wlej dwa mililitry zimnego KHB do każdej studzienki i umieść płytkę na lodzie. Spryskaj ciało 70% etanolem. Ustaw go tak, aby strona brzuszna była skierowana w stronę eksperymentatora.Przypnij przydatki, aby zapobiec zakłóceniom. Nie przekłuwając wątroby, rozetnij skórę i mięśnie brzucha. Przeciąć pionowo w kierunku mostka, ostrożnie otwierając klatkę piersiową bez przebijania serca.Następnie kontynuuj przecinanie klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Za pomocą kleszczy delikatnie unieś serce z klatki piersiowej, odcinając płuca lub nadmiar tkanki przyczepionej na zewnątrz serca. Oddziel lewą komorę.Do każdego rozwarstwienia umieść komorę w osobnym dołku na sześciodołkowej płytce. Najpierw użyj kleszczy, aby wielokrotnie ściskać i mieszać komorę w KHB, aby usunąć nadmiar krwi. Przenieś komorę na czystą, sterylną płytkę o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych.Następnie za pomocą jednosiecznego ostrza szybko zmiel komorę na małe kawałki. Dodaj jeden mililitr koktajlu trawiennego kolagenazy i kontynuuj mielenie. Gdy kawałki są wystarczająco małe, aby można je było przenieść za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra, przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Umyj talerz dwukrotnie dwoma mililitrami koktajlu i przenieś pranie do tubki. Inkubować probówkę przez 30 minut i ponownie zawiesić komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie za pomocą pięciomililitrowej pipety. Po wstępnym ponownym zawieszeniu inkubować komórki przez 15 minut i ponownie zawiesić za pomocą 10-mililitrowej pipety.Następnie umieść sitko o średnicy 40 mikrometrów na nowej, stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i zalej sitko, zwilżając je jednym do dwóch mililitrów KHB. Dodać 25 mililitrów KHB do zawiesiny wytrawiającej i ponownie zawiesić. Przefiltruj zawiesinę przez sitko, wymieniając sitko w razie potrzeby.Odwirować filtrat w temperaturze 400 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1x buforze do lizy RBC, używając pięciu mililitrów buforu na serce. Po inkubacji zawiesiny przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, odwirować zawiesinę w ilości 400 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze KHB. Następnie dodaj dziewięć mililitrów KHB do zawiesiny. Przefiltruj zawiesinę przez zagruntowane sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowej, stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 400 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec usuń supernatant i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki fibroblastowej lub PBS. Po ustaleniu liczby komórek fibroblasty można wyizolować z zawiesiny trzema różnymi metodami opisanymi w manuskrypcie.Aby rozpocząć izolację przez posiewanie różnicowe, przygotuj płytkę sześciodołkową, dodając dwa mililitry pożywki fibroblastów do każdej studzienki. Zakręć talerzem, aby przykryć dno studzienki. Jeśli komórki serca myszy są zawieszone w PBS, odwiruj je i ponownie zawieś w jednym mililitrze pożywki fibroblastów na serce.Dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej, co odpowiada jednemu sercu, do każdej studzienki. Zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Dodaj dodatkowy jeden do dwóch mililitrów pożywki fibroblastów na studzienkę, aby uzyskać całkowitą objętość do czterech mililitrów na studzienkę.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Ponieważ fibroblasty będą selektywnie przylegać do studzienek, można je wyizolować, usuwając i odrzucając pożywkę. Umyj pozostałe przyłączone komórki dwoma mililitrami PBS, a następnie dodaj od dwóch do czterech mililitrów sterylnego podłoża fibroblastowego na studzienkę.Inkubować w temperaturze 37 stopni, aż do zlewania się, zmieniając pożywkę co dwa do czterech dni. Aby rozpocząć znakowanie magnetyczne i separację komórek krwiotwórczych CD45-dodatnich, należy odwirować zawiesinę komórek serca myszy o stężeniu 500 razy g przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze buforu równoważącego.Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po ponownym odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad komórek w buforze równowagi. Dodaj kulki magnetyczne CD45-dodatnie i dobrze wymieszaj.Inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki, dodając bufor równoważący i odwirowując w temperaturze 500 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń supernatant i policz komórki za pomocą hemocytometru.Zawiesić osad w buforze równowagi. Przepuść zawiesinę przez filtr o średnicy 40 mikrometrów, aby zapobiec zatykaniu kolumny separacyjnej przez agregacje komórek. Następnie umieść kolumnę separacyjną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora i zrównoważ kolumnę z co najmniej trzema mililitrami PBS.Przelej zawiesinę komórek przez kolumnę i zbierz przepływ, który będzie zawierał nieoznakowane komórki, w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu równoważącego i połączyć popłuczyny z przepływem. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść kolumnę na 15-mililitrowej stożkowej rurce.Aby wymyć znakowane komórki CD45-dodatnie, należy odpipetować pięć mililitrów buforu równowagi do kolumny i mocno zanurzyć kolumnę. Odwirować probówkę z eluentem i probówkę przepływową z prędkością 500 razy g. Policz komórki za pomocą hemocytometru.Aby zakończyć izolację, postępuj zgodnie z protokołami zawartymi w manuskrypcie dla komórek śródbłonka CD31-dodatnich i fibroblastów MEFSK4-dodatnich, które są podobne do protokołu dla komórek CD45-dodatnich. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją przeprowadzono na pojedynczych komórkach wyizolowanych z serc myszy alfa-SMA-GFP po zawale mięśnia sercowego. Reprezentatywny schemat bramkowania wykazuje współekspresję komórek GFP-dodatnich CD31, CD45 lub AN2.W uszkodzonych sercach myszy niewielki odsetek komórek śródbłonka i komórek krwiotwórczych wykazywał ekspresję GFP. Jednak komórki GFP-dodatnie/CD31-ujemne/CD45-ujemne nie wykazywały ekspresji AN2, markera perycytów. Komórki GFP-dodatnie wykazywały ekspresję alfa-SMA, kolagen jeden alfa jeden, periostyna i wimentyna.Nieuszkodzone fibroblasty wyizolowane przez selektywną adhezję wykazywały ekspresję wimentyny, ale nie wykazywały ekspresji alfa-SMA, periostyny lub kolagenu alfa-jednego. Zarówno nieuszkodzone, jak i aktywowane fibroblasty wykazywały ekspresję antygenu MEFSK4. Zarówno nieuszkodzone fibroblasty, wyizolowane przez selektywną adhezję, jak i miofibroblasty, wyizolowane i posortowane od myszy alfa-SMA-GFP, wykazały zdolność do kurczenia kolagenu.Ważne jest, aby dokładnie zmielić tkankę przed inkubacją. Przed separacją na podstawie kulek ważne jest, aby przepuścić zawiesinę przez filtr o średnicy 40 mikrometrów, aby zapobiec agregacji komórek. Komórki oczyszczone tą metodą mogą być dalej oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych związanych z przeciwciałami specyficznymi dla perycytów, aby zapewnić wysoki poziom czystości.Dzięki dostępności nowych przeciwciał sprzężonych z kulkami, a także reporterowych myszy transgenicznych, można wykorzystać te techniki do izolowania i badania różnych populacji komórkowych, nie tylko fibroblastów.

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli kardiomiocytów komorowych dorosłych szczurów (ARVC). Izolowany ARVC może być stosowany do krótko- i długotrwałej uprawy. Izolacja i hodowla ARVC może odegrać kluczową rolę w opracowywaniu nowych schematów leczenia chorób serca.

Izolacja i hodowla dorosłych kardiomiocytów szczurów

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

Poznaj metodę izolacji fibroblastów i miofibroblastów z serca myszy w celu badania mechanizmów gojenia ran i zwłóknienia. Technika zapewnia wysoką czystość próbek i elastyczność w zastosowaniu.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Przeglądaj więcej filmów