Name: Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj izolację jednojądrzastych komórek migdałków do badań odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej. Ta metoda pozwala uzyskać żywotne komórki zachowujące integralność do analiz ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) za eksperymenty i stypendium N.B. (AAP 2017: 166). N.S. dziękuje za wsparcie ze strony ANRS w zakresie stypendium (AAP 2016 1), Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej EMBO w celu uzyskania stypendium (LT 834 2017), programu finansowania start-upów "Baustein" Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Ulm (LSBN.0147) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Próbki nie są zbierane specjalnie do celów badawczych, a badanie nie jest uważane za inwazyjne. Jednak pobieranie migdałków ludzkich wymaga etycznej zgody odpowiednich władz lokalnych. W naszym przypadku został on zatwierdzony przez Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Ponadto wymagana jest zgoda każdego pacjenta lub przedstawiciela prawnego na uzyskanie danych osobowych dawców (np. płeć, wiek, historia zakażeń laryngologicznych), które mogą pomóc w interpretacji wyników eksperymentu.
1. Postępowanie z ludzką tkanką migdałków
<ol>
	<li>Umieścić migdałki od każdego dawcy w jednej sterylnej 50 ml fiolce zawierającej 25 ml PBS 1x i przetransportować w temperaturze pokojowej (RT) do laboratorium zgodnie z zaleceniami władz (stosować trzy poziomy ochrony: fiolki, bezpieczne pudełko i torbę). 
	nuta: Cała procedura powinna być przeprowadzona w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Ze wszystkimi próbkami ludzkimi należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ nie zostały one wcześniej zakwalifikowane i mogą zawierać czynniki zakaźne.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie narzędzia pomiędzy każdym użyciem.
	<ol>
		<li>Po użyciu zdemontować sitko do komórek i przechowywać przez noc wraz ze wszystkimi innymi narzędziami (np. tłuczkiem, kleszczami) w kąpieli zawierającej roztwór detergentu (1/10 objętości detergentu wH2O).</li>
		<li>Wyszczotkuj każde naczynie, aby usunąć chusteczkę i umyj je czystą wodą.</li>
		<li>Dobrze wysusz wszystkie części, a następnie przygotuj sitko do komórek (85 ml, średnica 37 mm), umieszczając stalową siatkę o oczkach 60 na siatce stalowej o oczkach 10 i szczelnie zamknij pierścień.</li>
		<li>Umieść wszystkie narzędzia w sterylnych torbach i autoklawie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza tkanki migdałków ludzkich i izolacja komórek jednojądrzastych migdałków (TMC)
<ol>
	<li>Umieść sitko komórkowe na jednym naczyniu do hodowli komórkowych o wymiarach 150 x 25 mm2 (SPL150), a wszystkie narzędzia w innym naczyniu do hodowli komórkowych SPL150, aby utrzymać ich sterylność.</li>
	<li>Przenieść migdałki z fiolki do sitka komórkowego za pomocą sterylnych kleszczy. Wlej również cały PBS, który zawiera niektóre komórki, które opuściły migdałki. W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby zanurzyć siatkę. 
	nuta: Tkanka powinna być zanurzona przez cały czas, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Usuń kauteryzowaną, krwawą i mięśniakową tkankę za pomocą kleszczy i skalpela. 
	nuta: Migdałki usunięte u dzieci nie wymagają tego kroku.</li>
	<li>Pokrój tkanki na małe kawałki o średnicy mniejszej niż 0,5 cm za pomocą skalpela i zakrzywionej pęsety. Wytnij całą tkankę, aby małe kawałki można było zanurzyć przez cały czas.</li>
	<li>Umieść kilka kawałków chusteczki w sitku do komórek i zeskrob je na siatkę szklanym tłuczkiem, aż pozostanie tylko naprawdę cienka warstwa białego zrębu. Usuń i wyrzuć zrąb, aby uniknąć zatkania siatki.</li>
	<li>Gdy wszystkie tkanki zostaną przeciśnięte przez siatkę, użyj pipety o pojemności 10 ml, aby przenieść całą zawiesinę komórek na siatkę i zeskrobać ją po raz ostatni.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml do sterylnej fiolki. Umyj siatkę i sitko komórkowe za pomocą PBS 1x. Pozwól zawiesinie ogniw odpoczywać przez 5 minut w RT na ławce. Ten krok pozwala na wytrącenie i aglomerację resztek zrębu, martwych komórek i uwolnionego DNA oraz ułatwi następny krok.</li>
	<li>Umieścić sterylne sito o pojemności 70 μm na nowej fiolce o pojemności 50 ml (ostrożnie wyjąć z koperty) i delikatnie przenieść na nie zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Nie mieszać zawiesiny, ponieważ często występuje w niej osad. Jeśli sito jest zatkane, użyj tylnej części sterylnej końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zarysować komórki znajdujące się przez sito. Zmieniaj sitko tak często, jak to konieczne.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, delikatnie mieszając fiolkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 35 ml PBS.</li>
	<li>W nowej fiolce umieścić na wierzchu nowe sito o wielkości 70 μm i przenieść na nie zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Jeśli sito jest zatkane, należy zastosować technikę opisaną w kroku 2.7.</li>
</ol>
3. Izolacja TMC za pomocą gradientu gęstości komórek
UWAGA: TMC mogą być używane po kroku 2.10. Jednak, aby uzyskać bardziej klarowny roztwór komórkowy i usunąć inne resztki komórek i wszelkie krwinki czerwone, zaleca się wykonanie izolacji gradientu gęstości komórek jednojądrzastych.
<ol>
	<li>Dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości (d = 1,076 g/ml) do nowej fiolki o pojemności 50 ml. Wlać roztwór TMC na podłoże o gradiencie gęstości, uważając, aby zminimalizować mieszanie się zawiesiny z podłożem o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Odwirować roztwór przy 1 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z przyspieszeniem i odrywać.</li>
	<li>Usunąć pipetą o pojemności 10 ml i wyrzucić górną warstwę (zawierającą głównie PBS 1x) bez naruszania granicy faz między TMC a podłożem o gradiencie gęstości. 
	nuta: TMC zawiera niewielką liczbę erytrocytów, dlatego roztwór jest klarowny. W związku z tym interfejs między roztworem TMC w PBS a ośrodkiem gradientu gęstości może być trudny do wizualizacji. W związku z tym ogniwa można ponownie zawiesić w RPMI 1640 uzupełnionym o 20 mM HEPES (bez FBS) przed wykonaniem gradientu gęstości.</li>
	<li>Wyjąć TMC za pomocą sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1 ml i umieścić w nowej fiolce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 50 ml PBS zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM EDTA i odwirować probówkę o stężeniu 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia pozostałych płytek krwi.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.5, ale odwirować probówkę o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną (R10), uzupełniając RPMI 1640 10% inaktywowanym termicznie FBS, 2 mM L-glutaminy i roztworem antybiotyku (100 U/ml penicillium i 100 μg/ml streptomycyny).</li>
	<li>Ponownie zawiesić TMC w 10 ml R10 i policzyć komórki. Średnio ta technika daje 5 x 108-2 x 109 TMC na parę migdałków. Komórki mogą być teraz wykorzystywane do badań, takich jak PBMC z krwi pełnej (np. oczyszczanie określonego typu komórek, hodowla komórek, cytometria przepływowa, RT-qPCR, zamrażanie itp.).</li>
	<li>W razie potrzeby zamrozić komórki do dalszego wykorzystania przy użyciu standardowych technik pierwotnego zamrażania komórek.
	<ol>
		<li>Policz liczbę komórek.</li>
		<li>Odwirować komórki i usunąć supernatant. Rozpuść osad w wystarczającej ilości 100% FBS do końcowego stężenia 1 x 108 komórek / ml, a następnie dodaj tę samą objętość 80% roztworu FBS + 20% DMSO. Komórki będą wtedy miały wymiary 5 x 107 komórek/ml. Ten krok należy wykonać w temperaturze 4 °C, a roztwór FBS i DMSO należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
		<li>Rozprowadzić 1 ml roztworu komórkowego do krioprobówek i umieścić je w pojemniku do powolnego zamrażania, który przez noc był w temperaturze 4 °C, aby kontrolować szybkość zamrażania komórek. Umieścić w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Aby rozmrozić komórki, umieść kriowiale w ciepłej kąpieli o temperaturze 37 °C na kilka sekund przy ciągłym mieszaniu. Gdy tylko komórki zaczną się rozmrażać, przenieś je do 49 ml R10 i odwiruj w celu usunięcia DMSO. Policz komórki i użyj ich jako PBMCs. 
		nuta: Chociaż zamrożenie i rozmrożenie TMC usunie zanieczyszczenia, uszkodzi również niektóre rzadkie typy komórek. Jeśli po rozmrożeniu pozostaną grudki lub zanieczyszczenia, najlepiej przepuścić zawiesinę komórkową przez sterylne sito 70 μm przed jej użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Fenotypowanie TMC metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Pobierz 5 x 106 komórek z poprzedniego roztworu dla każdego panelu mieszaniny przeciwciał, który ma być przetestowany, i umieść w probówce cytometrycznej o pojemności 5 ml. Pobierz 1 x 106 komórek dla niezabarwionej kontroli.</li>
	<li>Przemyć komórki w PBS i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić je ponownie w 500 μl PBS (1 x 106 komórek/ml) i inkubować z barwnikiem żywotności przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Dodać 5 μl inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB na 100 μl zawiesiny komórkowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki w PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (bufor do mycia) i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić TMC w 500 μl buforu płuczącego zawierającego przeciwciała, jak wyszczególniono w Tabeli 1. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki w buforze płuczącym i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić TMC w 500 μl PBS zawierającego 0,5% paraformaldehydu (PFA). Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu wykrycia metodą cytometrii przepływowej. 
	nuta: PFA jest niebezpieczny. Użyj komercyjnego, gotowego do użycia roztworu, aby przygotować 0,5% roztwór PFA.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>przeciwciało</td>
			<td>klon</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>firma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Żywe trupy</td>
			<td></td>
			<td>Zobacz materiał BV405</td>
			<td>ThermoFisher Naukowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD3</td>
			<td>Z dodatkiem SP34-2</td>
			<td>Silnik V500</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD8</td>
			<td>Zobacz materiał SK1</td>
			<td>Amcyjan</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD8</td>
			<td>Zobacz materiał BW135/80</td>
			<td>VioBlue (Niebieski)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD4</td>
			<td>Sterownik RPA-T4</td>
			<td>PE-CY7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD45</td>
			<td>Zobacz materiał HI30</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td> powiedział:
			<td>Bd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD19</td>
			<td>Dysk HD237</td>
			<td>Ecd</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD20</td>
			<td>2H7</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD14</td>
			<td>Zobacz materiał M5E2</td>
			<td>PE-cy7</td> powiedział:
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD14</td>
			<td>Zobacz materiał M5E2</td>
			<td>Apc</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD16</td>
			<td>3G8</td> powiedział:
			<td>APC-H7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD56</td>
			<td>Zobacz materiał MEM188</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td> powiedział:
			<td>Zobacz materiał 7G3</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certyfikat BDCA-1</td>
			<td>L161</td>
			<td>Błękit Pacyfiku</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zobacz materiał BDCA-3</td>
			<td>AD5-14H12</td>
			<td>Międzynarodowa Federacja Piłki</td> Nożnej (
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certyfikat BDCA-4</td>
			<td>AD5-17F6</td>
			<td>Apc</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>Zobacz materiał G646-6</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td> powiedział:
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płyta CD11c</td>
			<td>3,9</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>Nauki elektroniczne</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista przeciwciał do charakterystyki komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
5. Przykład aktywacji TMC i pomiaru produkcji cytokin
<ol>
	<li>Rozcieńczyć TMC w pożywce R10, aby uzyskać stężenie 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Rozprowadź 400 000 TMC w 200 μl R10 w 96-dołkowej okrągłej płycie dennej.</li>
	<li>Aby aktywować komórki, dodaj 5 μg/ml agonisty TLR7/8 resikwimodu (R848) na noc.</li>
	<li>Odwirować płytki i pobrać supernatant TMC i zamrozić go do dalszej analizy. Produkcja cytokin zostanie oceniona za pomocą testów immunologicznych opartych na kulkach w celu ilościowego określenia wielu rozpuszczalnych cytokin jednocześnie za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Oceń żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu żywotności komórek zgodnie z protokołem producenta. Krótko dodaj 60 μl roztworu żywotności komórek do studzienek i zmierz luminescencję w ciągu 10 minut (akwizycja przez 1 s/studzienkę).</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+History+of+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses+and+Man%3A+A+History+of+Interactions%22%5BJournal%5D)">A History of Cell Culture.</a> Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).</li>
<li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+%28strain+HeLa%29+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li>
<li>Jones, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Record+of+the+first+physician+to+see+Henrietta+Lacks+at+the+Johns+Hopkins+Hospital%3A+History+of+the+beginning+of+the+HeLa+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).</li>
<li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Testing+of+Candidate+Topical+Microbicides+for+Anti-Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Activity+and+Tissue+Toxicity+in+a+Human+Cervical+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li>
<li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Colorectal+Explant+Culture+to+Evaluate+Topical+Microbicides+for+the+Prevention+of+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li>
<li>Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Infection+of+Human+Lymphoid+Tissue+and+Female+Genital+Mucosa+with+Human+Immunodeficiency+Virus+1+and+Histoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57013(2018).</li>
<li>Elmore, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Histopathology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 687(2006).</li>
<li>Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+as+Targets+of+Vaccines+and+Adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopotentiators+in+Modern+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants.</a> Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).</li>
<li>Bachert, C., Möller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Tonsille+als+MALT+%28mucosa-associated+lymphoid+tissue%29+der+Nasenschleimhaut%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngo-Rhino-Otologie%22%5BJournal%5D)">Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut.</a> Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).</li>
<li>Perry, M., Whyte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+the+tonsils%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Immunology of the tonsils.</a> Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).</li>
<li>Perry, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specialised+structure+of+crypt+epithelium+in+the+human+palatine+tonsil+and+its+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance.</a> Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).</li>
<li>Cesta, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Structure%2C+Function%2C+and+Histology+of+Mucosa-Associated+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).</li>
<li>Kaditis, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstructive+sleep+disordered+breathing+in+2-to+18-year-old+children%3A+diagnosis+and+management+TASK+FORCE+REPORT+ERS+STATEMENT%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT.</a> European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).</li>
<li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAART+reduces+death+ligand+but+not+death+receptors+in+lymphoid+tissue+of+HIV-infected+patients+and+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).</li>
<li>Herbeuval, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+IFN-alpha+and+TRAIL%2FDR5+in+lymphoid+tissue+of+progressor+versus+nonprogressor+HIV-1-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).</li>
<li>Smith, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+TLR7-mediated+type+I+IFN+signaling+in+pDCs+through+CXCR4+engagement-A+new+target+for+lupus+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment.</a> Science Advances. 5 (7), eaav9019(2019).</li>
<li>Lucas-Hourani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pyrimidine+biosynthesis+pathway+suppresses+viral+growth+through+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678(2013).</li>
<li>Kleiveland, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%22%5BJournal%5D)">Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).</li>
<li>Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDCA-1%2B%2C+BDCA-2%2B+and+BDCA-3%2B+dendritic+cells+in+early+human+pregnancy+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua.</a> Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).</li>
<li>Papaioannou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Dependent+Changes+in+the+Size+of+Adenotonsillar+Tissue+in+Childhood%3A+Implications+for+Sleep-Disordered+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing.</a> The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Migdałki ludzkie stanowią integracyjny i fizjologiczny model ex vivo do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na granicy śluzówki, ponieważ naśladują rolę wtórnego narządu limfatycznego. Co ciekawe, skład komórkowy TMC jest podobny do PBMC i obejmuje wszystkie główne populacje komórek, chociaż ich odsetek może różnić się od PBMC z krwi (Figura 1). Można również znaleźć dodatkowe populacje, ponieważ wszystkie odpowiedzi immunologiczne są inicjowane w tkankach (błona śluzowa lub wtórn...

Badania nad ludzkimi organami są ograniczone ze względu na dostępność, jak również oczywiste powody etyczne. Są one jednak niezbędne, aby w pełni zrozumieć złożoność biologii człowieka. Hodowle izolowanych komórek (hodowle pierwotne lub linie komórkowe) są standardowym systemem w badaniach biologii komórki ze względu na ich dostępność. Podczas gdy izolowane hodowle komórkowe pozwoliły na dokonanie wybitnych odkryć, zastosowanie linii komórkowych zostało poddane bliższej analizie, ponieważ nie naśladują one w pełni biologii narządów in vivo. Jednak hodowla trójwymiarowych komórek lub eksplantatów tkanek jest bardzo złożona4,5,6. Rzeczywiście, fragment tkanki lub narządu jest wysoce niejednorodny, ponieważ jego skład komórkowy różni się w zależności od lokalizacji w tkance. W związku z tym wykorzystanie bloków tkankowych wymaga analizy wielu technicznych i biologicznych powtórzeń, co prowadzi do zapotrzebowania na dużą liczbę dawców lub pacjentów.
Tkanki limfoidalne związane z błoną śluzową (MALT) są strukturalnie podobne do węzłów chłonnych, ale mają unikalne funkcje, ponieważ ich główną rolą jest regulacja odporności błony śluzowej7. W przeciwieństwie do węzłów chłonnych, które zwykle znajdują się w pewnej odległości od tkanek, MALT znajduje się na ogół bezpośrednio pod nabłonkiem tkanki błony śluzowej. Histologicznie składają się głównie z wysokich stężeń limfocytów B i T, ale także komórek prezentujących antygen, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne. Słód stanowi około 50% tkanki limfatycznej w organizmie człowieka. Słód dzieli się na dziewięć grup w zależności od lokalizacji: GALT (jelito), BALT (oskrzela), NALT (nosowy), CALT (spojówkowy), LALT (krtań), SALT (skóra), VALT (srom), O-MALT (zorganizowany) i D-MALT (rozproszony). O-MALT składa się głównie z migdałków pierścienia migdałkowego Waldeyera i jest najbardziej dostępnym MALT8,9. Rzeczywiście, migdałki znajdujące się w jamie ustnej gardła stanowią główną barierę chroniącą drogi pokarmowe i oddechowe przed (potencjalnymi) inwazyjnymi mikroorganizmami10. Ponadto migdałki są pokryte cienkim, warstwowym, płaskonabłonkowym, nierogowacącym nabłonkiem, podtrzymywanym przez torebkę z tkanki łącznej zawierającą naczynia krwionośne, nerwy i limfatykę, zapewniając łatwy dostęp do komórek odpornościowych11,12. Co więcej, tonsillektomia, chirurgiczny akt usuwania migdałków, jest powszechnym zabiegiem wykonywanym u dzieci z zaburzeniami oddychania podczas snu, co sprawia, że migdałki są łatwo dostępne w warunkach fizjologicznych><.
Migdałki pozwalają na badanie odpowiedzi komórek odpornościowych w patologiach związanych z odpornością błony śluzowej. Rzeczywiście, w zakażeniu wirusem HIV, ponieważ migdałki składają się z wysokiego stężenia komórek odpornościowych, są one głównym celem replikacji wirusa, ale także wytwarzają dużą ilość cytokin, które nie są wykrywane w krążeniu14,15. W stanach stacjonarnych rzadkie populacje komórek podobnych do wrodzonych są obecne w różnych tkankach błony śluzowej, w tym w migdałkach, ale zasadniczo nie ma ich we krwi.
Tak więc, komórki jednojądrzaste z migdałków (TMC) są bardziej istotnym i złożonym modelem niż PBMC i mogą odpowiadać na głębsze pytania. Z drugiej strony, stosowanie eksplantatów tkankowych może być złożone i nie zawsze ma znaczenie dla badań nad odpornością wrodzoną. W związku z tym stworzyliśmy model do badania aktywacji immunologicznej błony śluzowej za pomocą TMCs16. W tym miejscu opisujemy metodę skutecznej izolacji TMC ze świeżych migdałków ludzkich. Metoda ta pozwala na odzyskanie dużej liczby komórek odpornościowych przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności w badaniach ex vivo.

<table><tbody><tr><td>Siatka stalowa 10 oczek - 1910 &micro; m</td><td>Dutscher</td><td>198586</td><td>Do umieszczenia w sitku komórkowym Cellector</td></tr><tr><td>60 oczek siatka stalowa - 230 &mikro; m</td><td>Dutscher</td><td>198591</td><td>Do włożenia sitka do komórek Cellector</td></tr><tr><td>70 & micro; m białe sitka do komórek ClearLine</td><td>Dutscher</td><td>141379C</td><td></td></tr><tr><td>Anios Excell D detergent</td><td>Dutscher</td><td>59852</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyku, 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 U/ml Penicilium i 100 &mu; g/ml Streptomycyna - do dodawania do pożywek</td></tr> hodowlanych <tr><td>BD FalconTM Probówki okrągłodenne, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>probówki FACS</td></tr><tr><td>Sitko do komórek Cellector, 85 ml i średnicy 37 mm</td><td>Dutscher</td><td>198585</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo (CTG) Test żywotności komórek luminescencyjnych</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Test żywotności</td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe Falcon 50 ml</td><td>Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zakrzywiona</td><td>Dutscher</td><td>711200</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>EnVision</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Mierzy luminescencję</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Aby dodać do pożywki hodowlanej</td>, <td></td><td></td></tr><tr><td>znaczniki fluorescencyjne, przeciwciała</td><td>Patrz Tabela 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklany tłuczek</td><td>Dutscher</td><td>198599</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630056</td> Stosować w inkubatorze <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM Panel odpowiedzi na wirusa dla ludzi BioLegend</td><td></td><td>740390</td> Test <td>immunologiczny na bazie koralików</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>StemCell</td><td>7801</td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Pojemnik Mr. Frosty</td><td>Thermo Fisher</td><td>5100-0001</td><td>Pojemnik do powolnego zamrażania</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd (w/v), bez metanolu</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Resiquimod (R848)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-r848</td><td>Agonista</td></tr> <tr><td>TLR7/8RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>SPL Naczynie do hodowli komórkowych, 150 mm x 25 mm (SPL150)</td><td>Dutscher</td><td>330009</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne sterylne N&deg; 23</td><td>Dutscher</td><td>132523</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Kulki kompensacyjne</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-2222-41</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>Do przygotowania buforu do płukania w PBS</td></tr></tbody></table>

izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Badanie izolowanych komórek z tkanek limfoidalnych związanych z błoną śluzową (MALT) pozwala zrozumieć odpowiedź komórek odpornościowych w patologiach związanych z odpornością błony śluzowej, ponieważ mogą one modelować interakcje gospodarz-patogen w tkance. Podczas gdy izolowane komórki pochodzące z tkanek były pierwszym modelem hodowli komórkowej, ich zastosowanie zostało zaniedbane, ponieważ tkanka może być trudna do uzyskania. W niniejszym protokole wyjaśniamy, jak łatwo przetwarzać i hodować jednojądrzaste komórki migdałków (TMC) ze zdrowych migdałków ludzkich w celu zbadania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych po aktywacji, naśladując infekcję wirusową w tkankach błony śluzowej. Izolacja TMC od migdałków jest szybka, ponieważ migdałki prawie nie mają nabłonka i dają do miliardów wszystkich głównych typów komórek odpornościowych. Metoda ta umożliwia wykrycie produkcji cytokin za pomocą kilku technik, w tym testów immunologicznych, qPCR, mikroskopii, cytometrii przepływowej itp., Podobnie jak w przypadku stosowania obwodowych komórek jednojądrzastych (PBMC) z krwi. Ponadto TMC wykazują wyższą czułość na testy narkotykowe niż PBMC, co należy wziąć pod uwagę przy przyszłych testach toksyczności. W związku z tym posiewy TMC ex vivo są łatwym i dostępnym modelem błony śluzowej.

W pierwszej kolejności scharakteryzowano profil immunologiczny komórek obecnych w hodowli oraz przeanalizowano liczbę TMC. Fenotypowanie TMC z migdałków przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na Rysunku 1, wszystkie główne typy komórek odpornościowych obecne w PBMC z krwi były reprezentowane w TMC z migdałków. Jednak w TMC częstość wszystkich typów komórek, z wyjątkiem limfocytów B, była niższa niż w PBMC.
<p class="jove_content" f...

W obecnym protokole wyjaśniamy, jak łatwo przetwarzać i hodować jednojądrzaste komórki migdałków od zdrowych ludzi poddawanych częściowej chirurgicznej operacji wycięcia migdałków, aby badać wrodzone reakcje immunologiczne po aktywacji, naśladując infekcję wirusową w tkankach błony śluzowej.

Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Komórki jednojądrzaste migdałków są bardziej istotne i złożone niż komórki krwi, a ich izolacja pozwala na badanie odpowiedzi komórek odpornościowych w patologiach związanych z odpornością błony śluzowej. Opracowana przez nas technika pozwala na odzyskanie dużej liczby komórek odpornościowych z tkanki błony śluzowej przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności w badaniach ex vivo. Metoda jest dość prosta, ale z migdałkami należy obchodzić się szybko i ostrożnie, aby zmaksymalizować wydajność.Przetransportować ludzką tkankę migdałków do laboratorium zgodnie z opisem w tekście rękopisu. Następnie umieść sitko komórkowe na naczyniu hodowlanym o wymiarach 150 na 25 milimetrów. Umieść wszystkie narzędzia do preparowania w innym naczyniu, aby były sterylne.Ze wszystkimi głównymi próbkami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ nie zostały one wcześniej zakwalifikowane i mogą zawierać czynniki zakaźne. Następnie wlej PBS z fiolki do sitka, ponieważ będzie ono zawierało kilka komórek, które opuściły migdałki. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś migdałki z fiolki do naczynia hodowlanego za pomocą sterylnych kleszczy.W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby zanurzyć siatkę. Rozwarstwienie zajmie około 45 minut na migdałek. Bardzo ważne jest, aby w tym czasie migdałki były zanurzone, aby zapewnić dobrą żywotność i wydajność komórek.Usuń kauteryzowaną tkankę krwi i mięśniaków za pomocą kleszczy i skalpela. Za pomocą skalpela i zakrzywionej pęsety pokrój tkankę na małe kawałki o średnicy mniejszej niż pół centymetra. Wytnij całą tkankę, aby małe kawałki można było zanurzyć przez cały czas.Umieść kilka kawałków chusteczki w sitku do komórek. Zeskrob je na siatkę szklanym tłuczkiem, aż pozostanie tylko bardzo cienka warstwa białego zrębu. Usuń i wyrzuć zrąb, aby uniknąć zatkania siatki.Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety przenieś zawiesinę komórek na siatkę i zeskrob ją po raz ostatni. Następnie za pomocą 10-mililitrowej pipety przenieś zawiesinę komórek do sterylnej fiolki. Raz przemyć siatkę i sitko komórkowe PBS, a następnie przenieść PBS do fiolki.Przed kontynuowaniem pozostaw zawiesinę komórek na ławce przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść sterylne sito o długości 70 mikrometrów na nowej fiolce o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie przenieś zawiesinę komórek na sito za pomocą 10-mililitrowej pipety.Jeśli sitko jest zatkane, użyj tylnej części sterylnej jednomililitrowej końcówki pipety, aby zeskrobać komórki przez sito. Zmieniaj sitko tak często, jak to konieczne. Odwirować komórki w temperaturze 250 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad, delikatnie stukając w fiolkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 35 mililitrach PBS. Aby zakończyć pierwszą fazę izolacji komórek, umieść nowe sito o średnicy 70 mikrometrów na wierzchu nowej fiolki i przenieś na nie zawiesinę komórek za pomocą 10-mililitrowej pipety.Aby uzyskać bardziej klarowny roztwór komórek, zacznij od dodania 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do nowej 50-mililitrowej fiolki. Wlej roztwór TMC na podłoże o gradiencie gęstości, uważając, aby zminimalizować mieszanie. Następnie odwirować roztwór o sile 1000 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z przyspieszeniem i wyłączeniem hamowania.Po wyjęciu fiolki z wirówki użyj 10-mililitrowej pipety, aby usunąć i wyrzucić górną warstwę. Nie zakłócaj interfejsu między TMC a medium gradientu gęstości. Następnie wyjmij TMC za pomocą sterylnej jednomililitrowej końcówki pipety i przenieś je do nowej 50-mililitrowej fiolki.Aby umyć komórki, najpierw dodaj 50 mililitrów PBS zawierających 2% płodowej surowicy bydlęcej i 2 milimolowe EDTA. Następnie odwirować probówkę o ciśnieniu 250 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie umyj komórki, ale tym razem odwiruj probówkę o stężeniu 400 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przygotuj pożywkę hodowlaną R10, uzupełniając RPMI 1640 10% inaktywowanym termicznie FBS, 2-milimolową L-glutaminą i roztworem antybiotyku. Ponownie zawiesić TMC w 10 mililitrach R10. Następnie policz komórki.Komórki mogą być wykorzystane natychmiast lub zamrożone do wykorzystania w przyszłości, zgodnie z opisem w manuskrypcie. TMC wybarwiono, inkubowano z przeciwciałami i scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej. TMC zawierały wszystkie główne typy komórek odpornościowych obecnych w obwodowych komórkach jednojądrzastych z krwi, w skrócie PMBC.Jednak częstość występowania wszystkich typów komórek, z wyjątkiem limfocytów B, była niższa w TMC niż w PBMC. Aby zbadać aktywację komórek w produkcji cytokin, TMC stymulowano przez noc resikwimodem R848. TMC, wykreślone na niebiesko, wyprodukowały wszystkie badane cytokiny z wyjątkiem IFN Lambda 2/3 i IL-8, chociaż produkcja była niższa niż w PBMC, wykreślonych na zielono.Wzrosty fałdy porównujące stymulację R848 do braku stymulacji są zaznaczone na czerwono. Oczyszczone i wyizolowane TMC, niebieskie i pomarańczowe bloki tkanki migdałkowej, stymulowano przez 24 godziny wirusem grypy A, IAV. Produkcję IFN wykryto w TMC, ale nie w supernatancie bloków tkankowych, co wskazuje, że eksplantaty tkankowe nie są najlepszym modelem do badania wydzielania cytokin i aktywacji komórek.Po wstępnej inkubacji z toksycznym lekiem C1 i stymulacji R848, TMC i PBMC zostały przetestowane pod kątem żywotności. TMC były bardziej wrażliwe na C1. Sugeruje to, że nowe leki w przyszłych terapiach powinny być testowane na komórkach z tkanek, a nie tylko na liniach komórkowych, PBMC czy eksplantatach tkankowych. Ta procedura pozwala nam używać TMC, takich jak PBMC z krwi pełnej i przeprowadzać te same eksperymenty komórkowe, takie jak oczyszczanie określonego typu komórek, hodowla komórek, cytometria przepływowa lub zamrażanie.Izolacje TMC umożliwiają lepsze scharakteryzowanie, w odpowiednim modelu, odpowiedzi immunologicznej w wtórnych narządach limfatycznych w patologiach obejmujących odporność błony śluzowej.

isolation-tonsillar-mononuclear-cells-to-study-ex-vivo-innate-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metody badania udziału tkanki chłonnej związanej z nosogardłem (NALT) w nosowych i systemicznych odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki podawane donosowo. Przedstawiamy procedurę chirurgiczną służącą do stworzenia modelu mysiego zależnego od NALT oraz hodowle ex vivo wyizolowanej tkanki NALT.

Badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Migdałki podniebienne są bogatym źródłem limfocytów B i T. Tutaj zapewniamy łatwy, skuteczny i szybki protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych. Opisana metoda została specjalnie dostosowana do badań nad wirusową etiologią zapalenia migdałków znanego jako zapalenie migdałków.

Skuteczny protokół izolacji limfocytów B i T z ludzkich migdałków podniebiennych

Ustaliliśmy technikę izolacji, charakterystyki fenotypowej i analizy funkcjonalnej komórek odpornościowych z mysiego dziąsła.

Izolacja, charakterystyka i badanie funkcjonalne sieci komórek odpornościowych dziąseł

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym badaniu prezentujemy nowatorski i skuteczny protokół izolacji limfocytów z plastrów Peyera (PPs), który może być następnie wykorzystany do testów funkcjonalnych in vivo i in vitro, a także do badań cytometrycznych komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego.

Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Poznaj izolację jednojądrzastych komórek migdałków do badań odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej. Ta metoda pozwala uzyskać żywotne komórki zachowujące integralność do analiz ex vivo.

Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja jednojądrzastych komórek migdałków w celu zbadania ex vivo wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w tkance limfatycznej błony śluzowej człowieka

Przeglądaj więcej filmów