Name: Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę TRAP do badania rozwoju korzeni Arabidopsis thaliana na poziomie pojedynczych typów komórkowych. Technika ta umożliwia izolację wysokiej jakości RNA z polisomów przy użyciu specyficznych dla komórki promotorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jean-Claude'owi Walserowi z Centrum Różnorodności Genetycznej w Zurychu za kluczowe porady ekspertów we wczesnej fazie tego projektu. Prace w laboratorium Vermeera były wspierane przez grant profesury SNF (PP00P3_157524) oraz grant na sprzęt R'EQUIP (316030_164086) ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNSF) przyznany JEMV.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Weryfikacja wzorca lokalizacji RPL18 Kluczowe znaczenie dla uniknięcia błędnej interpretacji danych z jakiegokolwiek eksperymentu TRAP ma właściwy wzorzec ekspresji znakowanej podjednostki rybosomalnej. W związku z tym, włączenie GFP jako znacznika epitopu do RPL18 bardzo elegancko pozwala na weryfikację pożądanego wzorca ekspresji, a co za tym idzie, na usunięcie frakcji polisomowej z tej samej tkanki. Bardziej inwazyjne podejścia w celu zapewnienia prawidłowych wzorców promotorów są stosowane prze...

Dzięki coraz szerszemu zastosowaniu technik sekwencjonowania nowej generacji można zwiększyć rozdzielczość przestrzenną w biologii rozwoju. Współczesne badania dążą do analizy tkanek z dokładnością do wyspecjalizowanych typów komórek, a nawet na poziomie pojedynczych komórek1,2,3,4. W tym celu w ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat opracowano wiele różnych metod (patrz Rysunek 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Wiele narzędzi stosowanych w naukach o roślinach stanowi adaptację technik opracowanych pierwotnie w badaniach nad zwierzętami. Nie dotyczy to jednak metody, którą szczegółowo przedstawiamy w niniejszym opracowaniu. W 2005 roku, opierając się na szerokiej wiedzy z zakresu translacji białek, zespół z laboratorium Bailey-Serres podjął próbę modyfikacji białek rybosomalnych w celu ich późniejszego oczyszczania powinowactwem16. Pozwoliło to uniknąć czasochłonnego i pracochłonnego profilowania polisomów, które opiera się na ultrodocentryfugacji w gradiencie sacharozy i jest stosowane do oceny rybosomów w procesie translacji od lat 60. XX wieku17,18. Metoda ta została odtąd nazwana oczyszczaniem rybosomów translacyjnych metodą powinowactwa (TRAP)16. Po pomyślnym przeprowadzeniu badań translatomu u roślin, Heiman i wsp. zaadaptowali metodę TRAP dla zwierząt19, a inni rozszerzyli jej zastosowanie na drożdże20, Drosophila21, Xenopus22 oraz zebrafish23,24.
Chociaż modyfikacja genetyczna systemu modelowego jest warunkiem wstępnym dla metody TRAP, co ogranicza jej zastosowanie do gatunków podatnych na transformację genetyczną, można wykorzystać to ograniczenie do celowania w podgrupy komórek o szczególnym znaczeniu, które w inny sposób byłyby niezwykle trudne do wyizolowania z nienaruszonej tkanki lub organu25 (np. silnie rozgałęzione komórki dendrytyczne w mózgu myszy lub strzępki grzybów w zainfekowanej tkance roślinnej). W roślinach wszystkie komórki są utrzymywane na miejscu przez ściany komórkowe, które stanowią podstawę szkieletu hydrostatycznego26. Aby uwolnić komórkę roślinną z tej macierzy, naukowcy stosują albo fizyczne wycięcie komórki z otaczającej ją tkanki za pomocą mikrosekcji laserowej (LCM)27, albo enzymatyczne trawienie ścian komórkowych28. W przypadku tych drugich, tzw. protoplastów, interesująca populacja jest znakowana fluorescencyjnie i może być oddzielana za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)7. LCM zazwyczaj wymaga utrwalenia próbki i zatopienia jej w wosku, co w konsekwencji pogarsza jakość RNA29. Metody oparte na FACS pozwalają uzyskać wysokiej jakości RNA, jednak sam proces protoplastowania wprowadza zmiany w ekspresji genów30, a tkanki z modyfikowanymi i grubymi wtórnymi ścianami komórkowymi są znane z trudności w obróbce. Ponadto przyjmuje się, że wiele procesów rozwojowych u roślin opiera się na sygnałach przenoszonych mechanicznie, dlatego nienaruszalność ściany komórkowej ma kluczowe znaczenie31. Dwie metody, które stosują skrót pozwalający uniknąć izolacji całych komórek poprzez operowanie na poziomie jąder, to sortowanie jąder aktywowane fluorescencją (FANS) oraz izolacja jąder znakowanych w specyficznych typach komórek (INTACT). Podobnie jak w TRAP, wykorzystują one specyficzne dla typu komórek promotory do znakowania jąder, które następnie są wzbogacane odpowiednio poprzez sortowanie lub metodę pull-down8,15. Głównym wyzwaniem dla wszystkich tych podejść jest uzyskanie wystarczającej ilości materiału RNA z podgrup komórek w tkance. Ponieważ TRAP wychwytuje tylko część komórkowego RNA, gromadzenie próbek stanowi znaczne wąskie gardło. Dlatego potrzebne są szczególnie czułe protokoły przygotowania bibliotek, aby uzyskać wysokiej jakości dane z niskich ilości materiału wyjściowego.
Od momentu swojego wprowadzenia metoda TRAP była stosowana albo w połączeniu z mikromacierzami DNA, albo – w obliczu znacznego spadku kosztów sekwencjonowania w ostatnich latach – z metodą RNA-seq10,32,33Wiele pytań badawczych zostało już wyjaśnionych, co zostało omówione w przeglądzie Sablok i wsp.34Jesteśmy przekonani, że w nadchodzących latach pojawi się więcej doniesień, ponieważ technika ta jest bardzo wszechstronna w kontekście łączenia różnych promotorów w celu celowania w konkretne typy komórek. W przyszłości będzie to możliwe do zrealizowania również w sposób indukowalny i może zostać połączone z badaniem reakcji rośliny na wiele biotycznych i abiotycznych czynników stresowych. Dodatkowo, w przypadkach, gdy nie dysponowano stabilnymi liniami transgenicznymi, systemy ekspresyjne w korzeniach włóknistych (hairy root) zostały pomyślnie wykorzystane do przeprowadzenia TRAP u pomidora oraz lucerny (medicago).35,36.
<img alt="Schemat metod sekwencjonowania RNA; przedstawia przebieg analizy transkryptomu komórkowego, obejmujący izolację RNA, FACS oraz sekwencjonowanie TRAP wraz z wizualnymi fazami gromadzenia danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Oczyszczanie rybosomów za pomocą powinowactwa translacyjnego (TRAP) uzupełnia portfolio analiz „omicznych”. A. Zwiększona precyzja analityczna, aż do rozdzielczości pojedynczej komórki, a nawet podkomórkowej, może być osiągnięta za pomocą wielu metod lub ich kombinacji. Schemat przedstawia przegląd obecnie dostępnych narzędzi w dziedzinie roślin i zwierząt. Pobieranie tkanek z rozdzielczością komórkową można osiągnąć za pomocą protokołów takich jak LCM lub FACS, które następnie są łączone ze standardowym profilowaniem transkryptomu lub polisomów/analizą translatomu. TRAP i INTACT integrują zarówno wychwytywanie tkanek, jak i izolację RNA, ponieważ opierają się na znakowaniu epitopowym. Jednak INTACT pobiera próbki tylko z jąder komórkowych i stanowi zatem szczególny przypadek analizy transkryptomu. Mała ikona królika oznacza nowo opracowane metody w dziedzinie zwierząt: podczas gdy SLAM-ITseq i Flura-seq opierają się na metabolicznym celowaniu w nowo powstałe RNA za pomocą zmodyfikowanych zasad uracylu w komórkach ekspresujących odpowiedni enzym, Slide-seq wykorzystuje powlekane szkiełka szklane z kodami kreskowymi DNA, które dostarczają informacji pozycyjnych w zakresie komórkowym. W metodzie APEX-seq stosowane jest podejście oparte na znakowaniu bliskościowym w celu pobrania RNA ze specyficznych przedziałów podkomórkowych. Warto zauważyć, że zwiększona rozdzielczość często wymaga wytworzenia materiału transgenicznego (gwiazdki), dlatego metody te są przede wszystkim stosowane w przypadku gatunków modelowych. TRAP jest szczególnie odpowiedni do badań w naukach o roślinach obejmujących ścianę komórkową (CW) lub sygnały mechaniczne, a także w przypadku rodzajów komórek, które trudno jest uwolnić z macierzy CW. B. Szczegółowe kroki laboratoryjne procedury TRAP: siewki ekspresujące białko rybosomalne znakowane GFP w określonych typach komórek (np. endodermie korzenia) są hodowane na szalkach Petriego przez siedem dni, a materiał korzeniowy jest zbierany poprzez gwałtowne zamrażanie. Próbkę kontrolną całkowitego RNA pobiera się z homogenizowanego ekstraktu surowego przed odwirowaniem osadu za pomocą wirowania. Magnetyczne kuleczki anty-GFP są dodawane do oczyszczonego ekstraktu w celu przeprowadzenia immunoprecypitacji. Po inkubacji i trzech etapach płukania, RNA związane z polisomami (RNA TRAP/polisomalne) jest pozyskiwane bezpośrednio poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. LCM: laserowa mikrodysekcja, FACS/FANS: fluorescencyjnie aktywowane sortowanie komórek/jąder, APEX-seq: metoda oparta na zmodyfikowanej askorbinianowej peroksydazie, INTACT: izolacja jąder znakowanych w specyficznych typach komórek, SLAM-ITseq: alkilacja powiązana z tiolem (SH) dla metabolicznego sekwencjonowania RNA w tkance, Flura-seq: sekwencjonowanie RNA znakowanego fluorouracylem (Stworzono za pomocą Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie szczegółowego opisu metody TRAP, wyróżnienie krytycznych etapów oraz udzielenie wskazówek dotyczących możliwej metody przygotowania biblioteki.
Ogólny eksperyment TRAP składa się zasadniczo z następujących etapów (patrz również Rysunek 1B): (1) przygotowanie materiału roślinnego, w tym klonowanie konstruktu do znakowania rybosomów, wytworzenie i selekcja linii transgenicznych, uprawa i namnażanie nasion, sterylizacja i wysiew, aplikacja stresu/obróbka (opcjonalnie) oraz pobieranie tkanek; (2) immunopuryfikacja, obejmująca homogenizację tkanek i klarowanie ekstraktu surowego, przemywanie kulek i immunopuryfikację oraz etapy płukania; (3) ekstrakcja RNA i ocena jego jakości; oraz (4) przygotowanie biblioteki.
Korzeń Arabidopsis służy jako system modelowy do badania rozwoju roślin od czasu wprowadzenia tej rośliny jako modelu37,38. W niniejszej pracy zastosowanie metody TRAP zaprezentowano w kontekście rozwoju korzeni bocznych roślin. U roślin budowa całego systemu korzeniowego opiera się na realizacji tego programu i jest zatem niezwykle istotna dla przetrwania organizmu39. W przypadku Arabidopsis korzenie boczne wywodzą się z tkanki perycyklu, która znajduje się obok naczyń ksylemu i dlatego nazywana jest perycyklem bieguna ksylemowego (XPP; patrz Rysunek 2C)40. Niektóre komórki XPP, zlokalizowane głęboko wewnątrz korzenia, nabywają tożsamości komórek inicjujących i pod wpływem lokalnego impulsu hormonalnego zaczynają proliferować poprzez pęcznienie i podziały antyklinalne41. Jednak ze względu na obecność sztywnej macierzy ścian komórkowych proces ten wywiera naprężenia mechaniczne na sąsiednie tkanki. W szczególności dotyczy to nadkładającej się endodermy, gdyż znajduje się ona na drodze osi wzrostu korzenia bocznego42,43,44. W rzeczywistości nowo powstający prymordium musi wzrosnąć przez nadkładającą się komórkę endodermy (Rysunek 2C2), podczas gdy komórki kory i epidermy są jedynie odpychane na bok, aby prymordium mogło w końcu wyłonić się na zewnątrz45,46. Niedawne prace w naszym laboratorium wykazały, że endoderma aktywnie przyczynia się do umożliwienia proliferacji w perycyklu. Celowe zablokowanie endodermalnego sygnałowania hormonalnego jest wystarczające, aby zahamować nawet pierwszy podział w komórkach XPP47. Zatem komunikacja między perycyklem a endodermą stanowi bardzo wczesny punkt kontrolny rozwoju korzeni bocznych u Arabidopsis. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób odbywa się ta interakcja. Aby rozwiązać tę zagadkę, wybraliśmy podejście TRAP-seq, aby celować w komórki XPP i endodermy. W celu wzbogacenia populacji komórek uczestniczących w programie tworzenia korzeni bocznych, zasymulowaliśmy impuls hormonalny poprzez egzogeniczną aplikację analogu auksyny (kwas 1-naftaloctowy, NAA)48, co jednocześnie pozwoliło na czasowe rozdzielenie początkowej fazy formowania się korzeni bocznych.

<table><tbody><tr><td>Sterylizacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bleach, 13%</td><td>Sigma</td><td>71696</td><td></td></tr><tr><td>zlewka</td><td>VWR</td><td>214-1172/74/75</td><td></td></tr><tr><td>eksykator z płytką porcelanową (DURAN)</td><td>Sigma/Merck</td><td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl, 37%</td><td>Roth</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Plate growth + harvesting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS sole, mieszanka soli podstawowych, w tym bufor MES Instalacja agarowa</td><td>Duchefa</td><td>M0254</td><td></td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych</td><td>Applichem/Panreac</td><td>A2111.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>forcepts</td><td>Rubis Szwajcaria</td><td>5-SA model</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>60370</td><td></td></tr><tr><td>taśma mikroporowa/chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>NAA</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 120x120 mm</td><td>Skalpel</td><td></td> do 688102 <td></td>Greiner bio-one</tr><tr><td></td><td>Chusteczki VWR/Swann-Morton</td><td>233-5454</td><td></td></tr><tr><td>, neutralne, dwuwarstwowe</td><td></td><td></td><td>dowolnie wybrane przez użytkownika</td></tr><tr><td>Immunoprecypitacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-kulki: gtma-100 GFP-Trap_MA</td><td>Chromotek</td>, <td>np. gtma-100</td><td></td></tr><tr><td>Brij-35</td><td>Sigma</td><td>P1254-500G</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe (zgodnie z wirówka)</td><td>Beckman Coulter</td><td>357001</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Applichem</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>rękawice bawełniane</td><td>VWR</td><td>113-7355</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid, klasa HPLC</td><td>Sigma</td><td>01810-1G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>VWR</td><td>E174</td><td>może mieć długie terminy dostaw</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Homogenizatory Sigma</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>DUALL 23</td><td>KONTES GLASS CO (przez VWR)</td><td>SCERSP885450-0023 (zestaw)</td><td>SCERSP885451-0023 tylko tłuczek - tylko cylinder SCERSP885452-0023; długie terminy dostaw</td></tr><tr><td>Igepal CA-360</td><td>Sigma</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 heksahydrat</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>moździerz i tłuczek</td><td>VWR</td><td>470148-960 & 470019-978</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10 837 091 001</td><td></td></tr><tr><td>Polioksyetyleno-(10)-tridecyleter/PTE</td><td>Sigma</td><td>P2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Roth</td><td>T143.3</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780/AM9782</td><td>do czyszczenia powierzchni</td></tr><tr><td>Tris, >99,3% </td><td>Roth</td><td>AE15.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>T8787-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td><silna>ekstrakcja RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol, p.a.</td><td>Sigma</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, klasa HPLC</td><td>Scharlau</td><td>CL02181000</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>Probówki</td> wirówkowe Honeywell <td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>o niskiej retencji, 1,5 ml</td><td>Eppendorf/Sigma</td><td>Z666548-250EA</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>DNaz bez RNaz</td><td>LoBind Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia RNeasy MiniElute Qiagen</td><td></td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie biblioteki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 mL Rurkowy separator magnetyczny</td><td>Abraxis</td><td>PN 472250</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksów A</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksów D</td><td>Magnesy neodymowe Illumina</td><td>FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon/inne</td><td>6 x 1,5 mm zakres: N42 (NdFeB)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024/1096</td><td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td></tr><tr><td>Paski PCR</td><td>Zestaw ThermoScientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer v4</td><td>Takara Bioscience</td><td>634892</td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Instrument specjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA</td></tr><tr><td>Tapestation</td><td>Agilent</td><td>4200 Tapestation Instrument</td><td>specjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA</td></tr><tr><td>Analizator fragmentów</td><td>Agilent</td><td>5400 Analizator fragmentów System</td><td>specjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA (wysoka przepustowość)</td></tr><tr><td>LabChip</td><td>PerkinElmer</td><td>LabChip GX Touch Analizator kwasów nukleinowych</td><td>specjalistyczny sprzęt do kontroli jakości RNA/DNA (wysoka przepustowość)</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 4</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td><td>specjalistyczny sprzęt do oznaczania stężenia RNA/</td></tr><tr><td>DNAqRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA23</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC</td></tr><tr><td>GH3.3</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT</td></tr><tr><td>LBD29</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA</td></tr><tr><td>UBC21</td><td>Mikrosyntezator</td><td></td><td>fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Uniwersalny SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5038</td><td></td></tr><tr><td>miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 15 ml, Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 50 ml, Cellstar</td><td>Greiner Końcówki filtrujące bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S Końcówki</td><td></td></tr><tr><td>filtrujące 10 i mikro; l</td><td>Końcówki filtrów Axygen</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>100 i mikro; l</td><td>Końcówki filtrujące Axygen</td><td>TF-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>20 i mikro; l</td><td>Końcówki filtrów Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; l</td> Probówki do mikrowirówek <td>Axygen</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4170-100MG</td><td></td></tr><tr><td>firma sekwencjonująca</td><td>Novogene</td><td></td><td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td></tr></tbody></table>

translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (trap) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

W tym artykule udzielamy praktycznych instrukcji, jak uzyskać dane translatomowe z różnych typów komórek korzenia Arabidopsis thaliana za pomocą metody tłumaczenia oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) i konsekwentnego optymalizowania biblioteki o niskim nakładzie pracy.
Jako materiał wyjściowy wykorzystujemy linie roślinne, które wyrażają białko rybosomalne RPL18 oznaczone GFP w sposób specyficzny dla typu komórki, stosując odpowiednie promotory. Przed immunooczyszczaniem i ekstrakcją RNA tkanka jest zamrażana błyskawicznie, co pozwala zachować integralność tkanki i jednocześnie umożliwia wykonywanie badań szeregów czasowych z wysoką rozdzielczością czasową. Warto zauważyć, że struktury ściany komórkowej pozostają nienaruszone, co jest główną wadą alternatywnych procedur, takich jak metody sortowania komórek aktywowane fluorescencją, które opierają się na protoplastowaniu tkanek w celu wyizolowania odrębnych populacji komórek. Dodatkowo nie jest konieczne utrwalanie tkanek, jak w technikach opartych na mikrodysekcji laserowej, co pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA.
Jednak pobieranie próbek z subpopulacji komórek i izolowanie tylko RNA związanego z polisomami poważnie ogranicza wydajność RNA. W związku z tym konieczne jest zastosowanie wystarczająco czułych metod przygotowania bibliotek w celu pomyślnego pozyskania danych za pomocą sekwencji RNA.
TRAP oferuje idealne narzędzie do badań nad roślinami, ponieważ wiele procesów rozwojowych obejmuje bariery komórkowe i mechaniczne szlaki sygnałowe. Zastosowanie promotorów do celowania w określone populacje komórek wypełnia lukę między poziomem narządu a pojedynczą komórką, które z kolei cierpią z powodu niskiej rozdzielczości lub bardzo wysokich kosztów. W tym przypadku stosujemy TRAP do badania komunikacji komórka-komórka w bocznym tworzeniu korzeni.

W celu oceny jakości powyższa procedura powinna zostać zweryfikowana na kilku etapach pośrednich: walidacji wzorca ekspresji in planta, kontroli jakości wyizolowanego RNA polisomalnego, a także końcowych bibliotek. Dodatkowo można przeprowadzić analizę qRT-PCR z użyciem znanych genów markerowych, aby potwierdzić odpowiedź na warunki traktowania lub doprecyzować warunki eksperymentalne.
Analiza konfokalna rozkładu sygnału...

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Dzięki TRAP możemy badać procesy rozwojowe w rozdzielczości komórkowej. Używamy promotorów specyficznych dla typu komórki do napędzania znakowanej podjednostki rybosomalnej, a stamtąd możemy wyizolować polisomowy RNA. Protokół ten daje wysokiej jakości RNA, ale w bardzo ograniczonych ilościach, dlatego potrzebne są metody wyspecjalizowane w bardzo niskich danych wejściowych, aby niezawodnie tworzyć biblioteki RNA o wysokiej jakości.TRAP jest idealnym narzędziem do badań nad roślinami, ponieważ wiele procesów rozwojowych opiera się na mechanicznych szlakach sygnałowych związanych ze ścianą komórkową. Używamy TRAP do badania komunikacji komórka-komórka w bocznym tworzeniu korzeni. Ponieważ uzyskanie dobrej jakości RNA nie okazało się tak proste, jak się spodziewaliśmy, mamy nadzieję, że ta instrukcja wideo krok po kroku zwiększy możliwości zastosowania TRAP i pomoże promować tę potężną technikę.Aby wysterylizować rozmnażane linie homozygotyczne, rozprowadź równomiernie mniej niż 300 mikrolitrów nasion na kwadratowych szalkach Petriego o wymiarach 12 na 12 centymetrów i ułóż naczynia na 60-litrowym eksykatorze. Po całonocnej sterylizacji gazem pozwól gazowi odparować przed zebraniem n

translating-ribosome-affinity-purification-trap-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę TRAP do badania rozwoju korzeni Arabidopsis thaliana na poziomie pojedynczych typów komórkowych. Technika ta umożliwia izolację wysokiej jakości RNA z polisomów przy użyciu specyficznych dla komórki promotorów.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki (Wideo) | JoVE Journal

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Przeglądaj więcej filmów