Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Dzięki TRAP możemy badać procesy rozwojowe w rozdzielczości komórkowej. Używamy promotorów specyficznych dla typu komórki do napędzania znakowanej podjednostki rybosomalnej, a stamtąd możemy wyizolować polisomowy RNA. Protokół ten daje wysokiej jakości RNA, ale w bardzo ograniczonych ilościach, dlatego potrzebne są metody wyspecjalizowane w bardzo niskich danych wejściowych, aby niezawodnie tworzyć biblioteki RNA o wysokiej jakości.

TRAP jest idealnym narzędziem do badań nad roślinami, ponieważ wiele procesów rozwojowych opiera się na mechanicznych szlakach sygnałowych związanych ze ścianą komórkową. Używamy TRAP do badania komunikacji komórka-komórka w bocznym tworzeniu korzeni. Ponieważ uzyskanie dobrej jakości RNA nie okazało się tak proste, jak się spodziewaliśmy, mamy nadzieję, że ta instrukcja wideo krok po kroku zwiększy możliwości zastosowania TRAP i pomoże promować tę potężną technikę.

Aby wysterylizować rozmnażane linie homozygotyczne, rozprowadź równomiernie mniej niż 300 mikrolitrów nasion na kwadratowych szalkach Petriego o wymiarach 12 na 12 centymetrów i ułóż naczynia na 60-litrowym eksykatorze. Po całonocnej sterylizacji gazem pozwól gazowi odparować przed zebraniem nasion do 50-mililitrowej probówki do przechowywania. Przed posiewem rozcieńczyć wysterylizowane nasiona 0,1% aganem, aby uzyskać jeden mililitr wchłoniętej mieszanki nasion na płytkę.

Aby pokryć mieszankę nasion, użyj kwadratowych pokrywek szalek Petriego, aby utworzyć laminowany uchwyt szablonu do sadzenia trzech rzędów nasion na talerzu i umieść puste płytki agarowe w uchwycie szablonu. Rozprowadź równomiernie jeden mililitr wchłoniętych nasion na trzech rzędach talerzy. I umieść przetworzone talerze w stosach w przepływie laminarnym, aż nasiona wyschną.

Gdy nasiona przykleją się do powierzchni agaru, zamknij pokrywki i uszczelnij każdą płytkę taśmą z mikroporami. Do egzogennego leczenia korzeni Arabidopsis środkiem będącym przedmiotem zainteresowania należy przygotować paski bibuły o szerokości od 1,5 do dwóch centymetrów i długości 10 centymetrów. Namocz bibułę w 10 mikromolowych NAA i za pomocą pęsety przyłóż pasek bibuły do każdego rzędu korzeni.

Następnie delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza i opróżnij nadmiar płynu z płytki, zanim oznaczysz ją czasem. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć paski bibuły z każdej płytki bez odrywania korzeni, a następnie użyj ostrza chirurgicznego, aby przeciąć raz na rząd wzdłuż połączenia pęd-korzeń, jednym określonym pociągnięciem. Użyj pęsety, aby przesunąć wzdłuż korzeni każdego rzędu, aby zebrać korzenie w trzech wiązkach.

I opróżnij korzenie do 50-mililitrowej rurki wypełnionej ciekłym azotem w celu szybkiego zamrożenia. Po zebraniu wszystkich próbek korzeni podczas jednego zabiegu, należy zdekantować nadmiar ciekłego azotu za pomocą pokrywki tuby, aby zapobiec rozlaniu się korzeni. I umieść probówkę w naczyniu do przechowywania w temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Do mielenia i homogenizacji tkanek należy nosić rękawice bawełniane pod standardowymi rękawicami laboratoryjnymi i dodać PMSF do buforu do ekstrakcji poliomów. Opróżnij próbkę tkanki do moździerza zawierającego ciekły azot i za pomocą schłodzonego tłuczka ostrożnie zmiel tkanki, aż cały materiał pojawi się jako biały proszek. Gdy cała tkanka zostanie zmielona, dodaj pięć mililitrów buforu do ekstrakcji polisomów do próbki i szybko wymieszaj zamrożone fragmenty tkanki z proszkiem, zanim bufor zamarznie.

Jak tylko mieszanina będzie mogła zostać przeniesiona, opróżnij gnojowicę do szklanego homogenizatora na lodzie i użyj dodatkowych dwóch mililitrów buforu do ekstrakcji polisomów do przepłukania moździerza i tłuczka. Ręcznie zmiel gnojowicę, aż ekstrakt będzie jednorodny. Następnie wlej surowy ekstrakt z korzenia do 50-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie i przetwórz następną próbkę, jak pokazano.

Aby uzyskać całkowite pobranie RNA, przenieś 200 mikrolitrów podwielokrotności każdej surowej próbki do osobnych czystych, wstępnie schłodzonych, oznakowanych probówek mikrowirówek. Aby usunąć ściany komórkowe, zanieczyszczenia i duże organelle, należy odwirować próbki i zdekantować supernatant do świeżych, wstępnie schłodzonych stożkowych probówek w celu ponownego odwirowania. Podczas wirowania probówek podlej 60 mikrolitrów magnetycznych kulek GFP na próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

I umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby ułatwić usuwanie supernatantu. Następnie umyj kulki dwa razy w jednym mililitrze buforu do mycia na zimno na pranie i ponownie zawieś kulki w 60 mikrolitrach buforu do płukania na próbkę. Natychmiast po odwirowaniu zdekantować oczyszczony supernatant do oznakowanych 15-mililitrowych probówek i dodać 60 mikrolitrów przemytych kulek do każdej próbki.

Następnie umieść wszystkie próbki poziomo w wiadrze z lodem na dwugodzinną inkubację z kołysaniem. Pod koniec inkubacji zebrać kulki na magnetycznym stojaku na lodzie i dodać PMSF do pozostałego buforu do ekstrakcji poliomów. Po odrzuceniu supernatantów dodać do próbek około pięciu mililitrów buforu do ekstrakcji polisomów i ponownie zawiesić kulki w próbkach, delikatnie przechylając.

Wstrząsnąć próbkami przez 15 minut na wytrząsarce na lodzie, a następnie dwukrotnie przepłukać świeżym buforem płuczącym na magnesie, jak pokazano. Po ostatnim płukaniu przenieść próbki w jednym mililitrze buforu do płukania do probówki o pojemności 1,5 mililitra. I zbierz koraliki jeszcze raz na stojaku magnetycznym, aby usunąć cały supernatant.

Następnie umieść probówki na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone. W celu regeneracji materiałów laboratoryjnych należy najpierw wypłukać cały sprzęt do odpadów chemicznych. Umyj ręcznie moździerze, tłuczki i homogenizatory mydłem, a następnie dokładnie spłucz każde narzędzie.

Następnie umieść sprzęt w pojemniku żaroodpornym i piecz materiały przez noc w temperaturze wyższej niż 220 stopni Celsjusza. Wyszczotkuj wszystkie probówki wirówkowe detergentem przed umieszczeniem probówek na tacce do sterylizacji w autoklawie z rantem i wyciągiem. Wlej jeden mililitr płynnego pirowęglanu dietylu i jeden litr dejonizowanego roztworu wody na probówki przez trzy do 18 godzin.

Następnie zbierz roztwór przed sterylizacją tacki z probówkami w autoklawie. Tutaj pokazane są reprezentatywne rośliny z sygnałami GFP. Barwienie przeciwstawne jodkiem propidyny zaznacza kontury ściany komórkowej.

Linie odpowiadają wzorcowi lokalizacji endodermy i perycyklu ksylemowo-biegunowego. W tych reprezentatywnych pomiarach uzyskanych z polisomowego RNA większość próbek wykazała bardzo małą degradację, z liczbą integralności RNA w zakresie od 9 do 10. Na tych wykresach można zaobserwować ślady udanych bibliotek, co podkreśla solidność procedury, pomimo zmniejszonej objętości reakcji.

Przed utworzeniem zestawu danych obejmującego cały genom, RNA TRAP z eksperymentu pilotażowego można zbadać za pomocą ilościowego RTPCR w celu walidacji skuteczności leczenia i/lub warunków eksperymentalnych, a także swoistości tkankowej. W tej analizie badanie trzech genów reagujących na auksynę potwierdziło udaną indukcję hormonów po dwóch godzinach leczenia. Specyficzne tkankowo profile genów markerowych pobrane z danych sekwencjonowania potwierdziły specyficzność typu komórki.

Postępuj zgodnie z dobrymi praktykami podczas pracy z RNA. Pracuj przy sterylnym stole, czyść sprzęt roztworem usuwającym RNA, zakładaj rękawice i natychmiast je zmieniaj, gdy zostaną zanieczyszczone. Należy pamiętać o odpowiednim obchodzeniu się i wyrzucaniu wszystkich toksycznych chemikaliów i gazów, które zostały użyte podczas zabiegu, zwłaszcza chloru gazowego fenolu-DEPC i ciekłego azotu.

W portfolio badań omicznych TRAP zajmuje ważną niszę i został już wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na wiele pytań biologicznych, zwłaszcza w biologii rozwoju, TRAP ma ogromny potencjał.