Name: Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj generację spersonalizowanego chipu bariery krew-mózg z wykorzystaniem komórek iPSC na platformie organ-on-chip. Ta metoda umożliwia przewidywanie przepuszczalności leków CNS i badanie zaburzeń neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Soshanie Svendsen za krytyczną edycję. Praca ta była wspierana przez grant Izraelskiej Fundacji Naukowej 1621/18, Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST), Izrael 3-15647, grant Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej ID DISC1-08800, Sherman Family Foundation, grant NIH-NINDS 1UG3NS105703 oraz grant The ALS Association 18-SI-389. AH został sfinansowany przez Fundację Wallenberga (numer grantu 2015.0178).

<ol><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets%3A+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+blood-brain+barrier%3A+beyond+the+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li>
<li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15(2019).</li>
<li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Patent+Analyst%22%5BJournal%5D)">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li>
<li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li>
<li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+%28mct%29+8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li>
<li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis%3A+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology+and+Neurosurgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li>
<li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965(2017).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507(2014).</li>
<li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256(2016).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release%22%5BJournal%5D)">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li>
<li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li>
<li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+of+human+epithelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell%E2%80%93derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZ+spheres%3A+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li>
<li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219(2014).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li>
<li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li>
<li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li>
<li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783(2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679(2017).</li>
<li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23(2018).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135(2013).</li>
<li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
</ol>

Cedars-Sinai posiada mniejszościowy pakiet udziałów w Emulate, firmie produkującej mikroprzepływowe chipy narządowe do badania. Członek zarządu Cedars-Sinai zasiada również w zarządzie Emulate. Firma Emulate nie udzieliła żadnego wsparcia finansowego na te badania. Cedars-Sinai i Emulate mają złożone patenty związane z tą pracą.

Połączenie technologii organ-on-chip i komórek pochodzących z iPSC w NVU daje nadzieję na dokładne modelowanie ludzkiego BBB. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół prostego i niezawodnego zastosowania niedawno opublikowanego chipa BBB16 opartego na iPSC. Przegląd i czas paradygmatu wysiewu przedstawiono na rysunku 3. Aby uzyskać i utrzymać funkcje barierowe, które są odpowiednie do modelowania BBB, kluczowe znaczenie ma wygenerowanie jednorodnej monowarstwy...

BBB to wysoce selektywna bariera, która oddziela OUN od krążącej krwi. Chroni krytyczne funkcje mózgu przed potencjalnie destrukcyjnymi substancjami, czynnikami i ksenobiotykami, jednocześnie umożliwiając napływ składników odżywczych i innych metabolitów niezbędnych do utrzymania homeostazy mózgu1. BBB to wielokomórkowy NVU, w którym perycyty, końcówki astrocytów i procesy neuronalne bezpośrednio stykają się z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC). Te interakcje pozwalają BMEC tworzyć wyspecjalizowane właściwości barierowe, które są wspierane przez ścisłe i przylegające połączenia2,3. Tworzenie tej bariery ogranicza parakomórkowe przechodzenie cząsteczek, ale zawiera ona spolaryzowane transportery do aktywnego transportu cząsteczek do OUN lub z powrotem do krwi1. Ze względu na te unikalne właściwości barierowe, bariera krew-mózg stanowi główną przeszkodę w dostarczaniu biofarmaceutyków do mózgu i szacuje się, że mniej niż 5% małych cząsteczek zatwierdzonych przez FDA może dotrzeć do klasy CNS<sup="xref">4.
Modele zwierzęce są powszechnie używane do badania penetracji BBB i mechanizmów molekularnych związanych z rozwojem BBB5. Podczas gdy modele zwierzęce wiernie odwzorowują złożone wielokomórkowe środowisko in vivo, różnice w ekspresji i aktywności transporterów BBB, a także specyficzność substratów między gatunkami często uniemożliwiają dokładną ekstrapolację danych zwierzęcych na ludzi6. W związku z tym modele oparte na ludziach mają kluczowe znaczenie dla badania ludzkiej bariery krew-mózg i do wykorzystania w opracowywaniu leków przeznaczonych do celowania w OUN. Potrzeba ta staje się jeszcze bardziej widoczna wraz z rosnącą dominacją leków biologicznych, specyficznych dla człowieka w dziedzinie rozwoju farmaceutycznego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że upośledzona bariera krew-mózg jest związana z wieloma poważnymi zaburzeniami OUN, w tym guzami mózgu i chorobami neurologicznymi7,8,9. Modele ludzkie wiernie odzwierciedlające te choroby mają potencjał, aby zarówno 1) zidentyfikować nowe szlaki, które mogą być celem rozwoju leków, jak i 2) przewidzieć penetrację OUN, skracając w ten sposób czas i zasoby w badaniach przedklinicznych i prawdopodobnie zmniejszając odsetek niepowodzeń w badaniach klinicznych.
Modele in vitro zostały szeroko wdrożone do badania interakcji między BMEC a innymi komórkami NVU i przeprowadzania badań przesiewowych pod kątem potencjalnych leków przepuszczalnych dla BBB10. Aby odtworzyć kluczowe aspekty ludzkiej bariery krew-mózg, modele in vitro muszą wykazywać fizjologicznie istotne właściwości (tj. niską przepuszczalność parakomórkową i fizjologicznie istotny transśródbłonkowy opór elektryczny [TEER] w poprzek monowarstwy śródbłonka). Ponadto profil molekularny systemu in vitro musi obejmować ekspresję reprezentatywnych funkcjonalnych systemów transportowych. Zazwyczaj modele in vitro składają się z komórek śródbłonka, które są hodowane na półprzepuszczalnej błonie z kombinacjami innych komórek NVU w celu poprawy właściwości BBB11. Takie podejście pozwala na prostą i stosunkowo szybką ocenę funkcjonalności bariery i przepuszczalności cząsteczek. Takie oparte na komórkach modele BBB można ustalić ze źródłami komórek zwierzęcych lub ludzkich, w tym komórek wyizolowanych z wycięć chirurgicznych lub unieśmiertelnionych linii BMEC.
Niedawno, protokoły różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w BMEC zostały wprowadzone jako atrakcyjne źródło dla ludzkich modeli BBB in vitro12,13. BMEC pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są wysoce skalowalne, wykazują kluczowe cechy morfologiczne i funkcjonalne ludzkiego krew-mózg oraz przenoszą genetykę pacjenta. W hodowli iBMEC tworzą monowarstwę, która wyraża markery połączeń ścisłych i wyświetla in vivo podobne do kompleksów połączeń ścisłych. Komórki te wyrażają również markery BBB, w tym transporter glukozy BBB, transporter glukozy 1 (GLUT1). Co ważne, w przeciwieństwie do innych alternatywnych źródeł komórkowych dla ludzkich BMEC, iBMEC uzyskują właściwości barierowe o wartościach tak wysokich, jak te zmierzone in vivo14, polaryzują wzdłuż osi podstawno-bocznej i wyrażają funkcjonalne pompy wypływu. Co więcej, wykorzystanie iPSC z różnych podmiotów zarówno 1) z zadowoleniem przyjmuje możliwość przetestowania aspektów bariery krew-mózg w sposób medycyny spersonalizowanej, jak i 2) zapewnia elastyczne źródło generowania dodatkowych typów komórek NVU. Generowanie tych komórek z izogenicznego źródła komórkowego w celu stworzenia spersonalizowanych chipów BBB pomogłoby również w zrozumieniu różnic międzyosobniczych w odpowiedziach na leki, co jest główną przyczyną oporności lub upośledzonej odpowiedzi na leczenie obserwowanej w badaniach klinicznych.
Użycie iBMEC jako monowarstw w naczyniu lub na półprzepuszczalnej wkładzie transwell stanowi potężne podejście do modelowania BBB. Systemy te są zwykle solidne, powtarzalne i opłacalne. Ponadto analizy funkcjonalne, takie jak TEER i przepuszczalność, są stosunkowo proste do przeprowadzenia. Jednak systemy dwuwymiarowe (2D) nie są w stanie oddać trójwymiarowej natury tkanek in vivo i brakuje im fizjologicznych sił naprężeń ścinających dostarczanych przez krążącą krew i komórki krwi. Ogranicza to zdolność śródbłonka naczyniowego w tych modelach do rozwijania i utrzymywania wewnętrznych właściwości i funkcji BBB.
Mikroinżynieryjne systemy zbudowane z żywych komórek zostały zaimplementowane do modelowania różnych funkcji narządów w koncepcji zwanej organ-on-chips. Odtwarzając podobną do vivo architekturę wielokomórkową, interfejsy tkanka-tkanka, mikrośrodowiska fizykochemiczne i perfuzję naczyniową, te mikroinżynieryjne platformy generują poziomy funkcjonalności tkanek i narządów, które nie są możliwe w konwencjonalnych systemach hodowli 2D. Umożliwiają również obrazowanie w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości i analizę profili biochemicznych, genetycznych i metabolicznych podobnych do żywych komórek w kontekście tkanek i narządów in vivo. Jednak szczególnym wyzwaniem związanym z układem typu organ-on-chip jest to, że projektowanie, wytwarzanie i stosowanie tych mikroinżynieryjnych chipów wymaga specjalistycznej wiedzy inżynierskiej, której zwykle brakuje w biologicznie zorientowanych laboratoriach akademickich.
Niedawno połączyliśmy technologie iPSC i organ-on-chip, aby wygenerować spersonalizowany model chipa BBB15,16. W celu sprostania opisanym wyzwaniom technologicznym zastosowano dostępny na rynku Chip-S1 wraz z modułem hodowli, instrumentem zaprojektowanym do automatyzacji konserwacji chipów w prosty i solidny sposób (Emulate Inc.). Chip BBB odtwarza interakcje między komórkami nerwowymi i śródbłonkowymi i osiąga fizjologicznie istotne wartości TEER, które są mierzone za pomocą specjalnie wykonanych chipów narządowych ze zintegrowanymi złotymi elektrodami17. Ponadto chip BBB wykazuje niską przepuszczalność parakomórkową, reaguje na sygnały zapalne na poziomie narządu, wyraża aktywne pompy wypływowe i wykazuje predykcyjny transport rozpuszczalnych biomarkerów i biofarmaceutyków. Warto zauważyć, że chipy BBB wygenerowane od kilku osób oddają oczekiwane różnice funkcjonalne między zdrowymi osobami a pacjentami z chorobami neurologicznymi15.
Protokół opisany poniżej opisuje niezawodną, wydajną i powtarzalną metodę generowania ludzkich chipów BBB opartych na iPSC w warunkach dynamicznego przepływu. Podano wytyczne dotyczące rodzaju testów i analiz punktów końcowych, które można przeprowadzić bezpośrednio w chipie BBB lub z próbek ścieków. W ten sposób protokół demonstruje spektrum technik, które można zastosować do oceny właściwości biologicznych i funkcjonalnych oraz odpowiedzi w modelu istotnym dla człowieka.
Krótki opis chipa BBB opartego na iPSC znajduje się tutaj. Ludzkie iPSC są początkowo różnicowane i rozmnażane w kolbach do hodowli tkankowych jako swobodnie unoszące się agregaty neuronalnych komórek progenitorowych, zwane sferami EZ. Górny kanał klasy Chip-S1<sup="xref">16,18,19 jest wypełniony zdysocjowanymi sferami EZ, które tworzą "stronę mózgu" chipa, gdy komórki różnicują się w ciągu 7 dni w mieszaną kulturę neuronalnych komórek progenitorowych (iNPC), iAstrocytów i iNeuronów. Ludzkie iPSC są również zróżnicowane na płytkach do hodowli tkankowych w iBMEC. Dolny kanał chipa jest wysiedlany iBMEC, aby utworzyć "stronę krwi", gdy rozwijają się, tworząc rurkę śródbłonka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Porowata membrana pokryta macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), która oddziela górny i dolny kanał: 1) umożliwia tworzenie interakcji międzykomórkowych między kanałami oraz 2) umożliwia użytkownikowi przeprowadzanie testów przepuszczalności i obrazowanie komórek w dowolnym kanale za pomocą konwencjonalnego mikroskopu świetlnego.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td>Roztwór dysocjacyjny</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Bfgf</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Chip-S1</td><td>Emulate Inc</td><td>Chip-S1</td><td>Organ-Chip</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-FITC</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Emuluj odczynnik 1 (ER-1)</td><td>Emuluj Inc</td><td>ER-1</td><td></td></tr><tr><td>Emuluj odczynnik 2 (ER-2)</td><td>Emuluj Inc</td><td>ER-2</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Glej Fibrylarne Białko Kwasowe (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GLUT-1</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-11315</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Suplement glutaminy</td></tr><tr><td>hBDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Macierz błony podstawnej</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies, Inc.</td><td>85851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-340-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>05-100-1A</td><td>Alternatywne podłoża</td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10333</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca uboga w płytki krwi (PPP)</td><td>Technologie biomedyczne</td><td>J64483AB</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>ab6602</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Sterylna probówka wirówkowa Górny filtr</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>&beta; III-tubulina (Tuj1&alpha;)</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na ipsc

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

Bariera krew-mózg (BBB) jest tworzona przez jednostki nerwowo-naczyniowe (NVU), które chronią ośrodkowy układ nerwowy (OUN) przed szeregiem czynników znajdujących się we krwi, które mogą zakłócać delikatne funkcjonowanie mózgu. W związku z tym bariera krew-mózg jest główną przeszkodą w dostarczaniu leków do OUN. Coraz więcej dowodów sugeruje, że bariera krew-mózg odgrywa kluczową rolę w powstawaniu i postępie chorób neurologicznych. W związku z tym istnieje ogromne zapotrzebowanie na model bariery krew-mózg, który może przewidzieć przenikanie leków ukierunkowanych na OUN, a także wyjaśnić rolę bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie.
Niedawno połączyliśmy technologie organ-on-chip i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), aby wygenerować chip BBB w pełni spersonalizowany dla ludzi. Ta nowatorska platforma wyświetla właściwości komórkowe, molekularne i fizjologiczne, które są odpowiednie do przewidywania transportu leków i cząsteczek przez ludzką barierę krew-mózg. Ponadto, korzystając z dostosowanych do potrzeb pacjenta chipów BBB, stworzyliśmy modele chorób neurologicznych i wykazaliśmy potencjał spersonalizowanych zastosowań medycyny predykcyjnej. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół pokazujący, jak generować chipy BBB pochodzące z iPSC, zaczynając od różnicowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzących z iPSC (iBMEC), a kończąc na mieszanych kulturach nerwowych zawierających progenitory nerwowe, zróżnicowane neurony i astrocyty. Opisano również procedurę wysiewu komórek do chipa narządu i hodowli chipów BBB pod kontrolowanym przepływem laminarnym. Na koniec przedstawiono szczegółowe opisy analiz chipów BBB, w tym testy przepuszczalności parakomórkowej do oceny przepuszczalności leków i cząsteczek, a także metody immunocytochemiczne do określania składu typów komórek w chipie.

Rysunek 6A,B,C przedstawia chip BBB z wysianymi sferami EZ w górnym kanale po „stronie mózgu” oraz iBMECs w dolnym kanale po „stronie krwi”. Najpierw wysiano iBMECs i pozostawiono je do przyczepienia na noc, po czym wysiano sfery EZ. Następnie chipy hodowano w warunkach statycznych z codzienną wymianą pożywki przez siedem dni. Chip BBB utrwalono za pomocą 4% PFA w RT przez 10 min i przemyto 3x DPBS. Immunocytochemię na chipie BBB przeprowadzono z użyciem: 1) nestyny jako mar...

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Protokół ten pokaże, w jaki sposób zróżnicowane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być umieszczane w narządzie na chipie w celu wytworzenia w pełni ludzkiej, spersonalizowanej, mikroprzepływowej bariery krew-mózg, która może być wykorzystana do przewidywania przepuszczalności leków w ośrodkowym układzie nerwowym i do badania zaburzeń neurologicznych. Korzystając z dostępnego na rynku narządu na chipie, pokażemy, w jaki sposób każde laboratorium zorientowane biologicznie może wykorzystać tę technologię do wygenerowania spersonalizowanej, mikroprzepływowej bariery krew-mózg na chipie. Coraz więcej dowodów sugeruje, że bariera krew-mózg odgrywa rolę w chorobach neurologicznych poprzez generowanie spersonalizowanych chipów BBB pochodzących z iPSC osób z genetyczną chorobą neurologiczną.Możliwe będzie zbadanie roli bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie. Metoda ta może być również przydatna dla firm farmaceutycznych, które mogą wykorzystać tę ludzką platformę BBB do badań przesiewowych pod kątem przenikalności potencjalnych leków neurologicznych do ludzkiego mózgu. Zastosowanie technologii organ-on-chip zwykle wymaga specjalistycznych umiejętności inżynierskich.Wykorzystanie dostępnych na rynku platform umożliwia zastosowanie tej technologii w każdym laboratorium zorientowanym biologicznie. Na początek przynieś naczynie zawierające przygotowane frytki do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety P200 delikatnie umyj oba kanały, dodając 200 mikrolitrów pożywki różnicującej neurony do wlotu i wyciągając płyn z wylotu.Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odessuj nadmiar kropelek nośnika z powierzchni chipa. Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Aby zasiać neuronalne komórki progenitorowe pochodzące z iPSC w górnym kanale w celu wygenerowania strony mózgu, dodaj końcówkę P200 zawierającą od 30 do 100 mikrolitrów zawiesiny komórek o stężeniu jeden razy 10 do sześciu komórek na mililitr do wlotu górnego kanału i delikatnie zwolnij końcówkę z pipety.Weź pustą pipetę P200, naciśnij tłok, włóż do wylotu górnego kanału i ostrożnie przeciągnij zawiesinę jednokomórkową przez końcówkę. Przenieś chip do mikroskopu, aby sprawdzić gęstość wysiewu i jednorodny rozkład komórek w górnym kanale. Po potwierdzeniu gęstości komórek przy 20% pokryciu, natychmiast umieść chipy w inkubatorze na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie zmyj komórki, które się nie przyczepiają, dodając świeżą pożywkę do różnicowania neuronów do wlotu i wyciągając płyn za pomocą pipety z wylotu. Utrzymuj komórki w warunkach statycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z codzienną wymianą pożywki różnicującej neurony. Po dołączeniu iNPC lub w następnym dniu po wysiewie, przynieś naczynie zawierające przygotowane chipsy do szafki bezpieczeństwa biologicznego.Delikatnie umyj dolny kanał 200 mikrolitrami pożywki z komórek śródbłonka. Unikając kontaktu z portami, ostrożnie odsysaj kropelki nadmiaru pożywki z komórek śródbłonka z powierzchni chipa, upewniając się, że pozostawiłeś pożywkę w obu kanałach. Delikatnie wstrząsnąć zawiesiną komórkową, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek.Za pomocą pipety P200 pobrać od 30 do 100 mikrolitrów pochodzącej z iPSC zawiesiny komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu o stężeniu od 14 do 20 razy 10 do sześciu komórek na mililitr i umieścić końcówkę we wlocie dolnego kanału. Najważniejszym krokiem do osiągnięcia funkcjonalnych właściwości barierowych jest wysiew komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Bardzo ważne jest, aby wysiać komórki o odpowiedniej gęstości, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, aby zweryfikować jednorodną dystrybucję w chipie narządu.Wciśnij tłok pipety P200 z pustą końcówką, włóż do wylotu dolnego kanału i powoli zwolnij tłok pipety, aby ostrożnie przeciągnąć zawiesinę jednokomórkową przez dolny kanał. Odessać nadmiar zawiesiny komórek z powierzchni chipa. Unikaj bezpośredniego kontaktu z portami wlotowymi i wylotowymi, aby upewnić się, że żadna zawiesina komórek nie jest zasysana z kanałów.Przenieś wiór do mikroskopu, aby sprawdzić gęstość wysiewu. Dolny kanał jest wypełniony komórkami bez widocznych przerw między nimi. Po potwierdzeniu prawidłowej gęstości komórek zasiej komórki w pozostałych wiórach.Aby przymocować komórki do porowatej membrany, która znajduje się na górze dolnego kanału, odwróć każdy chip i pozwól im spocząć w kołysce na wióry. Umieść mały zbiornik zawierający sterylny DPBS wewnątrz 150-milimetrowej naczynia, aby zapewnić wilgotność komórkom. Inkubuj wióry w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około trzy godziny lub do momentu, gdy komórki w dolnym kanale się przyczepią.Po przyczepieniu się komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzących z iPSC, odwróć chipy z powrotem do pozycji pionowej, aby umożliwić przyczepienie się komórek do dolnej części dolnego kanału. 48 godzin po wysiewie komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzących z iPSC, zrównoważ temperaturę pożywki komórkowej śródbłonka, ogrzewając się w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odgazować pożywkę przez inkubację w systemie filtracji napędzanym próżnią przez 15 minut.Następnie zdezynfekuj zewnętrzną część opakowania i tacek modułu przenośnego 70% etanolem, wytrzyj i przenieś je do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz opakowanie i umieść moduły w tacy, Ustaw je tak, aby zbiorniki były skierowane w stronę tylnej części tacy. Odpipetować trzy mililitry wstępnie zrównoważonej, ciepłej pożywki do każdego zbiornika wlotowego.Dodaj pożywkę do hodowli komórek śródbłonka do zbiornika wlotowego dolnego kanału i pożywkę różnicującą neurony do zbiornika wlotowego górnego kanału. Następnie odpipetować 300 mikrolitrów wstępnie zrównoważonego, ciepłego medium do każdego zbiornika wylotowego, bezpośrednio nad każdym portem wylotowym. Na każdej tacy można umieścić do sześciu modułów przenośnych.Przynieś tace do inkubatora i wsuń całkowicie do modułu hodowlanego z uchwytem tacki skierowanym na zewnątrz. Wybierz i uruchom cykl główny w module hodowli. Zamknij drzwiczki inkubatora i pozwól modułowi hodowlanemu zalać moduły przenośne przez około jedną minutę.Cykl zalewania jest zakończony, gdy na pasku stanu pojawi się komunikat gotowy. Wyjmij tackę z modułu hodowli i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego. Sprawdź spód każdego przenośnego modułu w szafie bezpieczeństwa biologicznego, aby upewnić się, że moduły przenośne zostały pomyślnie zalane.Poszukaj obecności małych kropelek we wszystkich czterech portach. Jeśli którykolwiek z modułów przenośnych nie pokazuje kropel, uruchom ponownie cykl główny na tych modułach. Jeśli jakikolwiek nośnik kapie na tacę, co zdarza się częściej przez porty wylotowe, wyczyść tacę 70% etanolem.Następnie delikatnie umyj oba kanały każdego chipa ciepłym, zrównoważonym podłożem hodowlanym specyficznym dla komórek, aby usunąć wszelkie możliwe pęcherzyki w kanale, i umieść małe kropelki pożywki na górze każdego portu wlotowego i wylotowego. Włóż chipy z nośnikami do modułów przenośnych i umieść do sześciu na każdej tacy. Włóż tace do modułu hodowlanego.Zaprogramuj odpowiednie warunki hodowli chipów narządowych, takie jak natężenie przepływu i rozciąganie, w module hodowli. Po zakończeniu cyklu regulacji, który trwa około dwóch godzin, rozpoczynają się zaprogramowane warunki. Następnie moduł hodowli zaczyna płynąć w zadanych warunkach hodowli chipów narządowych.Immunocytochemia na chipie bariery krew-mózg opartym na iPSC siedem dni po wysiewie pokazuje, że sfery EZ zróżnicowały się w mieszaną populację komórek nerwowych w górnym kanale bocznym mózgu, w tym astrocyty beta-dodatnie S100, neuronalne komórki progenitorowe Nestin-dodatnie, a także astrocyty GFAP-dodatnie i neurony tubulinowo-dodatnie beta III. Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzące z IPSC wysiane w dolnym kanale bocznym krwi wyrażają GLUT-1 i PECAM-1. Ocena przepuszczalności chipa bariery krew-mózg pokazuje, że chip narządu obsiany komórkami śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzącymi z iPSC i sferami EZ miał ścisłą barierę w porównaniu z chipami narządów wysiewanymi samymi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego mózgu pochodzącymi z iPSC.Chipy narządowe wysiane samymi kulkami EZ nie wykazywały żadnych właściwości barierowych. Od wstępnej obróbki powierzchni kanału do codziennej zmiany medium, unikaj tworzenia się pęcherzyków w kanale. Na każdym etapie protokołu, w którym odczynnik aktywacji powierzchniowej, macierz zewnątrzkomórkowa lub pożywka zawierająca komórkę musi zostać wprowadzony przez kanały, niezwykle ważne jest dokładne sprawdzenie, czy nie znaleziono pęcherzyków.Test przepuszczalności można przeprowadzić w celu oceny przenikalności potencjalnych leków do ludzkiego mózgu. Takie podejście może służyć do testowania potencjalnych środków terapeutycznych. Zastosowanie chipa BBB opartego na iPSC pozwala na badanie roli BBB w różnych chorobach neurologicznych.W przyszłości taka platforma może być przydatna w predykcyjnych, spersonalizowanych zastosowaniach medycznych.

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film pokazuje tworzenie chipa bariery krew-mózg przy użyciu komórek prekursorowych pochodzących z iPSC. Polega na wysiewaniu nerwowych komórek progenitorowych i komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu w oddzielnych kanałach z porowatą błoną. Poprzez przepływ pożywki różnicującej komórki śródbłonka tworzą ścisłe połączenia przypominające naczynia krwionośne, a komórki nerwowe dojrzewają do różnych typów komórek mózgowych, tworząc funkcjonalną barierę krew-mózg na chipie.

Generowanie chipa bariery krew-mózg przy użyciu komórek prekursorowych pochodzących z iPSC

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Poznaj generację spersonalizowanego chipu bariery krew-mózg z wykorzystaniem komórek iPSC na platformie organ-on-chip. Ta metoda umożliwia przewidywanie przepuszczalności leków CNS i badanie zaburzeń neurologicznych.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Przeglądaj więcej filmów