Model wstawiania żył królika naśladujący operację rewaskularyzacji przy użyciu przeszczepów żył do oceny przerostu błony wewnętrznej pod ciśnieniem tętniczym krwi
15 maja 2020
Obecny protokół ma na celu eksperymentalne stworzenie przerostu żył wewnętrznych poprzez poddanie żył działaniu ciśnienia krwi tętniczej w celu opracowania strategii osłabienia przerostu żył wewnętrznych po operacji rewaskularyzacji za pomocą przeszczepów żyłowych.
Nasz protokół zapewnia łatwy, opłacalny, powtarzalny i klinicznie istotny model dla badaczy zajmujących się przerostem żylnym błony wewnętrznej. Nasz protokół jest zrównoważony ekonomicznie, klinicznie i technicznie. Dlatego jest to wysoce zalecane dla badaczy, którzy chcą zastosować swoje wyniki in vitro w warunkach in vivo.
Wierzymy, że nasz protokół może być zastosowany do większego modelu zwierzęcego w celu opracowania nowych strategii leczenia chorób niedokrwiennych serca i kończyn dolnych. Nasz protokół dotyczy głównie dziedziny chirurgii sercowo-naczyniowej. Jednak może być również stosowany w leczeniu zmian zwyrodnieniowych w przetokach tętniczo-żylnych u pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek.
Po znieczuleniu miejscowym i profilaktycznym podaniu antybiotyku przeciwbólowego należy zdezynfekować miejsce operowane 10% jodowidonem. I wykonaj nacięcie o grubości od 50 do 60 milimetrów za pomocą skalpela chirurgicznego w okolicy szyjki macicy znieczulonego samca japońskiego białego królika. Tępo wypreparuj tkanki podskórne i powięź, aby odsłonić 20 do 30 milimetrowy odcinek żyły szyjnej.
I użyj jedwabnych szwów 4-0, aby podwiązać wszystkie gałęzie odsłoniętej żyły. Umieść jedwabny szew 2-0 wokół wewnętrznych i zewnętrznych żył szyjnych i wykonaj jednomilimetrowe nacięcie w ścianie żylnej dystalnej strony żyły. Wprowadzić 2-francuski cewnik balonowy od nacięcia w kierunku bliższej strony żyły.
I podwiązaj jedwabny szew 2-0 w dystalnych miejscach żył szyjnych. Napompuj balon 200 mikrolitrami powietrza. I użyj balonu, aby trzykrotnie usunąć błonę wewnętrzną żyły w celu złuszczenia śródbłonka.
Po trzecim pasażu podwiązaj bliższy koniec żyły i przetnij żyłę w miejscu dystalnym. Następnie wprowadzić cewnik dożylny o rozmiarze 20 do pobranej żyły od kierunku dystalnego do bliższego i przeciąć żyłę w miejscu bliższym. Aby połączyć tętnicę szyjną z żyłą szyjną żniwną, odsłoń 20 do 30 milimetrowy odcinek ipsilateralnej tętnicy szyjnej.
I ostrożnie oddziel tętnicę od pobliskiej żyły i nerwu. Podwiązać wszystkie gałęzie odsłoniętej żyły za pomocą jedwabnego szwu 4-0. I podać dożylnie 200 jednostek międzynarodowych na kilogram heparyny sodu.
Zacisnąć proksymalny i dystalny koniec tętnicy za pomocą gumowych klamer chirurgicznych. I przetnij tętnicę między zaciskami. Wstrzyknąć normalną sól fizjologiczną do naciętej tętnicy szyjnej proksymalnie i dystalnie, aby rozciągnąć tętnicę.
I umieść żyłę żniwną w pobliżu tętnicy, aby zespolić naczynie w odwrócony sposób od końca do końca. Aby zespoleć bliższy koniec żyły z dystalnym końcem tętnicy, umieść dwa szwy kotwiczne 8-0 polipropylen w miejscu i po przeciwnej stronie. Dodaj szwy po górnej stronie linii zespolenia między szwami kotwiczącymi.
Odwróć tętnicę i przeszczep żyły do góry nogami. I dodaj szwy na pozostałej części linii zespolenia. Następnie wyjmij cewnik dożylny z żyły i zaciśnij przeszczep żyły proksymalnie.
Odciąć dystalnie tętnicę szyjną. I obserwuj, czy przeszczep żyły rozszerza się stopniowo. Korzystanie z 8-0 Szwy przerywane polipropylenowe, zespolenie dystalnego końca żyły z bliższym końcem tętnicy.
I odkleić tętnicę, aby sprawdzić, czy nie ma krwawienia z miejsc zespolenia. Na koniec podwiązaj tętnicę szyjną wewnętrzną za pomocą jedwabnego szwu 4-0, aby zasymulować zły stan spływu i ułatwić przerost błony wewnętrznej. Następnie oczyść ranę solą fizjologiczną.
Zamknij nacięcie warstwami poliglaktyną 910 3-0. I pozwól królikowi w pełni wyzdrowieć dzięki monitorowaniu przed powrotem zwierzęcia do jego domowej klatki. Na tym reprezentatywnym obrazie można zaobserwować udany przerost błony wewnętrznej po 2 tygodniach od operacji wstawiania żył.
Tutaj można zaobserwować terapeutyczne działanie nanocząstek poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) naładowanych mikroRNA-145 na morfologię przerostu błony wewnętrznej. Rzeczywiście, leczenie mikroRNA załadowanymi nanocząstkami poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) powoduje znaczne osłabienie przerostu błony wewnętrznej. Ponadto barwienie immunologiczne Ki-67, markera proliferacji komórek, ujawnia mniej komórek Ki-67-dodatnich w grupie leczonej mikroRNA-145, co wskazuje na zmianę fenotypu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych z niedojrzałego stanu proliferacyjnego do dojrzałego stanu skurczowego.
Głównym celem naszego protokołu jest osiągnięcie drożności wszczepionego przeszczepu. Ważne jest również, aby potwierdzić, że przeszczep rozszerza się po odciśnięciu tętnicy szyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia kosztowo efektywny i powtarzalny model badania hiperplazji błony wewnętrznej żył poprzez poddanie ich ciśnieniu krwi tętniczej. Jest on przydatny dla badaczy dążących do opracowania strategii leczenia schorzeń związanych z niedokrwieniem serca oraz chorobami kończyn dolnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chirurgia naczyniowo-sercowa
- Nadczynność intimy żył
- Chirurgia rewaskularyzacyjna
Wstęp
- Nadmierny rozrost błony wewnętrznej żyły jest częstym powikłaniem po zabiegach pomostowania żyłowego.
- Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tego stanu jest kluczowe dla poprawy wyników chirurgicznych.
- Obecne modele mogą nie odwzorowywać w sposób wystarczający scenariusza klinicznego.
- Niniejszy protokół ma na celu wypełnienie tej luki poprzez dostarczenie odpowiedniego modelu eksperymentalnego.
Cel badania
- Stworzenie modelu hiperplazji błony wewnętrznej żyły.
- Opracowanie strategii łagodzenia tego stanu po zabiegu chirurgicznym.
- Ułatwienie przeniesienia wyników badań in vitro do zastosowań in vivo.
Zastosowane metody
- Zastosowanie ciśnienia tętniczego w żyłach.
- Ocena rozwoju hiperplazji intimy.
- Ocena potencjalnych strategii terapeutycznych.
- Wykorzystanie modelu większego zwierzęcia w dalszych badaniach.
Główne wyniki
- Protokół jest zrównoważony pod względem ekonomicznym i klinicznym.
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników istotnych dla stanów chorobowych u ludzi.
- Potencjalne zastosowania w leczeniu zmian degeneracyjnych w przetokach tętniczo-żylnych.
- Sprzyja dalszym badaniom nad chorobami niedokrwiennymi.
Wnioski
- Model ten może w znacznym stopniu pomóc w zrozumieniu hiperplazji błony wewnętrznej żył.
- Jest on cennym narzędziem dla badaczy w dziedzinie chirurgii naczyniowej.
- Przyszłe badania mogą doprowadzić do opracowania lepszych strategii leczenia pacjentów z tym schorzeniem.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie przemysłowe
Model ten umożliwia przedkliniczną ocenę strategii terapeutycznych ukierunkowanych na przerost błony wewnętrznej żyły, który jest kluczowym mechanizmem niepowodzenia w rewaskularyzacji za pomocą graftów naczyniowych. Poprzez odtworzenie ekspozycji na ciśnienie tętnicze w chirurgicznie dostępnym systemie interpozycji żylnej, wspiera on mechanisticzne ograniczanie ryzyka w przypadku interwencji antyproliferacyjnych przed kosztownymi badaniami na dużych zwierzętach lub testami klinicznymi. Platforma ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dotyczących modulacji fenotypu gładkich mięśni naczyniowych, bezpośrednio informując decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w rozwoju terapii sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na przełączanie fenotypu komórek mięśni gładkich naczyń z postaci proliferacyjnej na kurczliwą.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system in vivo do walidacji związania z celem oraz wpływu funkcjonalnego interwencji molekularnych, takich jak dostarczenie miR-145.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych punktów końcowych histopatologicznych (grubość warstwy wewnętrznej, pozytywność Ki-67) do oceny zależności dawka-odpowiedź w przypadku potencjalnych środków terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację przygotowania przeszczepów żylnych oraz połączeń tętniczych w celu uzyskania spójnych odczytów fenotypowych w różnych badaniach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala powiązać wyniki uzyskane in vitro (np. wpływ miR-145 na VSMC) z fizjologicznie istotnymi warunkami ciśnienia tętniczego in vivo.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie drożności przeszczepu oraz postępu hiperplazji, co pozwala na prowadzenie długofalowych badań nad skutecznością.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć w obszarze układu sercowo-naczyniowego, wspierając walidację celu po badaniach przesiewowych in vitro oraz przed badaniami nad skutecznością przedkliniczną w większych modelach lub translacją kliniczną.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących szlaków przebudowy naczyniowej pod wpływem patofizjologicznego stresu mechanicznego.
- Przesiewanie: Dostarczanie ilościowych wyników histologicznych i immunohistochemicznych w celu uszeregowania kandydatów terapeutycznych.
- Analityka: Umożliwianie analizy morfometrycznej i wskaźników proliferacyjnych (np. powierzchni hiperplazji intimy, Ki-67+) w celu porównania efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Zapewnienie środowiska przeszczepu żylnego istotnego z punktu widzenia choroby w celu oceny ciągłości mechanizmu od hodowli komórkowej do wyników na poziomie tkankowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie standaryzowanej platformy chirurgicznej, którą można dostosować do wielu modalności terapeutycznych (kwasy nukleinowe, leki, leki biologiczne) w celu usprawnienia przeszczepów naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w przypadku niewydolności przeszczepów naczyniowych poprzez wykazanie, że hiperplazja intimy jest procesem zależnym od ciśnienia.
- Wartość operacyjna: Oferuje kosztowo efektywny, powtarzalny model o ograniczonej inwazyjności, wspierający badania podłużne i redukcję liczby wykorzystywanych zwierząt.
- Wartość strategiczna: Usprawnia kryteria decyzji o kontynuacji badań (go/no-go) poprzez przewidywanie ryzyka klinicznej niewydolności przeszczepu na podstawie skuteczności tłumienia hiperplazji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapie naczyniowe celujące w modulację fenotypu mięśni gładkich, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgicznych technik naczyniowych oraz anastomoz żylnych i tętniczych u małych ssaków.
- Zależne od dostępu do sprzętu chirurgicznego (instrumentów mikrochirurgicznych, nici chirurgicznych, cewników balonowych, heparyny) oraz zaplecza do monitorowania pooperacyjnego.
- Wymaga stosowania ustandaryzowanych protokołów pobierania żył, denudacji błony śródbłonka oraz łączenia tętnic w celu zapewnienia powtarzalności modelu.
- Adaptacja do modeli na większych zwierzętach może wymagać dostosowania średnicy naczyń, grubości nici chirurgicznych oraz dawkowania leków przeciwzakrzepowych przy zachowaniu ekspozycji na ciśnienie tętnicze.
- Ocena wyników zależy od możliwości opracowania materiału histologicznego oraz przeprowadzenia barwień immunohistochemicznych dla punktów końcowych, takich jak grubość intimy i Ki-67.
