Name: Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę wielofotonowej mikroskopii do obserwacji naczyń krwionośnych w wątrobie myszy żywego organizmu. Technika umożliwia wizualizację dynamiki trójwymiarowych struktur naczyniowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81772133, 81902444), Fundusz Nauk Przyrodniczych Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), Projekt Badawczy Nauki i Technologii Zdrowia Obywatelskiego w Kantonie (201803010034, 201903010072) oraz Projekt Wojskowych Innowacji Medycznych (17CXZ008).

Wszystkie procedury dotyczące opieki nad zwierzętami były zgodne z polityką chińskiego szpitala Nanfang dotyczącą zdrowia i dobrego samopoczucia (nr wniosku: NFYY-2019-73).
1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulij mysz.
	<ol>
		<li>Przygotować pentobarbital sodu (50 mg/kg) w strzykawce.</li>
		<li>Chwyć mysz (8-tygodniowego samca C57BL/6) lewą ręką tak, aby jej brzuch był skierowany do góry, a głowa niżej niż ogon. Zdezynfekuj skórę brzucha 75% alkoholem.</li>
		<li>Trzymając strzykawkę w prawej ręce, przekłuć igłą białą linię brzucha lekko w prawą stronę skóry na 3-5 mm. Upewnij się, że igła strzykawki i skóra są ustawione pod kątem 45°, powoli wstrzyknij pentobarbital do jamy brzusznej. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.</li>
		<li>Sprawdź, czy znieczulenie powiodło się przez brak odruchu prostującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć izotiocyjanian rodaminy B-dekstran do żyły ogonowej.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 μl 10 mg/ml izotiocyjanianu rodaminy B i dekstranu w strzykawce.</li>
		<li>Przetrzyj ogon myszy 75% alkoholem.</li>
		<li>Przytrzymaj ogon lewą ręką, trzymaj strzykawkę w prawej ręce z igłą równolegle do żyły i wstrzyknij 100 μl barwnika.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu należy zatamować krwawienie bawełnianym wacikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Namocz sierść na brzuchu myszy gazą zwilżoną sterylną wodą i ogol brzuch myszy za pomocą brzytwy, wykonując ruchy w kierunku futra. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.</li>
	<li>Po przetarciu poduszki grzewczej 75% alkoholem otwórz poduszkę grzewczą i umieść mysz na plecach w poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.</li>
</ol>
2. Mocowanie wątroby myszy za pomocą ramki do obrazowania narządów ciała
UWAGA: Ramka do obrazowania narządów komercyjnych nie została jeszcze wydana.
<ol>
	<li>Umieść czystą przyssawkę w ustalonej pozycji.</li>
	<li>Zainstaluj urządzenie do obrazowania narządów (rysunek uzupełniający 1) i przetrzyj poduszkę grzewczą i przyssawkę 75% alkoholem.</li>
	<li>Podłącz przyssawkę (o średnicy 5 mm) do węża pompy próżniowej i włącz pompę próżniową.</li>
	<li>Na sterylnym stole wysterylizowanym 75% alkoholem dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, następnie dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, a następnie nożyczkami chirurgicznymi odcina 2 cm skóry od dolnej granicy mostka myszy i odsłania wątrobę.</li>
	<li>Umieść mysz razem z poduszką grzewczą na podstawie uchwytu.</li>
	<li>Wyreguluj uchwyt do obrazowania narządów tak, aby przyssawka przytrzymywała wątrobę. Następnie użyj podciśnienia 30-35 kPa do ssania, tak aby wątroba przyczepiła się do przyssawki (rysunek uzupełniający 2).</li>
</ol>
3. Regulacja wielofotonowego laserowego mikroskopu skaningowego
<ol>
	<li>Włącz mikroskop wielofotonowy i wybierz obiektyw 60x/1,00 W.</li>
	<li>Zamocuj ramkę i mysz pod soczewką obiektywu.</li>
	<li>Dodaj kroplę zwykłej soli fizjologicznej, która może pokryć całą soczewkę, która jest środkiem przyssawki, i wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby dotykała tylko normalnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę komputera, aby włączyć oprogramowanie lasera i włączyć przełącznik. Następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk zasilania i migawkę przez 3 sekundy.</li>
	<li>Ustaw długość fali na 800 nm.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu za pomocą komputera.</li>
	<li>W polu Acquisition Setting (Ustawienie akwizycji) ustaw Laser 800 (Laser 800).</li>
</ol>
4. Obserwacja za pomocą wielofotonowego laserowego mikroskopu skaningowego
<ol>
	<li>W obszarze Image Acquisition Control (Kontrola pozyskiwania obrazów) kliknij przełącznik Fluorescent (Fluorescencyjny).</li>
	<li>Upewnij się, że oświetlenie w pomieszczeniu i sprzęcie jest wyłączone. Aby zmniejszyć poziom hałasu, używaj mikroskopu w zaciemnionym otoczeniu.</li>
	<li>Otwórz przesłonę ścieżki światła w mikroskopie.</li>
	<li>Obróć filtr fluorescencyjny na czwarty bieg i pociągnij dwie dźwignie przełącznika optycznego.</li>
	<li>Patrząc przez okular, użyj quasispirali zgrubnej i precyzyjnej ostrości, aby wyregulować ogniskową, a osi X/Y użyj opcji Dostosuj pole widzenia, aby znaleźć obszar docelowy.</li>
</ol>
5. Wielofotonowa mikrografia skaningowa laserowa
<ol>
	<li>Wyłącz przełącznik fluorescencyjny w oprogramowaniu, przełącz filtr fluorescencyjny na drugi bieg (drugi bieg to RXD1) i naciśnij dwie dźwignie przełącznika optycznego.</li>
	<li>Kliknij Focus ×2, aby wyświetlić podgląd obszaru docelowego i dostosować ustawienia akwizycji oraz parametry kontroli akwizycji obrazu (rozdzielczość obrazu: 1024).</li>
	<li>Naciśnij Control + C i dostosuj wysokie napięcie, wzmocnienie i przesunięcie (aby zmniejszyć poziom szumów).</li>
	<li>Kliknij Zatrzymaj, aby zatrzymać podgląd, kliknij przycisk XY, aby zeskanować w dwóch wymiarach, i zapisz po zakończeniu (Rysunek 1).</li>
	<li>Wybierz region, kliknij Głębokość, a następnie Podgląd, aby wybrać zestaw końcowy i zestaw początkowy (patrz pełna wymagana część naczynia krwionośnego) w ustawieniach Mikroskop. Skanuj obrazy 3D i zapisz je po zakończeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Wybierz region, kliknij Czas i dostosuj inne ustawienia akwizycji oraz parametry kontroli akwizycji obrazu (Rozmiar kroku: 1 μm; Plastry: 10; Numer skanowania czasowego: 40). Skanuj różne plasterki i zapisz je po zakończeniu, aby uzyskać ruchome obrazy (Wideo 1). 
	UWAGA: Poproś kogoś, aby zaopiekował się myszami podczas skanowania i odpowiednio dodał znieczulenie.</li>
	<li>Poświęć mysz przez sekcję szyi.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+vascular+imaging+techniques+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomed Research International. 2015, 783983(2015).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obserwacja określonej żywej tkanki jest skutecznym sposobem zrozumienia zmian, lokalizacji i skutków biologicznych materiału wewnątrz tkanki17. W tym eksperymencie ważnymi krokami są naprawienie wątroby za pomocą urządzenia do obrazowania narządów, które może rozwiązać problem artefaktów ruchowych spowodowanych oddychaniem i biciem serca, oraz użycie mikroskopu wielofotonowego do obserwacji. Za pomocą tej metody wewnętrzne tkanki wątroby in vivo są obserwowane za pomocą mikroskopu wielofotonowego,...

Naczynia krwionośne mogą dostarczać składników odżywczych dla różnych tkanek narządowych ludzkiego ciała i wymieniać substancje. W tym samym czasie wiele cytokin, hormonów, leków i komórek działa również poprzez transport naczyniowy do określonych lokalizacji. Obserwacja zmian naczyniowych w tkance wątroby może pomóc w zrozumieniu rozkładu przepływu krwi w tkance wątroby i transportu substancji, a także pomóc w analizie niektórych chorób związanych z naczyniami krwionośnymi1,2.
Istnieje wiele sposobów na obserwację naczyń krwionośnych wątroby u myszy. Wśród nich mikroskopia optyczna ma wiele ograniczeń w obserwacji nieprzezroczystej tkanki naczyniowej3. Mikroskopia wielofotonowa może być używana do obrazowania naczyń krwionośnych żywych wątrob za pomocą nieinwazyjnej wysokiej rozdzielczości4. Nie tylko można uzyskać trójwymiarowe obrazy naczyń krwionośnych, ale technika ta może być również wykorzystana do pomocy w organizacji tkanki w celu obserwacji zachodzących w niej efektów biologicznych; Co więcej, można obrazować całą tkankę, a nie tylko mikronaczynia, jak w tomografii komputerowej i rezonansie magnetycznym5.
Mikroskopia wielofotonowa może być używana do skutecznego wykrywania rozproszonych sygnałów fluorescencyjnych w głęboko żyjących tkankach, przy mniejszej fototoksyczności6. Dzięki temu można zapewnić aktywność żywej tkanki i zmniejszyć ilość uszkodzeń. Mikroskopia wielofotonowa ma lepszą zdolność penetracji niż mikroskopia konfokalna, umożliwiając obserwację głębszych warstw7, zapewniając unikalne obrazowanie 3D. Mikroskopia wielofotonowa jest obecnie często stosowana w obrazowaniu nerwów czaszkowych8 i została rozszerzona o badanie dynamiki neuronów u żywych myszy9,10,11.
W tym eksperymencie, po fluorescencyjnym oznakowaniu naczyń krwionośnych myszy, wątroba jest unieruchomiona w ramce, a dynamikę naczyń krwionośnych w żywej tkance wątroby można zobaczyć za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Ten eksperyment pokazuje, jak oznaczać określone substancje, używać mikroskopii wielofotonowej do obserwacji lokalizacji w tkance, obserwować zdarzenia komórkowe w tkance międzykomórkowej, dokonywać pomiarów fotochemicznych12,13,14 i obserwować dynamikę materiału wewnątrz żywej tkanki15. Na przykład marker śródbłonka nowotworu 1 (TEM1) został zidentyfikowany jako nowy marker powierzchniowy regulowany w górę na naczyniach krwionośnych i zrębie w wielu guzach litych, oznaczający jednołańcuchowy zmienny fragment (scFv) 78 przeciwko TEM1, a następnie mikroskopia wielofotonowa może być wykorzystana do lokalizacji naczyniaka krwionośnego myszy i oceny guzów16.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml x 2</td><td>Hunan Pinan Technologia urządzeń medycznych</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza 5 W</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% absolutny etanol</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Chłonny wacik</td><td>Zdrowe warunki sanitarne Królestwo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument chirurgiczny myszy</td><td>RWD Nauki</td> <td>przyrodniczeSP0001-G</td><td>W tym nożyczki i pęseta Mikroskopia</td></tr><tr><td>wielofotonowa</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Oprawa do obrazowania narządów</td><td>Technologia BiolinkOptics</td><td>BL336</td><td>W zestawie przyssawka, wąż, pompa podciśnieniowa i wspornik</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian rodaminy B&ndash; Maszynka do golenia Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Obserwacja wewnątrznaczyniowej dynamiki tkanki wątroby myszy pozwala nam na prowadzenie dalszych dogłębnych obserwacji i badań nad chorobami tkankowymi wątroby myszy. Myszowi wstrzykuje się barwnik, który może zabarwić naczynia krwionośne. Aby obserwować wątrobę myszy in vivo, jest ona naświetlana i mocowana w ramce. Dwu- i trójwymiarowe obrazy naczyń krwionośnych w tkance wątroby uzyskuje się za pomocą mikroskopu wielofotonowego. Obrazy tkanek w wybranych miejscach są rejestrowane w sposób ciągły w celu obserwacji długotrwałych zmian; Obserwuje się również dynamiczne zmiany naczyń krwionośnych w tkankach wątroby. Mikroskopia wielofotonowa to metoda obserwacji funkcji komórek i komórek w głębokich skrawkach tkanek lub narządach. Mikroskopia wielofotonowa ma czułość na mikrostrukturę tkanek i umożliwia obrazowanie tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej in vivo, zapewniając możliwość uchwycenia informacji biochemicznych organizacji. Mikroskopia wielofotonowa służy do obserwacji części wątroby, ale utrwalenie wątroby w celu ustabilizowania obrazu jest problematyczne. W tym eksperymencie specjalna przyssawka próżniowa służy do unieruchomienia wątroby i uzyskania bardziej stabilnego obrazu wątroby pod mikroskopem. Ponadto metoda ta może być stosowana do obserwacji dynamicznych zmian określonych substancji w wątrobie poprzez oznaczanie takich substancji barwnikami.

Rozkład naczyń krwionośnych w wątrobie można zobaczyć na Rysunku 1, obrazowanym za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Naczynie krwionośne dzieli się na szereg odgałęzień wychodzących z pnia i rozprzestrzeniających się w otaczającej przestrzeni. Zewnętrzny obrys naczynia krwionośnego jest czerwony, wewnętrzna jama ciemna, a w jej wnętrzu znajduje się wiele elementów. Im wyraźniejszy jest obraz, tym bliżej płaszczyzny obserwacji on się znajduje. Wokół widoczne są również czerwone plamki, co pr...

W tym eksperymencie, myszowi wstrzykuje się do żyły ogonowej izotiocyjanian rodaminy B, który może zabarwiać naczynia krwionośne. Po odsłonięciu i utrwaleniu wątroby można wybrać określoną część wątroby do obserwacji głębokiej tkanki w żywym ciele za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Ta metoda może nam pomóc w wizualizacji ruchów naczyń krwionośnych w wątrobie myszy wzdłuż ewolucji dynamiki wątroby w wielu wymiarach. Za pomocą tej metody możemy zobrazować dynamikę naczyń krwionośnych w wątrobie w trzech wymiarach. Pokazaliśmy użycie barwnika naczyniowego, ale możesz wykonać barwienie naczyń za pomocą interesującej Cię substancji przed wizualizacją mikroskopową.Po potwierdzeniu braku odruchu prostowania u znieczulonego ośmiotygodniowego samca C 57 czarnej myszy sześcioosobowej. Przetrzyj ogon myszy 75% alkoholem i użyj strzykawki o pojemności jednego mikrolitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 30, aby wstrzyknąć 10 miligramów na mililitr świeżo przygotowanej izotiocyjanianu rodaminy B w 100 mikrolitrach izotiocyjanianu rodaminy B do żyły ogonowej ogona. Gdy cały roztwór zostanie dostarczony, użyj bawełnianego wacika, aby wycisnąć nacisk na miejsce nakłucia i użyj gazy zwilżonej sterylną wodą, aby namoczyć sierść na brzuchu.Użyj brzytwy, aby ogolić brzuch, wykonując ruchy w kierunku futra, i umieść mysz na poduszce grzewczej zdezynfekowanej alkoholem o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby naprawić wątrobę myszy za pomocą ramki do obrazowania narządów ciała, najpierw umieść czystą przyssawkę o średnicy pięciu milimetrów w ustalonej pozycji i wytrzyj poduszkę grzewczą i przyssawkę 75% alkoholem. Podłącz przyssawkę do węża pompy próżniowej i włącz pompę.Na stole wysterylizowanym alkoholem o zawartości 75% alkoholu użyj nożyczek chirurgicznych, aby odciąć dwa centymetry skóry od dolnej granicy mostka myszy i odsłonić wątrobę. Umieść mysz i poduszkę grzewczą na podstawie uchwytu ramy korpusu i wyreguluj uchwyt do obrazowania narządów tak, aby przyssawka mogła utrzymać wątrobę. Następnie użyj podciśnienia od 30 do 35 kilopaskali do ssania, aby wątroba przyczepiła się do kubka.Aby skonfigurować wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy, włącz mikroskop i wybierz obiektyw 60 X. Zamocuj ramkę i mysz pod obiektywem i dodaj kroplę soli fizjologicznej do kubka wystarczająco dużego, aby zakryć soczewkę. Ustaw obiektyw tak, aby soczewka dotykała normalnej soli fizjologicznej i włącz oprogramowanie lasera.Włącz laser, a następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk zasilania i migawkę przez trzy sekundy. Następnie uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw laser na 800 nanometrów. Aby ustawić kontrolę akwizycji obrazu, kliknij przełącznik fluorescencyjny i wyłącz oświetlenie pomieszczenia i sprzętu.Otwórz migawkę ścieżki światła w mikroskopie i obróć filtr fluorescencyjny na czwarty bieg. Pociągnij za dwie dźwignie przełącznika optycznego i patrząc przez okular, użyj quasi spirali kursu i precyzyjnego ogniskowania, aby wyregulować ogniskową. Następnie użyj osi X, Y, aby dostosować pole widzenia, aby zlokalizować obszar docelowy.W celu obrazowania wyłącz przełącznik fluorescencyjny w oprogramowaniu i przełącz filtr fluorescencyjny na drugi bieg. Naciśnij dwie dźwignie przełącznika optycznego i kliknij razy ostrości dwa, aby wyświetlić podgląd obszaru docelowego, dostosuj ustawienia akwizycji i parametry kontroli akwizycji obrazu, a następnie naciśnij przycisk Control plus C, aby dostosować wysokie napięcie wzmocnienia i przesunięcia. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zatrzymać podgląd, kliknij przycisk X Y, aby zeskanować w dwóch wymiarach, a następnie kliknij przycisk Zapisz.Wybierz obszar, a następnie kliknij przycisk głębokość i podgląd, aby wybrać zestaw końcowy i początkowy w ustawieniach mikroskopu. Skanuj obrazy 3D i zapisz. Po zeskanowaniu wybierz region czasu kliknięcia i dostosuj inne ustawienia akwizycji oraz kontrolowane parametry akwizycji obrazu.Następnie zeskanuj różne plasterki i zapisz, aby uzyskać wynikowy film obrazu. Tutaj można zaobserwować wizualizację rozmieszczenia naczyń krwionośnych w wątrobie za pomocą mikroskopii wielofotonowej, jak pokazano. To naczynie krwionośne jest podzielone na wiele gałęzi wychodzących z pnia i rozprowadzonych w otaczającej przestrzeni.Zewnętrzny obwód naczynia krwionośnego można zaobserwować na czerwono, podczas gdy wewnętrzna jama jest ciemna, jak zaobserwowano na filmie, nieczerwone obiekty poruszające się w naczyniach mogą być komórkami. Ciemność tkanki zaobserwowana na tym filmie jest prawdopodobnie spowodowana tym, że wątroba nie została dobrze naprawiona z biegiem czasu. Ważne jest, aby pamiętać, że sposób utrwalenia wątroby bez blizn wpływa na stabilność obrazu.Metodologia ta może być również zastosowana do położenia innych struktur w wątrobie w celu bezpośredniej obserwacji rozmieszczenia lub zmian w określonych strukturach pracy będących przedmiotem zainteresowania.

multiphoton-microscopic-observation-of-vessels-in-mouse-liver-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowano system optyczny służący do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych FITC oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy naczyń, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego.

Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film opisuje procedurę obrazowania do obserwacji i badania wewnątrznaczyniowej dynamiki tkanki wątroby myszy za pomocą mikroskopii wielofotonowej po ustabilizowaniu narządu. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia obrazowanie tkanek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej in vivo.

Wspomagana oprawą obrazowania ocena wątroby myszy do wizualizacji naczyniowej opartej na mikroskopii wielofotonowej: technika obrazowania wspomagana urządzeniem stabilizacyjnym w celu uzyskania wielowymiarowych obrazów naczyń krwionośnych w wątrobie myszy

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100 μm) i czułości stanowi odpowiednią nieinwazyjną metodę obrazowania w celu uzyskania kompleksowego jakościowego przeglądu naczyń wątrobowych. UFUS ułatwia również ilościowe pomiary mikrokrążenia, mając na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów chorób naczyniowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Poznaj metodę wielofotonowej mikroskopii do obserwacji naczyń krwionośnych w wątrobie myszy żywego organizmu. Technika umożliwia wizualizację dynamiki trójwymiarowych struktur naczyniowych w czasie rzeczywistym.

Wielofotonowa obserwacja mikroskopowa naczyń w tkance wątroby myszy

Przeglądaj więcej filmów