Name: Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metody składania białek podobnych do elastyny w struktury supramolekularne, takie jak wesikuly, włókna i koacervaty, oraz techniki enkapsulacji ładunku in vitro dla zastosowań w dostarczaniu leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują BMBF za wsparcie finansowe oraz Centrum Analiz Systemów Biologicznych (ZBSA) za udostępnienie obiektu badawczego. Jesteśmy wdzięczni firmie P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Kalifornia, USA za dostarczenie plazmidu pEVOL-pAzF. Dziękujemy personelowi Centrum Obrazowania Życia (LIC) w Centrum Analiz Systemów Biologicznych (ZBSA) Uniwersytetu Alberta Ludwigsa we Freiburgu za pomoc w udostępnieniu zasobów mikroskopii konfokalnej oraz doskonałe wsparcie w rejestrowaniu obrazu.

1. Projektowanie i klonowanie amfifilowych białek elastynopodobnych (ELP)
<ol>
	<li>Sklonuj i zaprojektuj konstrukcje zgodnie z opisem w innym miejscu8,20. Plazmidy są dostępne na życzenie.</li>
</ol>
2. Ekspresja, oczyszczanie i przygotowanie białek
<ol>
	<li>Ekspresja F20E20-mEGFP i F20E20-mCherry
	<ol>
		<li>Zaszczepić główną kulturę ekspresji z nocnej kultury wstępnej do OD600 0,3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami w kolbie o pojemności 2 l.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy IPTG (1 M) do indukcji kultury ekspresji w wodzie ultraczystej.</li>
		<li>Po osiągnięciu OD600 0,5–0,8 dodać IPTG do hodowli ekspresji do końcowego stężenia 1 mM i zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 °C. Pozostawić do odciągania w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja amfifilowego ELP zawierającego UAA pAzF
	<ol>
		<li>Inokulować główną kulturę ekspresji z nocnej hodowli wstępnej E. coli zawierającej dwa plazmidy pEVOL pAzF i np. pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his do OD600 0,3 (patrz informacje uzupełniające dotyczące sekwencji aminokwasów). Inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min w sterylnym 400 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i chloramfenikolem w kolbie o pojemności 2 l.</li>
		<li>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy pAzF w ultraczystej wodzie. Na 10 ml roztworu podstawowego pAzF odważyć 206,2 mg pAzF i ponownie zawiesić go w 8 ml ultraczystej wody. Aby rozpuścić pAzF, należy podnieść pH roztworu za pomocą 3 M NaOH i energicznie wymieszać. Po rozpuszczeniu pAzF ostrożnie obniż pH do 10,5 i dodaj ultraczystą wodę do końcowej objętości 10 ml. Użyć sterylnego filtra (0,22 μm) i poddzielić roztwór do probówek reakcyjnych o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w wodzie ultraczystej i 20% roztwór podstawowy arabinozy w wodzie ultraczystej.</li>
		<li>Po osiągnięciu OD600 0,5–0,8 dodać pAzF do kultury ekspresji do końcowego stężenia 2 mM. Inkubować kulturę przez 10 minut, w temperaturze 37 °C, 200 obr./min, aby umożliwić wychwyt pAzF.</li>
		<li>Indukować ekspresję białka docelowego i ekspresję niezbędnej syntetazy tRNA/t-RNA poprzez jednoczesne dodawanie IPTG (1 mM) i arabinozy (2%) oraz obniżyć temperaturę inkubacji do 20 °C.</li>
		<li>Odciągać pokarm w temperaturze 20 °C przez około 20 godzin przy 200 obr./min. Kultura ekspresji zbiorów przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 4000 x g, 40 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek i oczyszczanie białek
	<ol>
		<li>Zawiesić osad E. coli w buforze do lizy (10 ml na litr kultury; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 0,25% Triton X-100) zawierający lizozym (0,1 mg / ml) i PMSF (0,1 mM). Inkubować przez 30 minut na lodzie, a następnie dwukrotnie zamrozić i rozmrozić, zanurzając próbkę w ciekłym azocie.</li>
		<li>Sonikować zawiesinę (30%, 15 razy, 30 s: 10 s przerwy) i usunąć lizat przez odwirowanie (4 °C, 10 000 x g przez 40 min).</li>
		<li>Oczyszczać białko za pomocą chromatografii powinowactwa (np. na kolumnie niklowej o pojemności 1 ml przy użyciu systemu FPLC podłączonego do kolektora frakcji; patrz tabela materiałów). Eluować białko za pomocą buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M mocznik, 250–500 mM imidazolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
		<li>Analizuj skuteczność oczyszczania za pomocą SDS-PAGE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Modyfikacja barwnika ELP za pomocą SPAAC
<ol>
	<li>Z grubsza oszacować stężenie roztworu ELP. Absorpcja280 do oceny stężenia nie jest wartościowa, ponieważ sekwencja pAzF-R40F20 nie zawiera aminokwasów absorbujących w zakresie UV. W związku z tym, wcześniej liofilizowany i ważony amfifil ELP może być używany jako odniesienie do porównania pasm SDS PAGE. Poprzez porównanie zsumowanej intensywności wartości szarości pasm SDS PAGE z roztworów ELP o znanych stężeniach i próbce, można oszacować przybliżone stężenie próbki.</li>
	<li>Dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM roztwór podstawowy; 20 μM stężenie końcowe) do 500 μL roztworu ELP (~20 μM). Inkubować reakcję przez około 10 godzin w temperaturze 15 °C, wstrząsając i chroniąc przed światłem.</li>
	<li>W celu dalszego użycia należy dializować reakcję w celu usunięcia nadmiaru BDP.
	<ol>
		<li>Wyrównać membranę dializacyjną (np. odcięcie 12 kDa) w ultraczystej wodzie przez 10 minut. Przyciąć membranę do dializy do odpowiedniego rozmiaru, który należy umieścić na otworze rurki reakcyjnej zawierającej kliknięty roztwór ELP. Aby zamocować membranę dializacyjną w otworze, należy umieścić pokrywę rurki reakcyjnej z wybitym rdzeniem na otworze, zamykając w ten sposób rurkę.</li>
		<li>Umieść probówkę reakcyjną do góry nogami w wybranym buforze. Wymieniaj bufor (2–5 l) dwa razy po dializie przez co najmniej 3 godziny za każdym razem. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między membraną dializacyjną a buforem, aby zapewnić skuteczną dializę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Protokół pęcznienia THF
<ol>
	<li>Dializować jednorodny roztwór ELP w stosunku do buforu fosforanowego lub trisowego (10 mM) o stabilnym pH 7,5 w celu usunięcia soli i pozostałych związków z oczyszczania his-tag.</li>
	<li>Przygotuj liofilizator i ostudź do temperatury początkowej do liofilizacji.</li>
	<li>Podwielokrotność dializowanego roztworu białka umieścić w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml (50–500 μl na probówkę) i zamrozić szokowo w ciekłym azocie. Aby uniknąć niepożądanego mieszania różnych roztworów białkowych podczas liofilizacji, na probówkę reakcyjną można nałożyć nakrętki z małym otworem, aby ją częściowo uszczelnić.</li>
	<li>Wyjmij zamrożone próbki białka z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w liofilizatorze, aby rozpocząć liofilizację. Liofilizację kończy się, gdy próbka jest całkowicie sucha (około 24–48 godzin). Następnie przewietrzyć liofilizowane amfifilowe ELP suchymN2, a następnie natychmiast zamknąć pokrywy probówek reakcyjnych, aby uniknąć kontaktu z wilgocią z powietrza.</li>
	<li>Dodać czysty THF do liofilizowanych próbek (ELP, 5–10 μM) i umieścić roztwór w sonikatorze łaźni wodnej zawierającym lodowatą wodę na 15 minut, aby umożliwić pęcznienie ELP w THF.</li>
	<li>Podgrzej termocykler do 30–60 °C w celu tworzenia pęcherzyków lub do 90 °C w celu tworzenia włókien i przygotuj nowe probówki reakcyjne zawierające ultraczystą wodę lub bufor (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5–13). Kuliste koacerwaty gromadzą się głównie w temperaturze 20 °C i pH 9–13. Tworzenie pęcherzyków sprzyja tworzeniu się pęcherzyków w temperaturze 50–60 °C przy pH od 7 do 9. Powstawanie włókien jest głównie indukowane powyżej 60 °C w zakresie pH od 5 do 12.</li>
	<li>Po etapie sonikacji umieść roztwór ELP/THF oraz przygotowaną wodę ultraczystą lub roztwór buforowy w termocyklerze i podgrzewaj do żądanej temperatury przez 5 minut. Po osiągnięciu temperatury podgrzany roztwór ELP/THF należy dokładnie rozwarstwić na wierzchu podgrzanej ultraczystej wody lub roztworu buforowego. Powinno być widoczne wyraźne oddzielenie dwóch faz z wyraźnym interfejsem.</li>
	<li>Ponownie umieścić mieszaninę w termocyklerze i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić tworzenie się pęcherzyków lub włókien na granicy faz. Następnie pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez 10 minut przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub dializy.</li>
	<li>Roztwór zawierający struktury supramolekularne dializować z ultraczystą wodą lub buforem (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7–10).</li>
</ol>
5. Protokół ekstruzji BuOH
<ol>
	<li>Przygotuj 1–50 μM roztwór ELP w ultraczystej wodzie lub buforze (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, może zawierać do 4 M mocznika). Stężenie amfifilowego roztworu ELP F20R20-mEGFP i F20R20-mCherry można określić za pomocą współczynników ekstynkcji molowej (F20R20-mEGFP A280 = 22015 M-1 cm-1 i F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1) (patrz informacje uzupełniające dla sekwencji aa).</li>
	<li>Dodać 10%-20% (v/v) 1-butanolu i natychmiast wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół lub kilkakrotnie pobierając go przez strzykawkę. Można zastosować zwykłą pipetę o pojemności 100 μl lub strzykawkę Hamilton wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm. Zmętnienie roztworu podczas mieszania powinno wzrosnąć, co wskazuje na tworzenie się pęcherzyków. 1-oktanol 5%–15% (v/v) może być również stosowany do wytłaczania pęcherzyków zamiast 1-butanolu.</li>
	<li>W celu uzyskania wąskiego rozkładu wielkości należy wytłaczać pęcherzyki za pomocą mini ekstrudera przez membranę o wielkości porów 1 μm w temperaturze pokojowej. Rozmiar membrany użytej do wytłaczania określa górną granicę wielkości pęcherzyków.</li>
	<li>Dializować pęcherzyki zgodnie z powyższym opisem (krok 3.3) w celu usunięcia pozostałości 1-butanolu.</li>
</ol>
6. Hermetyzacja barwnika za pomocą protokołu ekstruzji BuOH
<ol>
	<li>Wymieszać około 40 μl roztworu ELP w 10 mM Tris-HCl, pH 8 z 1 μl dekstranu Texas Red (0,0025 mg/ml stężenie końcowe).</li>
	<li>Do roztworu dodać 10 μL BuOH i 5–10 razy wycisnąć przez strzykawkę wyposażoną w igłę 0,25 x 25 mm.</li>
</ol>
7. Analiza struktur supramolekularnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Umieść pierścień wzmacniający na szkiełku podstawowym i mocno dociśnij stronę samoprzylepną do szkła.</li>
	<li>Dodać 5 μl próbki do wnętrza pierścienia wzmacniającego i umieścić na nim szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Uszczelnić próbkę lakierem do paznokci na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć odparowania próbki podczas analizy.</li>
	<li>Przeprowadź mikroskopię fluorescencyjną zgodnie z wcześniejszym opisem8.</li>
</ol>

<ol><li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li>
<li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li>
<li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li>
<li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design%2C+synthesis%2C+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li>
<li>Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163(2019).</li>
<li>Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li>
<li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li>
<li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li>
<li>Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers%3AThe+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li>
<li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).</li>
<li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li>
<li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li>
<li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li>
<li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+domains+and+the+%22lipid+raft%22+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li>
<li>Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran%E2%80%93Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+%28BHT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimalist+Protocell+Design%3A+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li>
<li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li>
<li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Błąd podczas postępowania zgodnie z opisanymi protokołami składania zdefiniowanych struktur supramolekularnych prowadzi głównie albo do tworzenia niespecyficznych agregatów (ryc. 2, IV), albo do jednorodnie rozmieszczonych amfifilów ELP. Krytyczne kroki protokołu omówiono poniżej:
Dla wysokiej wydajności ekspresji amfifilowego ELP optymalna jest stosunkowo niska temperatura wynosząca 20°C. Udowodniono, że w celu skutecznego oczyszczania amfifilowego ELP na podstaw...

Tworzenie struktur supramolekularnych do zastosowań biotechnologicznych staje się coraz ważniejsze1,2,3,4,5. W przypadku montażu funkcjonalnych architektur, takich jak koacerwaty, pęcherzyki i włókna o pożądanych właściwościach fizykochemicznych, ważne jest zrozumienie i kontrolowanie właściwości fizykochemicznych i konformacyjnych komponentów. Ze względu na molekularną precyzję cząsteczek występujących w przyrodzie, bloki budulcowe struktur supramolekularnych coraz częściej opierają się na lipidach, kwasach nukleinowych lub białkach. W porównaniu z polimerami syntetycznymi, białkowe bloki budulcowe pozwalają na precyzyjną kontrolę nad powstającymi strukturami supramolekularnymi6 na poziomie genetycznym. Sekwencja aminokwasów pierwszorzędowych (aa) poszczególnych bloków budulcowych białek wewnętrznie koduje informacje o ich potencjale składania od poziomu molekularnego do makroskopowego, a także o trójwymiarowym kształcie i właściwościach fizycznych końcowej struktury supramolekularnej7.
Zgłoszone metody składania różnych struktur supramolekularnych często obejmują białka amfifilowe, takie jak wrażliwe na temperaturę białka podobne do elastyny (ELP)5,8,9, rekombinowane oleozyny10 i sztuczne białka amfifile11. Metody wyzwalane temperaturą doprowadziły do złożenia miceli4,10,12, fibers13, sheets14 and vesicles9,15,16. Metody z użyciem rozpuszczalników organicznych zostały zastosowane do tworzenia dynamicznych pęcherzyków na bazie białek8,11,14. Do tej pory stosowane protokoły tworzenia pęcherzyków często nie miały kontroli nad zespołami o rozmiarach mikrometrów16,17 lub mają ograniczoną wydajność montażu5. Ponadto, niektóre zgłoszone pęcherzyki oparte na ELP mają upośledzony potencjał enkapsulacji12 lub ograniczoną stabilność w czasie9. Rozwiązując te wady, przedstawione protokoły umożliwiają samoorganizację struktur supramolekularnych o rozmiarach mikrometrowych i submikrometrowych o odrębnych właściwościach fizykochemicznych, dobrym potencjale enkapsulacji i długotrwałej stabilności. Dostosowane amfifilowe ELP łączą się w struktury supramolekularne, obejmujące zakres od sferycznych koacerwatów i wysoce uporządkowanych skręconych wiązek włókien do pęcherzyków jednowarstwowych, w zależności od zastosowanego protokołu i związanych z nim warunków środowiskowych. Duże pęcherzykowe przedziały białkowe oparte na błonie białkowej (PMBC) ujawniają wszystkie główne fenotypy, takie jak fuzja błonowa i separacja faz, analogiczne do liposomów. PMBC skutecznie hermetyzują chemicznie zróżnicowane fluorescencyjne cząsteczki ładunku, które można monitorować za pomocą prostej mikroskopii epifluorescencyjnej. Powtarzające się domeny ELP użyte w tym badaniu są atrakcyjnymi elementami budulcowymi dla architektur supramolekularnych opartych na białkach18. Wiadomo, że jednostka powtórzeń pentapeptydu ELP (VPGVG) toleruje różne aa oprócz proliny na czwartej pozycji (walina, V), zachowując przy tym swoje właściwości strukturalne i funkcjonalne19. Projekt amfifilowych ELP zawierających charakterystyczne domeny hydrofilowe i hydrofobowe został zrealizowany poprzez wstawienie reszt gościa aa (X) do powtórzenia VPGXG z wyraźną hydrofobowością, polarnością i ładunkiem20. Amfifilowe domeny ELP były wyposażone w hydrofobową fenyloalaninę (F) lub izoleucynę (I), podczas gdy domena hydrofilowa zawierała naładowany kwas glutaminowy (E) lub argininę (R) jako reszty gości. Listę kwalifikujących się amfifilowych konstruktów ELP i odpowiadających im sekwencji aa można znaleźć w informacjach uzupełniających i odniesieniach8,21. Wszystkie elementy składowe zostały wyposażone w małe barwniki fluorescencyjne lub białka fluorescencyjne do wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. mEGFP i inne białka fluorescencyjne zostały N-końcowo połączone z hydrofilowymi domenami amfifilów ELP. Barwniki organiczne sprzężono za pomocą cykloaddycji alkinowo-azydkowej promowanej przez szczep bez miedzi (SPAAC) do kotranslacyjnie wprowadzonego nienaturalnego aminokwasu (UAA). Jednoczesna inkorporacja para-azydofenyloalaniny UAA (pAzF)22 pozwala na N-końcową modyfikację hydrofilowej domeny ELP. W ten sposób jako sondę fluorescencyjną można użyć zielonego barwnika fluorescencyjnego BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) lub dowolnej małej cząsteczki fluorescencyjnej z naprężoną cyklooktyną. Pomyślne włączenie UAA pAzF i cykloaddycja barwnika za pomocą SPAAC może być łatwo potwierdzona za pomocą LC-MS/MS dzięki wydajnej jonizacji odpowiednich peptydów tryptycznych8. Ten mały barwnik organiczny został zastosowany w celu poszerzenia wyboru rozpuszczalników do protokołów składania, ponieważ białka fluorescencyjne są niekompatybilne z większością rozpuszczalników organicznych. Poniżej opisano dwa najbardziej efektywne protokoły składania struktur supramolekularnych opracowane w naszym laboratorium. Metoda pęcznienia THF jest kompatybilna tylko z amfifilowym ELP modyfikowanym barwnikiem organicznym. Natomiast metoda ekstruzji 1-butanolu (BuOH) jest kompatybilna z wieloma białkami jako sonda fluorescencyjna, np. mEGFP, ponieważ opisana metoda w pełni zachowuje fluorescencję tych białek fuzyjnych. Ponadto enkapsulacja małych cząsteczek i zachowanie fuzji pęcherzykowej działa najlepiej przy zastosowaniu metody ekstruzji BuOH.

<table><tbody><tr><td>1 &mikro; m oraz 0,2 i mikro; m Filtr sterylny</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiothreitol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-butanol. >99,5% rocznie</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2log DNA drabinka</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>79249 Alkine Mega Stokes barwnik</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, bezwodny, 99,8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny, 99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BDP-FL-PEG4-DBCO</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biofuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy z membraną PES (45 &mikro; m, 22 i mikro; m)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brillant Blue G250 (Coomassie)</td> <td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BspQI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera DS Qi1</td><td>Wirówka Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5417r</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810r</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF-400-Cu siatka miedziana o kwadratowej siatce</td><td>EMS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CompactStar CS 4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutralny</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy sonifier</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EarI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką środowiskową ES-20</td><td>Biosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny</td><td>Roth</td> Wsporniki filtracyjne Avanti <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol Proteomika Klasa</td><td>Amresco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H4-Azido-Phe-OH</td><td>Bachhem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza MR HeiTec Heidolph</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF kolumna surowa</td><td>GE Life Sciences Kolumna</td><td>niklowa</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek dymiący kwas, 37%, p.a. </td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator ix 20</td><td>INTAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersions olejek do mikroskopii</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory Wytrząsarki Unimax 1010</td><td>Heidolph</td> Inkubator 1000 Heidolph <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG, >99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfate</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinoza</td><td>Wagi</td> laboratoryjne Roth <td></td><td></td></tr><tr><td>Extend ed2202s/224s-OCE</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator Alpha 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lizozym, 20000 U/mg</td><td>Mikroskop Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 100</td><td>Mikroskop Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopii (15 x 15 mm)</td><td>Szkiełka mikroskopowe VWR</td><td></td><td></td></tr> Zestaw mini-ekstrudera <tr><td></td><td>mikrofalowego VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl, >99,5%, rocznie</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granulki wodorotlenku sodu</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza, PerfectPro</td><td>5 Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miernik pH 766 calimatic</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td><td>Kolumny</td> polipropylenowe Roth <td></td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac basic</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propanol-2-ol</td><td>Emplura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drabinka białkowa 10-250 kDa</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodnica recyrkulacyjna F12</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierścienie wzmacniające</td><td>Herma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SacI HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS Granulki</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat diwodorofosforanu sodu, NaH2PO4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 mm Octan celulozy</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TexasRed Sondy</td><td></td><td></td><td>molekularne</td> z dekstranem</tr><tr><td>Thermomix komfort</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THF, >99.5% rocznie</td><td>Acros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton/Pepton z kazeiny</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik p.a.</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa 2.5</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZelluTrans membrana rurowa z regenerowanej celulozy (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Dopasowane białkowe bloki budulcowe są wszechstronnymi kandydatami do składania struktur supramolekularnych, takich jak minimalne komórki, nośniki leków i rusztowania enzymatyczne. Ze względu na ich biokompatybilność i możliwość dostrajania na poziomie genetycznym, białka podobne do elastyny (ELP) są idealnymi elementami budulcowymi do zastosowań biotechnologicznych i biomedycznych. Niemniej jednak składanie struktur supramolekularnych opartych na białkach o wyraźnych właściwościach fizykochemicznych i dobrym potencjale enkapsulacji pozostaje wyzwaniem.
Tutaj oferujemy dwa efektywne protokoły do samodzielnego montażu amfifilowych ELP w supramolekularne architektury białek, takie jak sferyczne koacerwaty, włókna i stabilne pęcherzyki. Przedstawione protokoły montażu generują kompartmenty białkowe oparte na błonach (PMBC) oparte na ELP o adaptacyjnych właściwościach fizykochemicznych. PMBC wykazują zachowanie separacji faz i ujawniają fuzję membranową zależną od metody oraz są w stanie hermetyzować chemicznie zróżnicowane fluorescencyjne cząsteczki ładunku. Powstałe w ten sposób PMBC mają duży potencjał aplikacyjny jako platforma do formułowania i dostarczania leków, sztuczna komórka i podzielona przestrzeń reakcyjna.

Opracowanie protokołu produkcji pęcherzyków 
Rycina 1 przedstawia dwie różne metody przygotowania pęcherzyków. Metoda pęcznienia w THF, pokazana po lewej stronie, składa się z trzech następujących po sobie etapów i prowadzi do powstania różnych struktur supramolekularnych ELP w zależności od temperatury. Na Rycini 1A obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej pokazują pęcherzyki złożone z BDP-R20F20 oraz struktury w...

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Efektywne łączenie struktur supramolekularnych w celu zminimalizowania projektowania komórek i dostarczania leków pozostaje wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy skuteczne protokoły, które dają struktury supramolekularne oparte na amfifilowych białkach podobnych do elastyny. Przedstawione protokoły składania generują wszechstronne struktury supramolekularne o adaptowalnych właściwościach fizykochemicznych, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty.Przedziały oparte na błonach białkowych wykazują zachowanie separacji faz i pozwalają na enkapsulację chemicznie zróżnicowanych fluorescencyjnych cząsteczek ładunku. W celu ekspresji F20E20-mEGFP i F20E20-mCherry należy zaszczepić główną kulturę ekspresji z nocnej hodowli wstępnej do OD600 0,3. Inkubuj go w 400 mililitrach sterylnego podłoża LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.Gdy kultura ekspresji osiągnie OD600 od 0,5 do 0,8, dodaj IPTG do końcowego stężenia jednego milimola i zmniejsz temperaturę inkubacji do 20 stopni Celsjusza. W celu ekspresji amfifilowego ELP z nienaturalnym aminokwasem, należy zaszczepić główną kulturę ekspresyjną z nocnej hodowli wstępnej E. coli zawierającej odpowiednie plazmidy do OD 0,3. Inkubuj go w 400 mililitrach sterylnego podłoża LB uzupełnionego kanamycyną i chloramfenikolem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.Aby przygotować 100-milimolowy zapas nienaturalnych aminokwasów, dodaj 206,2 miligrama nienaturalnego aminokwasu do ośmiu mililitrów ultraczystej wody. Podnieś pH roztworu za pomocą trójmolowego wodorotlenku sodu i energicznie wymieszaj. Gdy nienaturalny aminokwas się rozpuści, obniż pH do około 10,5 i dodaj ultraczystą wodę do objętości 10 mililitrów.Przefiltrować roztwór sterylnym filtrem 0,22 mikrometra i podzielić go na dwie mililitrowe probówki reakcyjne. Gdy kultura ekspresji osiągnie OD600 od 0,5 do 0,8, dodaj nienaturalny aminokwas do końcowego stężenia dwóch milimolów. Inkubuj go jeszcze przez 10 minut.Następnie indukuj ekspresję białka docelowego i niezbędnej syntetazy tRNA poprzez jednoczesne dodanie IPTG i arabinozy. Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 stopni Celsjusza i pozostawić do odciągania przez około 20 godzin. Po inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4 000 razy g przez 40 minut.Zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy z lizozymem i PMSF. Inkubować roztwór przez 30 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie zamroź i rozmroź go, zanurzając w ciekłym azocie.Roztworu sonikować i usuwać lizat przez odwirowanie w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut. Następnie oczyść białko za pomocą chromatografii powinowactwa. Po elucji białka przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia.Dodaj jeden mikrolitr barwnika fluorescencyjnego do 500 mikrolitrów roztworu ELP i inkubuj reakcję przez około 10 godzin w temperaturze 15 stopni Celsjusza, wstrząsając w ThermoMixerze, upewniając się, że chronisz go przed światłem. Aby usunąć nadmiar barwnika fluorescencyjnego, należy przez 10 minut wyrównać membranę dializacyjną w ultraczystej wodzie. Przyciąć membranę do odpowiedniego rozmiaru, aby umieścić ją na górze otworu rurki reakcyjnej z klikniętym roztworem ELP.Następnie przymocuj membranę do otworu, zamykając rurkę pokrywką, która nie ma rdzenia. Wypełnij przestrzeń między pokrywą a membraną buforem, aby zapobiec uwięzieniu powietrza. Następnie umieść probówkę reakcyjną w wybranym buforze, wsuń ją pod powierzchnię i odwróć do góry nogami.Przeprowadzać dializy przez co najmniej trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwalając na kontynuowanie dializy przez co najmniej trzy godziny po każdej zmianie buforu. W przypadku pęcznienia THF należy dializować jednorodny roztwór ELP z buforem fosforanowym lub Tris o stabilnym pH 7,5. Przygotuj liofilizator i ostudź go do temperatury początkowej do liofilizacji.Podsycić dializowany roztwór białka w 1,5-mililitrowych probówkach reakcyjnych i uszczelnić nakrętkami z małym otworem, aby uniknąć utraty próbki stałej z powodu zmian ciśnienia w trakcie liofilizacji. Szokowe zamrożenie próbek w ciekłym azocie. Wyjmij zamrożone próbki białka z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w liofilizatorze, aby rozpocząć liofilizację.Po całkowitym wyschnięciu próbki należy ją przewietrzyć suchym azotem i natychmiast zamknąć pokrywy probówek reakcyjnych, aby uniknąć kontaktu z wilgocią z powietrza. Dodaj czysty THF do liofilizowanych próbek i umieść roztwór w sonikatorze łaźni wodnej z lodowatą wodą na 15 minut. Podgrzej termocykler do 30 do 60 stopni Celsjusza w celu tworzenia pęcherzyków lub do 90 stopni Celsjusza w celu tworzenia włókien i przygotuj nowe probówki reakcyjne z ultraczystą wodą lub buforem.Po sonikacji umieść roztwór ELP/THF i przygotowaną wodę lub bufor w termocyklerze na pięć minut. Następnie rozwarstwić roztwór ELP na wierzchu wody lub buforu, upewniając się, że widoczne jest oddzielenie dwóch faz i wyraźna interfaza, a następnie umieścić mieszaninę z powrotem w termocyklerze. Pozostawić próbkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przystąpić do dializy z użyciem wody lub buforu lub mikroskopii fluorescencyjnej.Przygotuj roztwór ELP o stężeniu od jednego do 50 mikromolów i dodaj od 10 do 20% 1-butanolu. Natychmiast wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół. Zmętnienie roztworu powinno wzrosnąć podczas mieszania, co wskazuje na tworzenie się pęcherzyków.Aby uzyskać wąski rozkład wielkości, należy wytłaczać pęcherzyki za pomocą mini wytłaczarki przez membranę o wielkości porów jednego mikrometra. W celu kapsułkowania barwnika zmieszać około 40 mikrolitrów roztworu ELP w 10-milimolowym Tris-HCl z jednym mikrolitrem roztworu podstawowego Dextran Texas Red w DMSO. Dodaj 10 mikrolitrów 1-butanolu i wytłaczaj od pięciu do 10 razy przez strzykawkę wyposażoną w igłę o wymiarach 0,25 na 25 milimetrów.Metoda pęcznienia THF składa się z trzech następujących po sobie etapów i prowadzi do różnych zespołów supramolekularnych ELP w zależności od temperatury. Obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej pokazują pęcherzyki złożone z BDP-R20F20 i struktury fibrylarne złożone z BDP-R40F20. Metoda ekstruzji 1-butanolu prowadzi wyłącznie do powstawania pęcherzyków ELP.Około dwóch rzędów wielkości wytwarza się więcej pęcherzyków w porównaniu z metodą pęcznienia THF. BDP-R40F20 zmieszano z 10 do 15% butanolem, a pęcherzyki przygotowano przez ekstruzję mieszaniny. Z BDP-R40F20 złożono różne struktury supramolekularne za pomocą protokołu pęcznienia THF.pH buforu i temperaturę procesu składania dostosowano tak, aby tworzyły koacerwaty, fibryle lub pęcherzyki. Drobne błędy w protokole montażu mogą prowadzić do powstawania agregatów. Dodatnio naładowany barwnik ATTO Rho 13 i polisacharyd dekstran czerwony 3000 zostały zamknięte w świetle pęcherzyków złożonych z F20R20-mEGFP metodą ekstruzji 1-butanolu.Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują pęcherzyki w kanale zielonym, ładunek w kanale czerwonym i udaną enkapsulację w powstałym połączonym kanale. Wykazano również separację faz i zachowanie fuzyjne amfifilów ELP po zmieszaniu pojedynczych bloków budulcowych PMBC w porównaniu ze złożonymi populacjami PMBC. Mieszanie przed złożeniem PMBC prowadzi do jednorodnego rozmieszczenia cząsteczek w zmontowanej błonie PMBC, podczas gdy mieszanie złożonych populacji pęcherzyków prowadzi do plam błonowych czerwonej lub zielonej fluorescencji, które są widoczne przez co najmniej 20 minut.Podejmując się tej procedury, należy zwrócić uwagę na prawidłową kolejność kroków oraz na różnice między metodą pęcznienia THF a metodą wytłaczania butanolem. Zgodnie z tym protokołem, pęcherzyki ELP mogą być wykorzystywane jako transportery leków, jako platforma dla reakcji enzymatycznych, takich jak transkrypcja i translacja in vitro, lub do tworzenia syntetycznych komórek minimalnych.

directed-assembly-elastin-like-proteins-into-defined-supramolecular

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Polipeptydy podobne do elastyny to biopolimery reagujące na bodźce, o różnych zastosowaniach, od oczyszczania białek rekombinowanych po dostarczanie leków. Protokół ten opisuje oczyszczanie i charakterystykę polipeptydów podobnych do elastyny oraz ich fuzji peptydów lub białek z Escherichia coli przy użyciu ich zachowania przemiany fazowej w dolnej temperaturze roztworu krytycznego jako prostej alternatywy dla chromatografii.

Niechromatograficzne oczyszczanie rekombinowanych polipeptydów elastynopodobnych i ich fuzji z peptydami i białkami z Escherichia coli

Technologie rekombinowane umożliwiły projektantom materiałów tworzenie nowatorskich sztucznych białek z dostosowanymi funkcjami do zastosowań inżynierii tkankowej. Na przykład sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej można zaprojektować tak, aby zawierały domeny strukturalne i biologiczne pochodzące z natywnych ECM. W tym miejscu opisujemy budowę i oczyszczanie białek aECM zawierających powtórzenia podobne do elastyny.

Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Poznaj metody składania białek podobnych do elastyny w struktury supramolekularne, takie jak wesikuly, włókna i koacervaty, oraz techniki enkapsulacji ładunku in vitro dla zastosowań w dostarczaniu leków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Przeglądaj więcej filmów