Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Efektywne łączenie struktur supramolekularnych w celu zminimalizowania projektowania komórek i dostarczania leków pozostaje wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy skuteczne protokoły, które dają struktury supramolekularne oparte na amfifilowych białkach podobnych do elastyny. Przedstawione protokoły składania generują wszechstronne struktury supramolekularne o adaptowalnych właściwościach fizykochemicznych, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty.

Przedziały oparte na błonach białkowych wykazują zachowanie separacji faz i pozwalają na enkapsulację chemicznie zróżnicowanych fluorescencyjnych cząsteczek ładunku. W celu ekspresji F20E20-mEGFP i F20E20-mCherry należy zaszczepić główną kulturę ekspresji z nocnej hodowli wstępnej do OD600 0,3. Inkubuj go w 400 mililitrach sterylnego podłoża LB uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Gdy kultura ekspresji osiągnie OD600 od 0,5 do 0,8, dodaj IPTG do końcowego stężenia jednego milimola i zmniejsz temperaturę inkubacji do 20 stopni Celsjusza. W celu ekspresji amfifilowego ELP z nienaturalnym aminokwasem, należy zaszczepić główną kulturę ekspresyjną z nocnej hodowli wstępnej E. coli zawierającej odpowiednie plazmidy do OD 0,3. Inkubuj go w 400 mililitrach sterylnego podłoża LB uzupełnionego kanamycyną i chloramfenikolem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min.

Aby przygotować 100-milimolowy zapas nienaturalnych aminokwasów, dodaj 206,2 miligrama nienaturalnego aminokwasu do ośmiu mililitrów ultraczystej wody. Podnieś pH roztworu za pomocą trójmolowego wodorotlenku sodu i energicznie wymieszaj. Gdy nienaturalny aminokwas się rozpuści, obniż pH do około 10,5 i dodaj ultraczystą wodę do objętości 10 mililitrów.

Przefiltrować roztwór sterylnym filtrem 0,22 mikrometra i podzielić go na dwie mililitrowe probówki reakcyjne. Gdy kultura ekspresji osiągnie OD600 od 0,5 do 0,8, dodaj nienaturalny aminokwas do końcowego stężenia dwóch milimolów. Inkubuj go jeszcze przez 10 minut.

Następnie indukuj ekspresję białka docelowego i niezbędnej syntetazy tRNA poprzez jednoczesne dodanie IPTG i arabinozy. Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 stopni Celsjusza i pozostawić do odciągania przez około 20 godzin. Po inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4 000 razy g przez 40 minut.

Zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy z lizozymem i PMSF. Inkubować roztwór przez 30 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie zamroź i rozmroź go, zanurzając w ciekłym azocie.

Roztworu sonikować i usuwać lizat przez odwirowanie w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut. Następnie oczyść białko za pomocą chromatografii powinowactwa. Po elucji białka przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Dodaj jeden mikrolitr barwnika fluorescencyjnego do 500 mikrolitrów roztworu ELP i inkubuj reakcję przez około 10 godzin w temperaturze 15 stopni Celsjusza, wstrząsając w ThermoMixerze, upewniając się, że chronisz go przed światłem. Aby usunąć nadmiar barwnika fluorescencyjnego, należy przez 10 minut wyrównać membranę dializacyjną w ultraczystej wodzie. Przyciąć membranę do odpowiedniego rozmiaru, aby umieścić ją na górze otworu rurki reakcyjnej z klikniętym roztworem ELP.

Następnie przymocuj membranę do otworu, zamykając rurkę pokrywką, która nie ma rdzenia. Wypełnij przestrzeń między pokrywą a membraną buforem, aby zapobiec uwięzieniu powietrza. Następnie umieść probówkę reakcyjną w wybranym buforze, wsuń ją pod powierzchnię i odwróć do góry nogami.

Przeprowadzać dializy przez co najmniej trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, pozwalając na kontynuowanie dializy przez co najmniej trzy godziny po każdej zmianie buforu. W przypadku pęcznienia THF należy dializować jednorodny roztwór ELP z buforem fosforanowym lub Tris o stabilnym pH 7,5. Przygotuj liofilizator i ostudź go do temperatury początkowej do liofilizacji.

Podsycić dializowany roztwór białka w 1,5-mililitrowych probówkach reakcyjnych i uszczelnić nakrętkami z małym otworem, aby uniknąć utraty próbki stałej z powodu zmian ciśnienia w trakcie liofilizacji. Szokowe zamrożenie próbek w ciekłym azocie. Wyjmij zamrożone próbki białka z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w liofilizatorze, aby rozpocząć liofilizację.

Po całkowitym wyschnięciu próbki należy ją przewietrzyć suchym azotem i natychmiast zamknąć pokrywy probówek reakcyjnych, aby uniknąć kontaktu z wilgocią z powietrza. Dodaj czysty THF do liofilizowanych próbek i umieść roztwór w sonikatorze łaźni wodnej z lodowatą wodą na 15 minut. Podgrzej termocykler do 30 do 60 stopni Celsjusza w celu tworzenia pęcherzyków lub do 90 stopni Celsjusza w celu tworzenia włókien i przygotuj nowe probówki reakcyjne z ultraczystą wodą lub buforem.

Po sonikacji umieść roztwór ELP/THF i przygotowaną wodę lub bufor w termocyklerze na pięć minut. Następnie rozwarstwić roztwór ELP na wierzchu wody lub buforu, upewniając się, że widoczne jest oddzielenie dwóch faz i wyraźna interfaza, a następnie umieścić mieszaninę z powrotem w termocyklerze. Pozostawić próbkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przystąpić do dializy z użyciem wody lub buforu lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Przygotuj roztwór ELP o stężeniu od jednego do 50 mikromolów i dodaj od 10 do 20% 1-butanolu. Natychmiast wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół. Zmętnienie roztworu powinno wzrosnąć podczas mieszania, co wskazuje na tworzenie się pęcherzyków.

Aby uzyskać wąski rozkład wielkości, należy wytłaczać pęcherzyki za pomocą mini wytłaczarki przez membranę o wielkości porów jednego mikrometra. W celu kapsułkowania barwnika zmieszać około 40 mikrolitrów roztworu ELP w 10-milimolowym Tris-HCl z jednym mikrolitrem roztworu podstawowego Dextran Texas Red w DMSO. Dodaj 10 mikrolitrów 1-butanolu i wytłaczaj od pięciu do 10 razy przez strzykawkę wyposażoną w igłę o wymiarach 0,25 na 25 milimetrów.

Metoda pęcznienia THF składa się z trzech następujących po sobie etapów i prowadzi do różnych zespołów supramolekularnych ELP w zależności od temperatury. Obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej pokazują pęcherzyki złożone z BDP-R20F20 i struktury fibrylarne złożone z BDP-R40F20. Metoda ekstruzji 1-butanolu prowadzi wyłącznie do powstawania pęcherzyków ELP.

Około dwóch rzędów wielkości wytwarza się więcej pęcherzyków w porównaniu z metodą pęcznienia THF. BDP-R40F20 zmieszano z 10 do 15% butanolem, a pęcherzyki przygotowano przez ekstruzję mieszaniny. Z BDP-R40F20 złożono różne struktury supramolekularne za pomocą protokołu pęcznienia THF.

pH buforu i temperaturę procesu składania dostosowano tak, aby tworzyły koacerwaty, fibryle lub pęcherzyki. Drobne błędy w protokole montażu mogą prowadzić do powstawania agregatów. Dodatnio naładowany barwnik ATTO Rho 13 i polisacharyd dekstran czerwony 3000 zostały zamknięte w świetle pęcherzyków złożonych z F20R20-mEGFP metodą ekstruzji 1-butanolu.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazują pęcherzyki w kanale zielonym, ładunek w kanale czerwonym i udaną enkapsulację w powstałym połączonym kanale. Wykazano również separację faz i zachowanie fuzyjne amfifilów ELP po zmieszaniu pojedynczych bloków budulcowych PMBC w porównaniu ze złożonymi populacjami PMBC. Mieszanie przed złożeniem PMBC prowadzi do jednorodnego rozmieszczenia cząsteczek w zmontowanej błonie PMBC, podczas gdy mieszanie złożonych populacji pęcherzyków prowadzi do plam błonowych czerwonej lub zielonej fluorescencji, które są widoczne przez co najmniej 20 minut.

Podejmując się tej procedury, należy zwrócić uwagę na prawidłową kolejność kroków oraz na różnice między metodą pęcznienia THF a metodą wytłaczania butanolem. Zgodnie z tym protokołem, pęcherzyki ELP mogą być wykorzystywane jako transportery leków, jako platforma dla reakcji enzymatycznych, takich jak transkrypcja i translacja in vitro, lub do tworzenia syntetycznych komórek minimalnych.