Name: Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji regionów glejaka w celu analizy transkryptomicznej. Ta metoda zachowuje integralność RNA i morfologię tkanek, umożliwiając badanie heterogeniczności nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez National Institutes of Health, (NIH/NINDS) Granty: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 dla M.G.C.; (NIH/NINDS) Przyznaje R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; Oddział Neurochirurgii, Rogel Cancer Center na Uniwersytecie Michigan, ChadTough Foundation i Leah's Happy Hearts Foundation dla M.G.C. i P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 dla M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 dla Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), grant Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP), projekt F049768 dla A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, Nagroda Lekarza-Naukowca od Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), grant R01 EY022633 od NEI NIH (AK) oraz nieograniczony grant od RPB dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych. W badaniach wykorzystano Vision Research Core (P30 EY007003) oraz Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK jest wspierany przez Mrs. William Davidson Emerging Scholar Award przyznawaną przez Instytut Badań Medycznych im. A. Alfreda Taubmana.

<ol><li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li>
<li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li>
<li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li>
<li>Núñez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li>
<li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li>
<li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy artykułu deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.

Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw heterogeniczności i inwazji glejaka ma kluczowe znaczenie dla odkrycia nowych celów terapeutycznych13. W tym manuskrypcie opisujemy szczegółową i zoptymalizowaną metodę analizy krajobrazu molekularnego heterogeniczności i inwazji glejaka za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego (LMD), a następnie analizy transkryptomicznej.
Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LMD) może być stosowana do identyfikacji różnych obsz...

Glejaki są najbardziej agresywnymi nowotworami pierwotnymi ośrodkowego układu nerwowego. Są bardzo inwazyjne i niejednorodne1. Analiza komórkowych i molekularnych składników guza pozwoli na odkrycie nowych celów terapeutycznych.
Wśród różnych obecnie dostępnych metod, laserowe przechwytywanie mikrodysekcji (LMD) zamrożonej tkanki guza mózgu jest opłacalną, niezawodną techniką, która pozwala na izolację dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych populacji komórek z tkanek nowotworowych w celu zbadania ich profilu molekularnego2,3. LMD umożliwia analizę profili ekspresji genów mRNA wybranych pojedynczych komórek lub struktur wielokomórkowych4,5. LMD można wykorzystać do uzyskania dogłębnej wiedzy mechanistycznej na temat zdarzeń molekularnych, które mają miejsce podczas progresji guza. Poprawa przetwarzania tkanek nowotworowych jest niezbędna do uzyskania optymalnej rozdzielczości optycznej morfologii tkanek i jakości RNA6. Chociaż wiązanie paraformaldehydu jest najlepszą opcją do analizy morfologicznej, jakość RNA ulega pogorszeniu w tych warunkach, co skutkuje niską jakością RNA do analizy sekwencyjnej RNA. Użycie zamrożonych skrawków tkanek pozwala uniknąć tworzenia się kryształków lodu, które mogłyby rozbić błony komórkowe i spowodować w komórkach, i pozostaje najlepszą opcją do analizy RNA-Seq7.
Tutaj opisujemy zoptymalizowaną metodę utrwalania i barwienia sekcji do przetwarzania zamrożonych tkanek guza mózgu myszy na LMD. Aby zapobiec tworzeniu się kryształków lodu w tkance, perfuzjowaliśmy myszy roztworem 30% sacharozy. Roztwór ten zakłóca interakcje między polarnymi cząsteczkami wody i zapobiega tworzeniu się kryształków lodu, zachowując morfologię tkanek. Barwienie tkanek jest niezbędne do różnicowania i uzyskania określonej populacji komórek lub anatomicznie odrębnych obszarów w obrębie guza. Konieczne jest utrwalenie i zabarwienie tkanki nieszkodliwymi barwnikami, aby zachować integralność RNA. Wcześniej wykazano, że barwienie tkanek hematoksyliną/eozyną (H&E) pogarsza integralność RNA8. Utrwaliliśmy i wybarwiliśmy interesującą tkankę roztworami etanolu, fioletu krezylowego 4% i eozyny Y 0,5%. Fiołek krezylowy to barwnik kwasolubny, który barwi jądro komórkowe ciemnoniebieskim kolorem. Eozyna Y jest zasadochłonnym barwnikiem, który barwi podstawowe składniki komórek, zapewniając rozróżnienie między cytoplazmą a innymi strukturami komórkowymi8. Oba barwniki są rozpuszczalne w etanolu i nie pogarszają jakości RNA. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek i utrzymać wysoką rozdzielczość optyczną struktur komórkowych, zamontowaliśmy skrawki tkanek przed LMD9.

<table><tbody><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki</td><td>EGF Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100X)</td><td>Suplement Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Corning Probówki do PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6530</td><td></td></tr><tr><td>octan fioletu kresylowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle: Mieszanka składników odżywczych F-12</td><td>Gibco</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>N/A</td> System mikrodysekcji laserowej <td></td></tr><tr><td>(LMD)</td><td>Suplement Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normocin - Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Peel Away Jednorazowe formy do zatapiania</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko membranowe PEN (2 &micro; m)</td> <td>Lieca</td><td>1150518</td><td></td></tr><tr><td>Pinpoint Solution</td><td>Zymo Research</td><td>D3001-1</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-zasadowy</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat Badawczy</td><td>Leica</td><td>CM3050s</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input</td><td>Mammalian Takara Bio</td><td>634411</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T.</td><td>Compound Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Glejaki to pierwotne guzy mózgu charakteryzujące się inwazyjnością i różnorodnością. Specyficzne wzorce histologiczne, takie jak pseudopalisady, proliferacja mikronaczyniowa, transformacja mezenchymalna i martwica, charakteryzują niejednorodność histologiczną glejaków o wysokim stopniu złośliwości. Nasze laboratorium wykazało, że obecność dużych zagęszczeń komórek mezenchymalnych, zwanych onkostrumieniami, koreluje ze złośliwością nowotworu. Opracowaliśmy unikalne podejście, aby zrozumieć mechanizmy, które leżą u podstaw wzrostu i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy kompleksowy protokół, który wykorzystuje mikrodysekcję wychwytu laserowego (LMD) i sekwencjonowanie RNA do analizy zróżnicowanej ekspresji mRNA heterogennych struktur wielokomórkowych wewnątrz guza (tj. Obszarów mezenchymalnych lub obszarów inwazji guza). Metoda ta utrzymuje dobrą histologię tkanek i integralność RNA. Perfuzja, zamrażanie, osadzanie, cięcie i barwienie zostały zoptymalizowane w celu zachowania morfologii i uzyskania wysokiej jakości próbek do mikrodysekcji laserowej. Wyniki wskazują, że perfuzja myszy z glejakiem przy użyciu 30% sacharozy zapewnia dobrą morfologię i jakość RNA. Ponadto barwienie skrawków guza 4% fioletem krezylowym i 0,5% eozyną powoduje dobre barwienie jądrowe i komórkowe, przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA. Opisana metoda jest czuła i wysoce powtarzalna i może być wykorzystana do badania morfologii guza w różnych modelach nowotworów. Podsumowując, opisujemy kompletną metodę wykonywania LMD, która zachowuje morfologię i jakość RNA do sekwencjonowania w celu zbadania cech molekularnych heterogenicznych struktur wielokomórkowych w guzach litych.

W naszym laboratorium opracowano genetycznie zmodyfikowane modele mysie (GEMMs) z wykorzystaniem systemu transpozazy sleeping beauty (Rysunek 1A). System ten wprowadza specyficzne zmiany genetyczne do genomu komórek progenitorowych układu nerwowego u noworodków myszy. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe tworzą endogenne guzy glejaka. Sekwencje plazmidów użyte do generowania guzów to: (1) pT2C-LucPGK-SB100X dla ekspresji transpozonu Sleeping Beauty i lucyferazy, (2) pT2-NR...

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Protokół ten wykorzystuje mikrodysekcję laserową i sekwencjonowanie RNA do analizy różnicowej ekspresji mRNA niejednorodności wewnątrz guza, takiej jak obszary akumulacji komórek mezenchymalnych lub obszary inwazji guza. Metoda ta została zoptymalizowana w celu zachowania dobrej jakości histologii tkanek i integralności RNA, aby ułatwić pozyskiwanie wysokiej jakości próbek z mikrodysekcji laserowej. Ta metoda jest czuła i wysoce powtarzalna.Może być wykorzystany do badania morfologii i niejednorodności guza w różnych modelach nowotworów. Laserowa mikrodysekcja zamrożonej tkanki guza mózgu jest opłacalną i niezawodną techniką izolacji dyskretnych obszarów anatomicznych populacji komórek z tkanek nowotworowych w celu zbadania ich profili molekularnych. LMD może być wykorzystany do uzyskania dogłębnej wiedzy mechanistycznej na temat zdarzeń molekularnych, które mają miejsce podczas progresji nowotworu, i może ujawnić nowe cele terapeutyczne.Bioluminescencja obciążenia guzem myszy in vivo osiąga sygnał od jednego razy 10 do sześciu i od jednego razy 10 do 7 fotonów. Przepłukać natleniony roztwór tyrodowy przez układ krążenia myszy poddanej eutanazji z guzem, aż wątroba i płuca zostaną całkowicie oczyszczone z krwi. Kontynuuj perfuzję zwierzęcia z 30% roztworem sacharozy rozpuszczonym w roztworze tyrodowym przez dodatkowe 15 minut.Aby ocenić powodzenie perfuzji, upewnij się, że szyja, ogon i nogi są sztywne pod koniec krążenia. Następnie zbierz mózg zgodnie ze standardowymi protokołami i przechowuj go przez noc w świeżym 30% roztworze sacharozy. Aby przygotować się do krioprezerwacji, napełnij słoik zimnym izopentano-2-metylobutanem i umieść słoik w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem.Podczas schładzania rozpuszczalnika osusz mózg na kawałku bibuły filtracyjnej i umieść mózg w oznaczonym Cryomold. Ostrożnie przy około pięciu mililitrach optymalnej temperatury środka tnącego do środka Cryomold i umieść mózg w formie w żądanej orientacji. Za pomocą czystych kleszczy szybko umieść Cryomold w schłodzonym izopentano-2-metylobutanie na 30 do 40 sekund.Po zestaleniu się podłoża tnącego przenieś Cryomold na suchy lód i zawiń Cryomold w folię aluminiową, aby przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby uzyskać zamrożone skrawki tkanki guza mózgu, najpierw ustaw temperaturę kriostatu między minus 20 a minus 24 stopnie Celsjusza, a następnie umieść blok próbki w komorze kriostatu na 30 do 60 minut. Gdy próbka się równoważy, wyczyść komorę i uchwyt noża 100% etanolem i spryskaj szczotki sekcyjne roztworem czyszczącym RNaza.Gdy próbka jest gotowa, wyjmij formę i użyj świeżego medium tnącego, aby przymocować zamrożony blok tkanki do krążka próbki kriostatu. Umieść blok w uchwycie dysku i wyrównaj blok z ostrzem noża. Zdobądź 10 mikrometrowych skrawków mózgu za pomocą jednej ze szczotek bez rnazy, aby ostrożnie spłaszczyć i rozwinąć kawałki tkanki na powierzchni cięcia.Aby zamontować skrawki tkanki mózgowej na szkiełkach, płynnie dociśnij dodatnio naładowaną stronę oznakowanego szkiełka PEN bez RNaz do sekcji i umieść szkiełko w pudełku do przechowywania wewnątrz komory. Po zebraniu wszystkich szkiełek umieść schowek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpuścić medium tnące przed mikropreparacją laserową, zanurz szkiełka w 30-sekundowych sekwencyjnych zanurzeniach w etanolu w dół, a następnie barwiej roztworem fioletu krystalicznego przez 20 sekund i pięć sekund w 0,5% roztworze eozyny Y.Pod koniec inkubacji eozyny Y należy użyć bibuły filtracyjnej, aby zablokować szkiełka do sucha i odwodnić szkiełka w sekwencyjnym rosnącym zanurzeniu w etanolu. Po 60-sekundowym zanurzeniu w etanolu płucz szkiełka w pojemniku z ksylenem przez trzy minuty. Następnie wysuszyć szkiełka na powierzchni wolnej od RNaz w temperaturze pokojowej przez 10 sekund przed zamontowaniem próbek w podłożu montażowym przygotowanym z wodą wolną od RNaz.Po 10 do 20 sekundach przenieś szkiełka na platformę mikroskopową do mikroskopu. W przypadku mikrodysekcji wychwytywania laserowego włącz zasilanie przed włączeniem lasera. Następnie włącz kontroler mikroskopu w komputerze i uruchom oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej.W panelu sterowania mikroskopu wybierz 10-krotne powiększenie. W obszarze Sterowanie laserem ustaw parametry lasera do rozwarstwiania tkanek i wybierz częstotliwość lasera 120 Hz oraz prąd lasera 100%Aby uzyskać dokładną mikrodysekcję laserową, ustaw prędkość na 10 i ustaw aperturę na 10 mikrometrów. Następnie ustaw moc na 53.Załaduj kolektor tkanek, który przechwyci tkankę zgodnie z sekcją i kliknij drugi przycisk Rozładuj. Zastąp pusty kolektor probówkami z płaską głowicą PCR o pojemności 0,5 mililitra bez DNazy i Rnazy, zawierającymi 30 mikrolitrów buforu do lizy na probówkę. Zwróć kolektor do urządzenia i kliknij przycisk Kontynuuj, aby kontynuować.Załaduj przetworzoną próbkę do mikroskopu i kliknij przycisk Unload (Rozładź) w oprogramowaniu do mikrodysekcji laserowej. Umieść próbkę na uchwycie szkiełka i umieść uchwyt szkiełka na stoliku. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby kontynuować i wybierz opcję Rysuj wytnij w oknie Wytnij kształty.Użyj elementów sterujących mikroskopu, aby znaleźć obszar zainteresowania i narysować kontur wokół obszaru zainteresowania. Następnie wybierz docelową rurkę kolektora i kliknij przycisk Start Cut, aby kontynuować mikrodysekcję tkanek. Po wypreparowaniu wszystkich obszarów zainteresowania przenieś rurki kolektora z uchwytu na suchy lód, aż zostaną poddane dalszej obróbce.Aby uzyskać tkanki o lepszej morfologii i integralności RNA, oceniono różne podejścia do perfuzji. Aby przeanalizować obszary zainteresowania, konieczne jest wybarwienie tkanek nieszkodliwymi barwnikami dla RNA. Późniejsza perfuzja myszy z nowotworem roztworem tyrodowym i 30% sacharozą, a następnie nocna inkubacja w 30% sacharozie powoduje zachowanie morfologii i integralności RNA tkanki myszy.Chociaż wiązanie tkanek paraformaldehydu skutkuje wysokiej jakości morfologią tkanki, ma to negatywny wpływ na integralność RNA. Inne podejścia, takie jak inkubacja roztworu tyrodowego lub inkubacja roztworu tyrodowego i 30% roztworu sacharozy, nie wpływają na jakość RNA, ale obserwuje się zmniejszoną rozdzielczość morfologii tkanki. Jeśli tkanki nie są połączone z podłożem montażowym, skrawki ulegają odwodnieniu, a morfologia pogarsza się, podczas gdy mocowanie próbek tkanek za pomocą 15% pożywki montażowej rozpuszczonej w wodzie utrzymuje wysoką jakość morfologii tkanek.Obrazowanie mikroskopowe mikrodyparkcyjne z przechwytywaniem laserowym umożliwia wybór tkanki nowotworowej do wycięcia. Ten wybór obszaru zainteresowania umożliwia następnie preparację obszarów zainteresowania w każdej próbce tkanki w celu analizy integralności RNA. Utrzymanie wysokiej jakości morfologii tkanki nowotworowej i integralności RNA ma kluczowe znaczenie.Roztwór tyrodu i 30% perfuzja sacharozy z nocnym przechowywaniem w 30% sacharozie znacznie poprawia morfologię tkanek dla LMD. Szybkie utrwalanie, barwienie i montaż lyoma za pomocą roztworu GAN jest kluczowym krokiem do zachowania jakości RNA i zapobiegania tworzeniu się pęknięć w tkance. Zalecamy cięcie co najmniej 2,5 razy 10 do 6 mikrometrów kwadratowych całkowitego guza na obszar tkanki, aby uzyskać odpowiednie ilości RNA zarówno do kontroli jakości RNA, jak i analizy transkryptomicznej.LMD umożliwia analizę molekularnych szlaków sygnałowych, które regulują heterogeniczność i inwazję glejaka, co może ujawnić nowe potencjalne cele dla przyszłego rozwoju translacyjnego w przedklinicznych modelach glejaka.

laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Źródło: Parker, J. J., et al. Organtypowy model hodowli plastrów glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia obrazowanie wycinków tkanki glejaka wykazujących ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w stałych odstępach czasu w celu śledzenia ruchu i kierunku komórek nowotworowych.

Obrazowanie migracji komórek nowotworowych w tkance glejaka za pomocą poklatkowej skaningowej mikroskopii konfokalnej

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Poznaj mikrodysekcję laserową do izolacji regionów glejaka w celu analizy transkryptomicznej. Ta metoda zachowuje integralność RNA i morfologię tkanek, umożliwiając badanie heterogeniczności nowotworowej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji (Wideo) | JoVE Journal

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Przeglądaj więcej filmów