Dlaczego perfuzja roztworem Tyrode'a i 30% sacharozą ma znaczenie dla LMD?

Perfuzja roztworem Tyrode'a, a następnie 30% sacharozą, pozwala zachować morfologię tkanki i integralność RNA, co jest kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości próbek do mikrodissekcji laserowej, odpowiednich do późniejszego sekwencjonowania RNA. Takie podejście zapobiega degradacji RNA, zachowując jednocześnie strukturę komórkową w celu dokładnego wyboru obszaru zainteresowania.

W jaki sposób barwienie fioletem krezylowym i eozyną wspiera procesy LMD?

Barwienie przekrojów guza 4% fioletem krezylowym i 0,5% eozyną zapewnia wyraźną wizualizację jąder komórkowych i komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA, co umożliwia precyzyjną identyfikację heterogenicznych podregionów, takich jak oncostreams i obszary inwazji. Ta metoda barwienia pozwala uniknąć uszkodzeń RNA związanych z utrwalaniem w formaldehydzie, zachowując przy tym wystarczający kontrast niezbędny do mikrodysekcji.

Jakie pomiary ilościowe umożliwia sekwencjonowanie RNA z wykorzystaniem LCD?

Mikrosekcyjna analiza laserowa (LCM) w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA umożliwia analizę różnicowej ekspresji mRNA pomiędzy podregionami guza, takimi jak obszary bogate w mezenchymę i fronty inwazyjne. Te pomiary ilościowe wspierają porównania na poziomie szlaków sygnałowych oraz priorytetyzację celów w oparciu o sygnatury molekularne powiązane ze złośliwością nowotworu.

Dlaczego wymagania dotyczące powtarzalności są ważne dla LMD w walidacji celu?

Wymagania dotyczące replikacji zapewniają powtarzalność pobierania próbek tkanek i profilowania molekularnego w różnych próbkach, co jest niezbędne dla współpracy międzyfunkcyjnej zespołów histologii, biologii molekularnej i farmakologii. Spójne wyniki LMD ograniczają zmienność danych walidacji celu i zwiększają pewność co do wyników przedklinicznych.

Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem LMD w procesach badawczych (discovery pipelines)?

Implementacja wymaga ram statystycznych umożliwiających porównywanie różnicowej ekspresji genów pomiędzy mikrodysekcyjnymi obszarami guza, w tym narzędzi do identyfikacji istotnie zmienionych szlaków oraz kontroli wielokrotnych porównań. Możliwości te umożliwiają wybór celu w oparciu o dane oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego na podstawie profili transkrypcyjnych uzyskanych metodą LMD.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

6.8K wyświetleń

Cytowany 9 razy

09:09 min

12 kwietnia 2020

10.3791/60939-v

12 kwietnia 2020

6.8K wyświetleń

Andrea Comba¹^,²^,⁴ , Patrick J. Dunn¹^,²^,⁴ , Phillip E. Kish¹^,³ , Padma Kadiyala¹^,²^,⁴ , Alon Kahana³ , Maria G. Castro¹^,²^,⁴ , Pedro R. Lowenstein¹^,²^,⁴

¹Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, ²Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, ³Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.