Name: Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj identyfikację terenową Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ta metoda molekularna umożliwia szybką diagnostykę gatunków roślinnych w warunkach polowych, zapewniając kontrolę jakości surowców zielarskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Jamesowi Shanowi za jego wysiłki w nagrywaniu filmów terenowych. Dziękujemy Jonowi Byronowi i Matthew Semerau za ich pracę przy montażu wideo. Dziękujemy Ansenowi Luo, Harry'emu Du i Frankowi Dengowi za ich wsparcie w zlokalizowaniu pola testowego. Dziękujemy Marii Rubinsky za cenne uwagi do całego rękopisu. Wszystkie wyróżnione osoby są pracownikami Herbalife International of America, Inc.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Ustaw obszar testowy w terenie z płaską i poziomą powierzchnią.</li>
	<li>Zidentyfikuj reprezentatywną roślinę, która odzwierciedla cechy większości roślin na polu kwiatów rumianku (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Zbierz główkę kwiatu z reprezentatywnej rośliny za pomocą sterylnych rękawiczek.</li>
	<li>Umieścić próbkę w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1,3 do 1,4 i zbierz ulotkę (o długości około 0,5–0,7 cm) z tej samej rośliny. 
	UWAGA: Kwiat i liść M. chamomilla są na tyle małe, że mieszczą się na dnie probówki zbiorczej o pojemności 2,0 ml. W przypadku innych roślin o większej powierzchni można użyć dziurkacza lub nożyczek (przed użyciem wypłukanych w 70% etanolu) do wyizolowania próbek tkanek do testów. Gdy wymagane jest wielokrotne pobieranie próbek, należy opłukać dziurkacz lub nożyczki między kolejnymi czynnościami związanymi z różnymi próbkami.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Rozgrzej inkubator w suchej kąpieli do temperatury 95 °C.</li>
	<li>Do każdej probówki zbiorczej dodać 100 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do ekstrakcji DNA roślin (wymienionego w tabeli materiałów). Aby uzyskać lepszą wydajność ekstrakcji DNA, zmiel próbkę tkanki w roztworze ekstrakcyjnym za pomocą tłuczka do tkanek.</li>
	<li>Zamknij rurkę. Upewnij się, że tkanka botaniczna jest pokryta roztworem ekstrakcyjnym przez cały proces ekstrakcji.</li>
	<li>Umieścić probówki zbiorcze w nagrzanym inkubatorze w suchej kąpieli i inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Po 10 minutach wyjmij probówki z inkubatora do suchej kąpieli.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu rozcieńczającego z tego samego zestawu do ekstrakcji DNA i wymieszać roztwór, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.</li>
	<li>Powtórz ten sam krok w przypadku ekstrakcji ulotki.</li>
	<li>Wstrząśnij, aby jeszcze bardziej wymieszać roztwór. Tkanka roślinna zwykle nie wydaje się być zdegradowana po tym zabiegu. Kolor cieczy może ulec zmianie i stać się mętny. 
	UWAGA: Rozcieńczony roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, jeśli nie nastąpi to natychmiast. Nie jest konieczne usuwanie resztek komórkowych z tkanki roślinnej przed przechowywaniem. Ciecz w probówkach zawiera matryce DNA do dalszej amplifikacji PCR.</li>
</ol>
3. Konfiguracja reakcji PCR
<ol>
	<li>Skonfiguruj warunki termocyklingu instrumentu qPCR zgodnie ze specyfikacją producenta. Zastosować profil termocyklingu PCR wymieniony w (Tabela 1), który rozpoczyna się od stałego kroku temperatury dla początkowej denaturacji, po którym następuje 25 cykli amplifikacji, a kończy się wzrostem temperatury w celu uzyskania krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Przed użyciem rozmrozić qPCR Master Mix i startery (Tabela 2) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zaplanuj reakcję, która zostanie załadowana do każdej studzienki: studzienki zawierające kontrolę pozytywną z gatunkami docelowymi, kontrolę pozytywną z gatunkami niedocelowymi, próbki i kontrolę ujemną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5).
	<ol>
		<li>W tym przykładzie użyto dziesięciu studzienek – pięciu do niemieckiego testu identyfikacyjnego rumianku, a pozostałe pięć do testu identyfikacji rumianku rzymskiego. W przypadku każdego rodzaju badania identyfikacji gatunku jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków docelowych, jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków niedocelowych, dwie studzienki wypełnia się próbkami DNA kwiatów i liści pobranymi z pola, a jedna studzienka jest przeznaczona do kontroli ujemnej. Tabela 3 opisuje każdy typ studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wzorcową mieszankę reakcji zgodnie z instrukcją dla każdego badania identyfikacji gatunku botanicznego. Typowa mieszanka wzorcowa reakcji zawiera uniwersalną mieszankę mistrzowską qPCR (2x), startery specyficzne dla gatunku do przodu i do tyłu oraz wodę wolną od nukleaz. W tabeli 4 przedstawiono skład układu reakcyjnego. 
	UWAGA: Jeśli nie zużyć od razu, przechowuj główną mieszankę reakcji qPCR w temperaturze od +2 °C do +8 °C w chłodziarce lub minilodówce.</li>
	<li>Przed użyciem dokładnie wymieszać mieszankę wzorcową reakcji, pipetując.</li>
	<li>Umieść wkład qPCR stroną zadrukowaną do góry na płaskiej i stabilnej powierzchni.</li>
	<li>Załadować 18 μl wzorcowej mieszanki reakcyjnej skonfigurowanej w kroku 3.4 do studzienek z wkładami zgodnie z dołkami zdefiniowanymi w kroku 3.3. W tej demonstracji dodaj niemiecką mieszankę wzorcową reakcji testu identyfikacji rumianku do studzienek oznaczonych do testu GC (GCT w dołkach 1, 3, 5, 7, 9) i mieszankę wzorcową testu identyfikacji rumianku rzymskiego do studzienek oznaczonych do testu RC (RCT w studzienkach 2, 4, 6, 8, 10) (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Przenieść 2 μl próbki DNA z supernatantu probówek do ekstrakcji DNA i wstępnie wyekstrahowanych dodatnich kontroli DNA do studzienek z wkładami wstępnie załadowanymi mieszanką wzorcową qPCR. Po dodaniu każdej matrycy DNA do głównej mieszanki qPCR, delikatnie wymieszać roztwór, pipetując. 
	UWAGA: Unikaj unoszących się na wodzie resztek komórkowych podczas przenoszenia DNA z probówki do ekstrakcji DNA. W razie potrzeby użyj miniwirówki, aby oddzielić supernatant i resztki komórkowe.</li>
	<li>Ostrożnie uszczelnij wkład folią samoprzylepną. Załaduj wkład do komory termocyklingowej i zamknij ją.</li>
	<li>Ustaw urządzenie qPCR tak, aby działało.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbal+supplement+sales+in+US+increase+by+9.4%25+in+2018%5BTitle%5D)+AND+%22HerbalGram%22%5BJournal%5D)">Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018.</a> HerbalGram. 123, 62-73 (2019).</li>
<li>Israelsen, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+regulation%2C+globalization+and+climate+change+on+botanicals+and+traditional+medicines%3A+respecting+tradition+while+embracing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change.</a> Planta Medica. 74 (3), 36(2008).</li>
<li>Cardellina, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+confronting+the+botanical+dietary+supplement+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry.</a> Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).</li>
<li>Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+peripatetic+maze+of+black+cohosh+adulteration%3A+a+review+of+the+nomenclature%2C+distribution%2C+chemistry%2C+market+status%2C+analytical+methods+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22HerbalGram%22%5BJournal%5D)">Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety.</a> HerbalGram. 98, 32-51 (2013).</li>
<li>Vanherweghem, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misuse+of+herbal+remedies%3A+The+case+of+an+outbreak+of+terminal+renal+failure+in+Belgium+%28Chinese+herbs+nephropathy%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Alternative+and+Complementary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy).</a> The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).</li>
<li>Vanherweghem, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+progressive+interstitial+renal+fibrosis+in+young+women%3A+association+with+slimming+regimen+including+Chinese+herbs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs.</a> The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).</li>
<li>Khan, I. A., Smillie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+a+%22quality+by+design%22+approach+to+assure+the+safety+and+integrity+of+botanical+dietary+supplements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements.</a> Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).</li>
<li>Applequist, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aApplequist%2C+W+%22The+Identification+of+Medicinal+Plants%3A+A+Handbook+of+the+Morphology+of+Botanicals+in+Commerce%22">The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce</a>. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).</li>
<li>Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUpton%2C+R+%22American+Herbal+Pharmacopoeia%3A+Botanical+Pharmacognosy+-+Microscopic+Characterization+of+Botanical+Medicines%22">American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines</a>. , CRC Press. (2016).</li>
<li>Frommenwiler, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+HPTLC+fingerprinting+for+quality+control+of+an+herbal+drug+-+the+case+of+angelica+gigas+root%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).</li>
<li>Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-based+metabolomics+as+a+quality+control+tool+for+herbal+products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products.</a> South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).</li>
<li>Lazarowych, N. J., Pekos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fingerprinting+and+marker+compounds+for+identification+and+standardization+of+botanical+drugs%3A+strategies+for+applying+pharmaceutical+HPLC+analysis+to+herbal+products%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Information+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products.</a> Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).</li>
<li>Tankeu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+and+support+vector+machine%3A+a+powerful+combination+to+differentiate+black+cohosh+%28actaea+racemosa%29+from+other+cohosh+species%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species.</a> Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).</li>
<li>Rodman, J. E., Cody, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taxonomic+impediment+overcome%3A+NSF%27s+Partnerships+for+Enhancing+Expertise+in+Taxonomy+%28PEET%29+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Biology%22%5BJournal%5D)">The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model.</a> Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renaissance+in+herbal+medicine+identification%3A+from+morphology+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+DNA+barcoding%3A+from+gene+to+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Plant DNA barcoding: from gene to genome.</a> Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).</li>
<li>Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNA-based+methods+for+tracing+the+botanical+origin+of+food+products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products.</a> Food Research International. 60, 163-172 (2014).</li>
<li>Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+botanical+renaissance%3A+state-of-the-art+DNA+bar+coding+facilitates+an+automated+identification+technology+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Applications+in+Technology%22%5BJournal%5D)">A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants.</a> International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).</li>
<li>Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+for+the+identification+of+botanicals+in+herbal+medicine+and+dietary+supplements%3A+strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations.</a> Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).</li>
<li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pocket-sized+convective+PCR+thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A pocket-sized convective PCR thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).</li>
<li>Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+nucleic+acid+thermocyclers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Portable nucleic acid thermocyclers.</a> Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).</li>
<li>Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-level+resolution+of+16S+rRNA+gene+amplicons+sequenced+through+the+MinION+portable+nanopore+sequencer%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer.</a> Gigascience. 5 (1), 4(2016).</li>
<li>Emanuel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Francisella+tularensis+within+infected+mouse+tissues+by+using+a+hand-held+PCR+thermocycler%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).</li>
<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228(2016).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-laboratory+validation+of+a+two-tiered+DNA+barcoding+method+for+raw+botanical+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification.</a> Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).</li>
<li>Sgamma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+for+industrial+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding for industrial quality assurance.</a> Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).</li>
<li>Wallinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+plant+identification+using+species-and+group-specific+primers+targeting+chloroplast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA.</a> PLoS One. 7 (1), 29473(2012).</li>
<li>Newmaster, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+validation+of+real-time+PCR+methods+for+molecular+diagnostic+identification+of+botanicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals.</a> Journal of AOAC International. , (2019).</li>
<li>Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamomile+%28Matricaria+chamomilla+L.%29%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacognosy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview.</a> Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82(2011).</li>
<li>Mills, S. Y., Bone, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Essential+Guide+to+Herbal+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Essential Guide to Herbal Safety.</a> Elsevier Health Sciences. , 325(2004).</li>
<li>Avula, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+phenolic+compounds+by+UHPLC-UV-MS+and+use+of+partial+least-square+discriminant+analysis+to+differentiate+chemo-types+of+Chamomile%2FChrysanthemum+flower+heads%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).</li>
<li>Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+HPTLC+method+for+apigenin+7-O-glucoside+in+chamomile+flowers+and+its+application+for+fingerprint+discrimination+of+chamomile-like+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3Plus%2C+an+enhanced+web+interface+to+Primer3%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3.</a> Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).</li>
<li>Bustin, S., Huggett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+primer+design+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">qPCR primer design revisited.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).</li>
<li>Brownie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+primer-dimer+accumulation+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).</li>
<li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uMELT%3A+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).</li>
<li>Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+behind+plant+DNA+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Analysis+Tools+-+Methods+for+Bio-Molecules+Studies%22%5BJournal%5D)">The chemistry behind plant DNA isolation protocols.</a> Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).</li>
<li>Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+leaf+age+on+methylxanthines%2C+total+phenolic+content%2C+and+free+radical+scavenging+capacity+of+Ilex+paraguariensis+aqueous+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Farmacognosia%22%5BJournal%5D)">The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts.</a> Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+targeted+PCR+method+for+raw+and+processed+botanical+material+identification%3A+an+example+using+matricaria+chamomilla+%28chamomile%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile).</a> Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).</li>
</ol>

Zaświadczamy, że Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu są pracownikami Herbalife International of America, Inc. Zaświadczamy, że Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce i Lorenzo Colombo są pracownikami firmy Hyris Ltd., która produkuje przenośny przyrząd qPCR używany w tym artykule.

Projektowanie starterów i wybór matryc są kluczowymi krokami w uzyskaniu wydajnej i specyficznej amplifikacji qPCR. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego szablonu, zwykle stosuje się oprogramowanie do projektowania podkładów, aby pomóc w doborze podkładów na podstawie zmiennych projektowych, takich jak długość podkładu, temperatura topnienia i zawartość GC33,34. Optymalizację i walidację można przeprowadzić w oczekiwanych warunkach eksperymentalnych testu, aby zapewnić swoistość, czułość i solidność reakcji PCR35. Nieoptymalna konstrukcja startera może prowadzić do tworzenia się starter-dimer, w którym interakcje starterów wytwarzają produkty niespecyficzne36.
Kontrola bez matrycy (NTC) zastosowana w tym badaniu sprawdza zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i obecność dimerów starterów, które mogą wpływać na test. Wyniki nie wykazały amplifikacji, co jest dobrą wskazówką, że zarówno zanieczyszczenie DNA, jak i dimery starterów nie stanowią problemu. Zanieczyszczenie DNA i dimery starterów objawiają się w krzywych topnienia bez kontroli matrycowych oraz jako dodatkowe piki w krzywych topnienia kontroli pozytywnych. Zazwyczaj oczekuje się, że krzywa topnienia kontroli dodatniej będzie zawierać pojedynczy pik, chyba że poddomeny bogate w AT w matrycy powodują nierównomierne topnienie. Podwójne piki można przewidzieć, symulując testy topnienia za pomocą oprogramowania uMELT37. W tym badaniu zastosowano złoty standard uruchamiania produktu PCR na żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność docelowego produktu PCR oraz brak zanieczyszczeń i dimerów starterów.
Sporym wyzwaniem w analizie molekularnej materiału botanicznego jest uzyskanie dobrej jakości DNA w wyniku procesu ekstrakcji DNA botanicznego. Materiały botaniczne są sprzedawane i spożywane ze względu na aktywne związki chemiczne, które są związane z korzyściami zdrowotnymi. W procesie ekstrakcji DNA te związki chemiczne będą również uwalniane do roztworu do ekstrakcji DNA, potencjalnie powodując zahamowanie PCR, powodując w ten sposób niepowodzenia amplifikacji PCR. Opracowano różne zestawy do oczyszczania DNA roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i kolumn w celu usunięcia związków chemicznych pochodzących z roślin38. Jednak dygestorium i wirówka szybkoobrotowa wymagane do obsługi tych zestawów nie są dostępne w terenie.
W obecnym protokole uproszczona metoda ekstrakcji DNA wykorzystuje komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA roślin (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Miał zdolność neutralizowania powszechnych substancji hamujących w celu uzyskania powtarzalnych wyników i dawał spójne wyniki dla M. chamomilla i C. nobile. Zarówno główki i liście kwiatowe M. chamomilla , jak i C. nobile dawały amplikony PCR o określonych pikach topnienia, co wskazuje, że obecność inhibitorów PCR nie stanowiła problemu. W przypadku innych roślin z wyższymi poziomami inhibitorów PCR amplifikacja DNA w ich pierwotnej ekstrakcji może być mniej wydajna. Aby zmniejszyć inhibicję i poprawić wydajność amplifikacji, mając dostęp do całej rośliny, do celów identyfikacji można również wykorzystać inne części rośliny o niższej zawartości polisacharydów i polifenoli. Jeśli dostęp do różnych części rośliny jest ograniczony, młodsze liście lub płatki wycięte z główek kwiatowych, które zazwyczaj mają niższą zawartość fenolu39, mogą mieć większe szanse na sukces. Ponieważ sekwencje DNA są spójne w całej roślinie, każda część rośliny może być wykorzystana do potwierdzenia tożsamości gatunku. Jeśli amplifikacja PCR jest nadal nieoptymalna, oryginalny ekstrakt DNA można dodatkowo rozcieńczyć przed PCR lub zastosować bardziej wyrafinowane protokoły oczyszczania laboratoryjnego.
Kolejnym wyzwaniem dla analizy PCR są fałszywie dodatnie wyniki spowodowane zanieczyszczeniem DNA, które może negatywnie wpłynąć na interpretację danych. Zazwyczaj jest on kontrolowany przez aktywne sprzątanie, korzystanie z dedykowanego sprzętu i ograniczanie pracy do wyznaczonych obszarów. Za pomocą qPCR wszystkie analizy PCR można przeprowadzić w zamkniętym systemie, co znacznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonem PCR w środowisku, które nie jest dobrze kontrolowane. Poza tym środowiskowe DNA nie powinno również wykazywać fałszywie dodatniego wyniku ze względu na specyficzność testu, zgodnie z poprzednim badaniem walidacyjnym40.
Jest miejsce na poprawę. W przedstawionym tutaj protokole zastosowano barwnik interkalacyjny, aby pokazać amplifikację fragmentu docelowego w czasie rzeczywistym. Specyfikę metody potwierdza ponadto charakterystyczna temperatura topnienia, która jest odmienna między amplikonami M. chamomilla i C. nobile . Dlatego interkalacyjny PCR na bazie barwnika może skutecznie odpowiedzieć na pytanie "Co to za gatunek rośliny?" w terenie. Jednak oprócz konieczności przeprowadzenia identyfikacji botanicznej na pojedynczej roślinie odizolowanej z pola, w wielu przypadkach proszki lub ekstrakty roślinne w magazynie również skorzystają z szybkiej oceny tożsamości na miejscu. W przypadku tego typu materiałów może być konieczne udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak: "Co znajduje się w tym materiale?", "Czy zawiera gatunki botaniczne, których szukam?", "Czy zawiera domieszki, których chcę uniknąć?" i "Czy jest całkowicie lub częściowo zastąpiony innymi gatunkami botanicznymi, które są szkodliwe?". Zamiast stosowania barwnika interkalacyjnego, można zaprojektować różne sondy qPCR do celowania w amplikony z różnych składników botanicznych w jednym systemie reakcyjnym, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej specyficzności i wydajności testu. Opracowanie qPCR opartego na sondzie i wykorzystanie przenośnego systemu qPCR, który oferuje detekcję wielokanałową, może jeszcze bardziej rozszerzyć zastosowanie testów terenowych jako testu dopasowanego do celu na szersze środowisko, takie jak magazyny materiałów botanicznych i centra dystrybucji, aby odpowiedzieć na bardziej skomplikowane pytania. Ponadto użycie wielu sond pozwala również użytkownikowi na włączenie wewnętrznej amplifikacji do każdego układu reakcyjnego, dzięki czemu więcej informacji będzie dostępnych w przypadku podejrzenia zahamowania PCR.
Przedstawiony tutaj protokół ma następujące zalety w porównaniu z istniejącymi technologiami wykorzystywanymi w tym samym celu. Po pierwsze, w przypadku tradycyjnych metod identyfikacji morfologicznej i chemicznej, procedura i jej wyniki muszą zostać przeprowadzone i zinterpretowane przez ekspertów. Testy identyfikacyjne oparte na qPCR mogą być przeprowadzane przez osoby z podstawowym wykształceniem z zakresu biologii molekularnej i interpretowane w bardziej ustandaryzowany sposób. Po drugie, w porównaniu z identyfikacją i różnicowaniem gatunków opartym na qPCR, zwykle przeprowadzanym w laboratorium, protokół identyfikacji terenowej przy użyciu przenośnego przyrządu nie wymaga instrumentów o dużej powierzchni, takich jak wirówka o dużej prędkości, sprzęt do oceny jakości DNA, termocykler z detektorem fluorescencji oraz komputer ze specjalnym oprogramowaniem. W ten sposób identyfikacja gatunków na podstawie DNA może być przeprowadzona w dowolnym miejscu bez opóźnień. Po trzecie, poszukiwanie materiałów botanicznych jest zadaniem, które wymaga globalnej operacji. Dzięki postępom w usługach w chmurze i sztucznej inteligencji urządzenie przenośne może potencjalnie otrzymywać metody opracowane i zatwierdzone przez ekspertów w laboratorium, być obsługiwane przez osoby niebędące ekspertami w odległych obszarach i uzyskiwać obiektywne certyfikaty od stron trzecich. Dlatego ta opcja jest bardziej atrakcyjna niż kiedykolwiek, a praca zdalna staje się trendem.
Podsumowując, w niniejszym protokole zademonstrowano identyfikację terenową M. chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Pomyślne zastosowanie tej techniki pozwoli uzyskać bardzo dokładne wyniki identyfikacji botanicznej i pomoże producentom i dostawcom botanicznym kwalifikować materiały botaniczne w sposób terminowy i opłacalny.

Praktyka używania roślin do utrzymania i poprawy zdrowia sięga tysięcy lat. Ze względu na napięcia w łańcuchu dostaw spowodowane zwiększonym popytem konsumenckim1, niezrównoważonymi praktykami pozyskiwania plonów i zmianami klimatycznymi2, zafałszowania botaniczne stają się coraz większym problemem w branży żywności i suplementów diety3. Obecność niezgłoszonych lub błędnie zidentyfikowanych gatunków botanicznych może prowadzić do zmniejszenia skuteczności, a nawet problemów z bezpieczeństwem. Na przykład pluskwica groniasta (Actaea racemosa), stosowana w leczeniu dyskomfortu przedmiesiączkowego, może być zastąpiona tanim gatunkiem azjatyckim z ograniczonym wsparciem klinicznym dla jego skuteczności4. W poważniejszym przypadku zastąpienie Stephania terandra preparatem Aristolochia fangchi w badaniu klinicznym dotyczącym utraty wagi przy użyciu chińskich ziół doprowadziło do ciężkiej nefrotoksyczności i niewydolności nerek u niektórych uczestników5,6. Te dwa różne gatunki miały wspólną chińską nazwę "Fang Ji". Przypadki te podkreślają potrzebę bardziej rygorystycznej kontroli jakości, począwszy od identyfikacji surowców7, najlepiej jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw, aby można było efektywnie alokować zasoby do materiału o prawidłowej tożsamości.
Do identyfikacji botanicznej można użyć wielu ortogonalnych podejść. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna jest przeprowadzana poprzez ocenę morfologiczną8,9 i chemiczne metody analityczne10,11,12,13. Identyfikacja morfologiczna opiera się na różnicach w makroskopowych i mikroskopowych cechach materiałów roślinnych, jeśli istnieją różnice (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Jednak brak programów szkoleniowych z zakresu botaniki klasycznej w ostatnich latach spowodował niedobór ekspertów14, co czyni to podejście niepraktycznym w rutynowej kontroli jakości. Jego zastosowanie w sproszkowanych materiałach botanicznych jest również ograniczone. Chemiczne metody analityczne są szeroko stosowane w farmakopeach i laboratoriach, ale nie są idealne do badań terenowych ze względu na rozmiar przyrządów, takich jak wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) oraz wymagania środowiskowe. Ostatnio metody genomiczne pojawiły się jako alternatywna technika uwierzytelniania i wykrywania substytucji gatunków botanicznych, które okazały się skuteczne i precyzyjne. Metody genomiczne wykorzystują wysoką wierność i swoistość informacji genetycznej w materiałach roślinnych15,16,17,18,19. Molekularne narzędzia diagnostyczne są dostępne w postaci urządzeń przenośnych i często obejmują zautomatyzowane narzędzia do interpretacji danych, które obniżają barierę w korzystaniu z technologii, dzięki czemu podejście to jest idealne do identyfikacji w terenie20,21,22,23,24. Po zaprojektowaniu i walidacji metody analizy molekularnej25,26,27, może być ona wykonywana przez dowolny personel z podstawowym przeszkoleniem z zakresu biologii molekularnej. Spośród różnych dostępnych narzędzi przenośnych, PCR w czasie rzeczywistym na sekwencjach DNA jest jednym z opłacalnych wyborów28. Połączenie przenośnego urządzenia z dostosowaną i zwalidowaną analizą molekularną umożliwia weryfikację gatunków botanicznych i składników poza laboratorium, np. w gospodarstwach rolnych i magazynach materiałów botanicznych, redukując czas i koszty związane z tradycyjnymi metodami.
Celem tego protokołu jest wprowadzenie metody identyfikacji botanicznej w sytuacjach, gdy dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony lub niedostępny, przy użyciu przenośnego systemu qPCR. Metoda została zademonstrowana na polu Matricaria chamomilla (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A), powszechnie znana jako rumianek niemiecki, szeroko stosowana ze względu na swoje właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające29. Można go pomylić z pokrewnymi gatunkami o podobnym wyglądzie lub zapachu, zwłaszcza z rodzajów Chamaemelum, Tanacetum i Chrysanthemum30,31,32. Wśród spokrewnionych gatunków, Chamaemelum nobile, znany również jako rumianek rzymski, jest zauważalny z porównywalnymi poziomami produkcji w handlu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Zaprezentowana metoda została opracowana nie tylko w celu identyfikacji docelowego gatunku botanicznego M. chamomilla, ale także wykrycia jego bliskiego krewnego, C. nobile, w oparciu o specyficzną amplifikację sekwencji DNA.
Ten artykuł wyjaśnia szczegółowo, jak przeprowadzić terenową identyfikację botaniczną M. chamomilla za pomocą interkalacyjnego qPCR opartego na barwniku i analizy krzywej topnienia na urządzeniu przenośnym. Protokół obejmuje pobranie próbek botanicznych z terenu, ekstrakcję DNA na miejscu oraz przygotowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Aby zapewnić prawidłowe wnioski, jako kontrolę pozytywną wykorzystuje się docelowe botaniczne DNA M. chamomilla i niedocelowe botaniczne botaniczne DNA C. nobile, wstępnie wyekstrahowane z certyfikowanych botanicznych materiałów referencyjnych. Swoistość tej metody wykazano poprzez przeprowadzenie testów identyfikacyjnych zarówno M. chamomilla, jak i C. nobile indywidualnie na próbkach i kontrolach. Nieszablonowa kontrola ujemna służy do wykluczenia wyników fałszywie dodatnich spowodowanych zanieczyszczeniem PCR.

<table><tbody><tr><td>Bateria</td><td>TNE</td><td>78000mAh</td><td>Zapewnij zasilanie polowe</td></tr><tr><td>bCUBE</td><td>HYRIS</td><td>bCUBE 2.0</td> Przenośne kartridże <td>do przyrządów qPCR</td></tr><tr><td>(16 dołków)</td> <td>HYRIS</td><td>NA</td><td>Materiały eksploatacyjne do</td></tr><tr><td>pipety elektrycznej</td> bCUBE <td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Obsługa płynu</td></tr><tr><td>Extract-N-AmpTM zestaw do PCR roślin</td><td>SIGMA</td><td>XNAP2-1KT</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA roślin</td></tr><tr><td>Rumianek niemiecki (Matricaria chamomilla L) botaniczny materiał referencyjny</td><td>AHP</td><td>2264</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Mini sucha kąpiel</td><td>Yooning</td><td>MiniH-100L</td><td>Do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>AMBION</td><td>AM9937</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>reaction Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>qPCR reakcja</td></tr><tr><td>Rumianek rzymski (Chamaemelum nobile) kwiat botancyjne materiały referencyjne</td><td>ChromaDex</td><td>ASB-00030806-005</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Luna universal qPCR master mix</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td>qPCR reakcja</td></tr></tbody></table>

identyfikacja terenowa matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qpcr

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Kontrola jakości produktów botanicznych zaczyna się od dostarczenia surowców. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna odbywa się za pomocą oceny morfologicznej i chemicznych metod analitycznych. Jednak brak dostępności botaników, zwłaszcza w ostatnich latach, w połączeniu z potrzebą poprawy kontroli jakości w celu zwalczania napięć w łańcuchu dostaw spowodowanych rosnącym popytem konsumenckim i zmianami klimatycznymi, wymaga alternatywnych podejść. Celem tego protokołu jest ułatwienie identyfikacji gatunków botanicznych za pomocą przenośnego systemu qPCR w terenie lub w dowolnym miejscu, w którym dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony. Docelowy DNA jest amplifikowany za pomocą qPCR na bazie barwnika, przy czym DNA ekstrahowane z botanicznych materiałów referencyjnych służy jako kontrola pozytywna. Docelowy DNA identyfikuje się na podstawie jego specyficznej amplifikacji i dopasowania piku topnienia do kontroli pozytywnej. Szczegółowy opis kroków i parametrów, od praktycznego pobierania próbek w terenie, po ekstrakcję DNA, amplifikację PCR, a następnie interpretację danych, został dołączony, aby zapewnić, że czytelnicy mogą odtworzyć ten protokół. Uzyskane wyniki są zgodne z tradycyjnymi laboratoryjnymi metodami identyfikacji botanicznej. Protokół jest łatwy do wykonania i opłacalny, umożliwiając testowanie jakości surowców jak najbliżej miejsca pochodzenia łańcucha dostaw.

Prezentowany tutaj jest protokół do terenowej identyfikacji Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ten łatwy do wykonania protokół jest idealny jako metoda potwierdzania tożsamości gatunku botanicznego w miejscach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, takich jak gospodarstwa rolne i magazyny.

Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...

Praktyka stosowania składników botanicznych w celu poprawy zdrowia sięga tysięcy lat wstecz. W ostatnim czasie zwiększony popyt w połączeniu z niezrównoważonymi praktykami zbiorów i zmianami klimatycznymi wywarły presję na łańcuch dostaw. Z tego powodu zafałszowania botaniczne stają się coraz większym problemem, co sprawia, że identyfikacja botaniczna staje się coraz bardziej istotną częścią kontroli jakości.Idealnie byłoby, gdyby identyfikacja była przeprowadzana jak najbliżej źródła, dzięki czemu zasoby mogą być efektywnie alokowane do materiału o prawidłowej tożsamości. Istnieje wiele podejść do identyfikacji botanicznej. Tradycyjnie, identyfikacja botaniczna odbywa się za pomocą oceny morfologicznej i chemicznych metod analitycznych.Identyfikacja morfologiczna opiera się na różnicach w cechach makroskopowych i mikroskopowych materiałów roślinnych. Wymaga jednak dobrze wyszkolonego botanika, a jego zastosowanie do sproszkowanych materiałów botanicznych jest ograniczone. Chemiczne metody analityczne są szeroko stosowane w farmakopeach i laboratoriach, ale nie są idealne do badań terenowych ze względu na rozmiar przyrządów i wymagania środowiskowe.Ostatnio metody genomiczne pojawiły się jako alternatywna technika identyfikacji gatunków botanicznych ze względu na wysoką wierność i specyficzność informacji genomicznej w materiałach roślinnych. Dzięki narzędziom do diagnostyki molekularnej dostępnym obecnie w formie urządzeń przenośnych, takie podejście staje się możliwe do zastosowania w terenie. Celem tego protokołu jest wprowadzenie metody identyfikacji botanicznej w sytuacjach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, np. gospodarstwo dostarczające materiał botaniczny, przy użyciu przenośnego systemu qPCR.Matricaria chamomilla, powszechnie znana jako rumianek niemiecki, od wieków była stosowana jako lek ziołowy w celu promowania zdrowia. Aby ukazać specyfikę obecnej metody, dla porównania uwzględniono różnicowanie rumianku niemieckiego od innego powszechnie stosowanego kwiatu rumianku, znanego jako rumianek rzymski. Procedura identyfikacji pola została zademonstrowana w środku niemieckiej farmy rumianku.Ustaw obszar testowy w terenie z płaską i poziomą powierzchnią. Zidentyfikuj reprezentatywną roślinę, która odzwierciedla cechy większości roślin na polu kwiatów rumianku. Zbierz główkę kwiatu z reprezentatywnej rośliny za pomocą sterylnych rękawiczek.Umieść próbkę w probówce zbiorczej o pojemności 2,0 mililitra. Powtórz i zbierz ulotkę o długości około 0,5 do 0,7 centymetra z tej samej rośliny. Rozgrzej inkubator w suchej kąpieli do 95 stopni Celsjusza.Do każdej probówki zbiorczej dodaj 100 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do ekstrakcji DNA roślinnego. Aby uzyskać lepszą wydajność ekstrakcji DNA, zmiel próbkę za pomocą tłuczka do tkanek. Zamknij rurkę.Upewnij się, że tkanka botaniczna jest pokryta roztworem ekstrakcyjnym przez cały proces ekstrakcji. Umieść probówki do pobierania w podgrzewanym inkubatorze do suchej kąpieli i inkubuj probówki do pobierania w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut Po 10 minutach wyjmij probówki z inkubatora do suchej kąpieli. Dodać 100 mikrolitrów roztworu rozcieńczającego z zestawu do ekstrakcji DNA i wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.Powtórz ten sam krok w przypadku ekstrakcji ulotki. Wstrząśnij, aby jeszcze bardziej wymieszać roztwór. Problem z roślinami zwykle nie wydaje się być zdegradowany po tym zabiegu.Kolor płynu może się zmienić i stać się mętny. Skonfiguruj warunki termocyklingu instrumentu qPCR zgodnie z tabelą pierwszą, która rozpoczyna się od stałego kroku temperatury dla początkowej denaturacji, po którym następuje 25 cykli amplifikacji, a kończy się wzrostem temperatury w celu uzyskania krzywej topnienia o wysokiej rozdzielczości. Przed użyciem rozmrozić główną mieszankę qPCR i startery wymienione w tabeli drugiej w temperaturze pokojowej.Zaplanuj reakcję, która zostanie załadowana do każdej studzienki. Studzienki zawierające kontrole dodatnie z gatunkami docelowymi, kontrole dodatnie z gatunkami niebędącymi gatunkami docelowymi, próbki i kontrole ujemne. W tym przykładzie użyto 10 dołków, pięć do niemieckiego testu identyfikacji rumianku i kolejne pięć do testu identyfikacji rumianku rzymskiego.W odniesieniu do każdego rodzaju badania identyfikacji gatunku jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunku docelowego, jedna studzienka zawiera kontrolę pozytywną z DNA wyekstrahowanym z materiału referencyjnego gatunków niedocelowych, dwie studzienki wypełnia się próbkami DNA kwiatów i liści pobranymi z pola, a jedną studzienkę przydziela się do kontroli ujemnej. Tabela trzecia opisuje każdy typ studzienki. Przygotować wzorcową mieszaninę reakcji zgodnie z tabelą czwartą dla każdego badania identyfikacji gatunku botanicznego.Typowa mieszanka wzorcowa reakcji zawiera uniwersalną mieszankę wzorcową qPCR, dwukrotne, startery specyficzne dla gatunku do przodu i do tyłu oraz wodę wolną od nukleaz. Przed użyciem dokładnie wymieszać główną mieszankę reakcyjną przez pipetowanie. Umieść wkład reakcyjny PCR stroną zadrukowaną do góry na płaskiej i stabilnej powierzchni.Załadować 18 mikrolitrów głównej mieszanki reakcyjnej skonfigurowanej w poprzednim kroku do dołków nabojowych zgodnie z dołkami zdefiniowanymi tutaj. W tej demonstracji dodaj niemiecką mieszankę wzorcową reakcji testu identyfikacji rumianku do studzienek oznaczonych do testu GC, GCT w studzienkach pierwszym, trzecim, piątym, siódmym, dziewiątym i główną mieszankę testową testu identyfikacji rumianku rzymskiego do studzienek oznaczonych do testu RC, RCT w studzienkach drugich, czwartych, sześciu, ośmiu, 10. Przenieść dwa mikrolitry próbki DNA z supernatantu probówek do ekstrakcji DNA i wstępnie wyekstrahowanych kontroli dodatnich DNA do studzienek z wkładami wstępnie załadowanymi mieszanką wzorcową qPCR.Po dodaniu każdej matrycy DNA do głównej mieszanki qPCR, delikatnie wymieszać roztwór, pipetując. Ostrożnie uszczelnij wkład folią samoprzylepną. Załaduj wkład do komory termocyklingowej i zamknij ją.Ustaw urządzenie qPCR tak, aby działało. W obecnym protokole barwnik interkalacyjny jest używany do pomiaru amplifikacji docelowych fragmentów w czasie rzeczywistym. Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli wymaganych do przekroczenia przez sygnał fluorescencyjny wstępnie zdefiniowanego progu.Wartość Ct mniejsza niż 25 cykli została uznana za dodatnie wzmocnienie. Na tym rysunku rzymska kontrola pozytywna została tylko wzmocniona w teście identyfikacji rumianku rzymskiego, ale nie w niemieckim teście identyfikacyjnym rumianku. Niemiecka kontrola pozytywna rumianku i próbki terenowe zostały tylko amplifikowane w niemieckim teście identyfikacji rumianku, ale nie w teście identyfikacji rumianku rzymskiego.Kontrola ujemna nie została wzmocniona w żadnym z testów. Aby dodatkowo potwierdzić specyficzną amplifikację w kontrolach pozytywnych i próbkach, frakcje PCR i produkty z każdej studzienki przeprowadzono w laboratorium na 2% żelu agarozowym. Wszystkie studzienki o wartości Ct mniejszej niż 25 dały amplikony o oczekiwanych rozmiarach, które różnią się między rumiankiem niemieckim a rumiankiem rzymskim.Pozostałe tory nie wykazały żadnego konkretnego produktu wzmacniającego, co zgadza się z brakiem sygnału fluorescencyjnego dla tych studni, co zaobserwowano w testach terenowych. Po amplifikacji PCR przeprowadzono analizę krzywej topnienia przy użyciu tego samego oprogramowania, które było używane do monitorowania sygnału fluorescencyjnego. Wraz ze wzrostem temperatury dwuniciowe amplikony zaczynają się dysocjować, co powoduje spadek intensywności fluorescencji.Zmiany intensywności fluorescencji zostały następnie przekształcone w krzywe pików topnienia w celu dalszego różnicowania rumianku niemieckiego od rumianku rzymskiego na podstawie ich charakterystycznych pików topnienia. Na tym rysunku szczyt topnienia pozytywnej kontroli rumianku niemieckiego wynosi 85,6 stopni Celsjusza i różni się od szczytu topnienia pozytywnej kontroli rumianku rzymskiego. Amplikony PCR z próbek terenowych wytwarzają piki topnienia zbliżone do dodatniej kontroli rumianku niemieckiego.Tożsamość próbki terenowej określa się na podstawie określonego amplifikacji i charakterystycznej temperatury topnienia, która odpowiada kontrolom. W tym przykładzie zarówno kwiat, jak i liść zebrane na polu są identyfikowane jako Matricaria chamomilla, rumianek niemiecki. Wyniki testu rumianku rzymskiego dla tych dwóch próbek są negatywne.Protokół demonstruje identyfikację rumianku niemieckiego w terenie za pomocą przenośnego systemu qPCR. Podobne metody możemy opracować, aby poszerzyć portfolio składników botanicznych, które można testować. Mamy nadzieję, że ten film dostarczy cennych materiałów szkoleniowych dla naukowców, nawet osób niebędących ekspertami, do przeprowadzania identyfikacji botanicznej w terenie lub w środowisku o ograniczonym sprzęcie laboratoryjnym.Testy identyfikacji terenowej oparte na DNA nie tylko dają bardzo dokładne wyniki, które są zgodne z analizą laboratoryjną, ale także skracają czas i koszty związane z tradycyjnymi metodami wykonywanymi w laboratorium.

field-identification-matricaria-chamomilla-using-portable-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Przedstawiamy tani i szybki protokół genotypowania molekularnego, który wykorzystuje specyficzne dla odmiany startery PCR celujące w różnice w sekwencji DNA w obrębie regionu spacerowego trnL-F chloroplastu, aby odróżnić odmiany Imperata cylindrica (trawa cogon), których nie można rozpoznać wyłącznie na podstawie morfologii. Odmiany te obejmują wpisaną na listę federalną roślinę inwazyjną, trawę cogon, oraz blisko spokrewnioną, powszechnie występującą odmianę ozdobną, I. cylindrica var.

Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Poznaj identyfikację terenową Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ta metoda molekularna umożliwia szybką diagnostykę gatunków roślinnych w warunkach polowych, zapewniając kontrolę jakości surowców zielarskich.

Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

Przeglądaj więcej filmów