Name: Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę syntezy białek w femtolitrowych kroplach z pojedynczych cząsteczek DNA. Technika umożliwia szybkie, ilościowe pomiary aktywności enzymów bez skomplikowanej ekspresji i oczyszczania białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant JSPS KAKENHI numer JP18K14260 oraz budżet Japońskiej Agencji ds. Nauki i Technologii Morskiej i Ziemi. Dziękujemy Shigeru Deguchi (JAMSTEC) i Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) za udostępnienie urządzeń do charakteryzacji. Dziękujemy Kenowi Takai (JAMSTEC) za wsparcie w zakresie oprogramowania komercyjnego. Mikrofabrykacja została przeprowadzona w Takeda Sentanchi Supercleanroom na Uniwersytecie Tokijskim, przy wsparciu "Nanotechnology Platform Program" Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia, grant numer JPMXP09F19UT0087.

<ol><li>Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplets+for+ultrasmall-volume+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplets for ultrasmall-volume analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).</li>
<li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Zhu, P. A., Wang, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+droplet+generation+with+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive and active droplet generation with microfluidics: a review.</a> Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tubes+to+drops%3A+droplet-based+microfluidics+for+ultrahigh-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004(2013).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22DNA+Nanotechnology%22">DNA Nanotechnology</a>. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).</li>
<li>Dubuc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microcompartmentalised+transcription-translation+for+the+prototyping+of+synthetic+communication+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).</li>
<li>Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+approaches+in+synthetic+biology+utilizing+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics.</a> Genes. 9 (3), (2018).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell-free+protein+synthesis+in+synthetic+biology%3A+Interfacing+bio-machinery+with+synthetic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments.</a> Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).</li>
<li>Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+artificial+life%3A+techniques+for+bottom-up+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology.</a> Micromachines. 10 (5), (2019).</li>
<li>Bowman, E. K., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplet-assisted+screening+of+biomolecule+production+for+metabolic+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications.</a> Trends in Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+high-throughput+screening+based+on+digital+protein+synthesis+in+a+massively+parallel+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array.</a> Science Advances. 5 (8), 8185(2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+high-performance+perfluorinated+polymer+electret+and+its+application+to+micro+power+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011(2008).</li>
<li>Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+enzymatic+assay+in+a+directly+accessible+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array.</a> Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nature Communications. 5, 4519(2014).</li>
<li>Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+plasmon+waveguides+and+devices+in+Cytop+with+integrated+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).</li>
<li>Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+using+straight+long-range+surface+plasmon+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides.</a> Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).</li>
<li>Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+invisible+visible%3A+a+microfluidic+chip+using+a+low+refractive+index+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer.</a> Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).</li>
<li>Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting+using+thin+fluoroploymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting-on-dielectric+platform+using+multi-layer+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+system+for+long-term+perfusion+culture+and+on-line+monitoring+of+intestinal+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models.</a> Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).</li>
<li>Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoropolymer-coated+PDMS+microfluidic+devices+for+application+in+organic+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry-a+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis.</a> Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).</li>
<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wetting%3A+statics+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Wetting: statics and dynamics.</a> Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Wagner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+fluorinated+polyglycerols+for+droplet+microfluidics+as+an+alternative+to+PEG-based+copolymer+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants.</a> Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).</li>
<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%3A+a+tool+for+biology%2C+chemistry+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidic+systems+for+high-throughput+single+DNA+molecule+isothermal+amplification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).</li>
<li>Galinis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanoparticles+for+improved+protein+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+bioassays%3A+theory%2C+applications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital bioassays: theory, applications, and perspectives.</a> Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Courtois, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+device+for+monitoring+time-dependent+in+vitro+expression+from+single+genes+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets.</a> ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).</li>
<li>Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding%3A+tracking+mobile+micro-reactors+for+high-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+PDMS+isn%27t+the+best%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">When PDMS isn't the best.</a> Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Bradshaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+of+Escherichia+coli+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMantilla%2C+CB+%22Techniques+in+Confocal+Microscopy%22">Techniques in Confocal Microscopy</a>. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).</li>
<li>Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+counting+of+biomolecules+with+femtoliter+dropret+chamber+array%5BTitle%5D)+AND+%22The+17th+International+Conference+on+Solid-State+Sensors%2C+Actuators+and+Microsystems+%28TRANSDUCERS+%26+EUROSENSORS+XXVII%22%5BJournal%5D)">Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array.</a> The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-localization+for+fast+analysis+of+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays.</a> Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+barcode-inspired+automatic+analysis+for+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays.</a> Biomicrofluidics. 7 (3), 034110(2013).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+processing%22">Digital image processing</a>. , Pearson. New York, NY. (2018).</li>
<li>Cohen, L., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+arrays+for+protein+and+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wysoce ilościowy pomiar oparty na wysoce jednorodnych, stabilnych i biokompatybilnych kropelkach w FemDA umożliwił dyskretny rozkład, co jest unikalną cechą naszego badania różniącą się od innych. W tym artykule systematycznie optymalizowaliśmy i szczegółowo opisywaliśmy procesy mikrowytwarzania i tworzenia kropel. W ustalonym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków.
Po pierwsze, jednolita powłoka polimeru CYTOP o wysokiej lepkości na prostokątnym cienkim podłożu szklanym w dużej mierz...

Badacze używają reaktorów do przeprowadzania reakcji biochemicznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmniejszenia rozmiarów reaktora i zwiększenia przepustowości eksperymentalnej w celu obniżenia zużycia odczynników przy jednoczesnej poprawie wydajności pracy. Oba aspekty mają na celu uwolnienie naukowców od dużego obciążenia pracą, obniżenie kosztów i przyspieszenie prac badawczo-rozwojowych. Mamy jasną historyczną mapę drogową dotyczącą rozwoju technologii reaktorów z punktu widzenia objętości reakcji i przepustowości: pojedyncze zlewki/kolby/probówki, probówki mililitrowe, probówki mikrolitrowe, mikrolitrowe 8-rurkowe paski, mikrolitrowe 96/384/1536-dołkowe płytki oraz mikroprzepływowe nanolitry/pikolitr/femtolitrowe reaktory1,2,3,4,5,6,7. Analogicznie do zmniejszania rozmiaru tranzystorów w układach scalonych w przemyśle półprzewodników w ostatnich dziesięcioleciach, mikroreaktory biochemiczne przechodzą proces redukcji objętości i integracji systemów. Takie narzędzia na małą skalę wywarły ogromny wpływ na biologię syntetyczną opartą na komórkach lub bezkomórkową, bioprodukcję oraz prototypowanie i badania przesiewowe o wysokiej przepustowości8,9,10,11,12. Ten artykuł opisuje nasze ostatnie wysiłki nad opracowaniem unikalnej technologii matryc kropelkowych i demonstruje jej zastosowanie w CFPS13, podstawowej technologii dla społeczności biologii syntetycznej i molekularnych badań przesiewowych14. W szczególności celowo zapewniamy zoptymalizowany i tani protokół, aby urządzenie FemDA było dostępne dla każdego. Tani i łatwy w obsłudze protokół dla zminiaturyzowanego urządzenia przyczyniłby się do realizacji celów edukacyjnych uniwersytetów i pomógłby w rozpowszechnianiu technologii.
FemDA przygotowuje kropelki femtolitrowe o bardzo wysokiej gęstości 106 na 1cm2 na płaskim podłożu szklanym. Pokryliśmy hydrofobowy polimer CYTOP15 na szklanym podłożu i selektywnie wytrawiliśmy (usunęliśmy) CYTOP w predefiniowanych pozycjach, aby wygenerować układ mikrokomór na podłożu. W ten sposób powstała mikrokomora składa się z hydrofobowej ściany bocznej (CYTOP) i hydrofilowego dna (szkła). Podczas sekwencyjnego przepływu wody i oleju po wzorzystej powierzchni, woda może zostać uwięziona i uszczelniona w mikrokomorach. Struktura hydrofilowa w hydrofobowości jest niezbędna do odpychania wody na zewnątrz mikrokomór, izolowania poszczególnych mikroreaktorów i zatrzymywania niewielkiego roztworu wodnego wewnątrz przestrzeni femtolitrowej. Ta unikalna właściwość została z powodzeniem zastosowana do przygotowania kropelek wody w oleju i dwuwarstwowych mikrokompartmentów lipidowych16,17. W porównaniu z prototypowym urządzeniem16, najpierw zoptymalizowaliśmy proces mikroprodukcji, aby zrealizować całkowite usunięcie polimeru CYTOP, a także pełne naświetlenie szklanego dna. CYTOP to specjalny fluoropolimer charakteryzujący się wyjątkowo niskim napięciem powierzchniowym (19 mN/m) niższym niż w przypadku konwencjonalnych materiałów mikroreaktorów, takich jak szkło, tworzywa sztuczne i silikon. Jego dobre parametry optyczne, elektryczne i chemiczne zostały już wykorzystane w obróbce powierzchni urządzeń mikroprzepływowych18,19,20,21,22,23,24. W systemie FemDA, aby osiągnąć dobre zwilżenie oleju na powierzchni CYTOP, napięcie powierzchniowe oleju musi być niższe niż napięcie powierzchni ciała stałego25. W przeciwnym razie ciekły olej w kontakcie z powierzchnią ciała stałego ma tendencję do stawania się kulistym, a nie rozprowadzania się po powierzchni. Poza tym odkryliśmy, że niektóre popularne oleje perfluorowęglowe (np. 3M FC-40)16 i oleje hydrofluoroeterowe (np. seria 3M Novec) mogą rozpuszczać CYTOP w wyniku amorficznej morfologii CYTOP, co jest śmiertelne dla pomiarów ilościowych i byłoby wątpliwe pod względem zanieczyszczenia krzyżowego między kropelkami. Na szczęście zidentyfikowaliśmy biokompatybilny i przyjazny dla środowiska olej wykazujący niższe (< 19 mN/m) napięcie powierzchniowe13. Znaleźliśmy również nowy środek powierzchniowo czynny, który może rozpuszczać się w wybranym oleju i funkcjonować w niskim stężeniu (0,1%, co najmniej 10-krotnie niższym niż wcześniej zgłaszane popularne stężenie26,27)13. Powstały w ten sposób interfejs woda/olej może być stabilizowany przez środek powierzchniowo czynny. Ze względu na wysoką szybkość parowania oleju, po przepłukaniu olejem, zastosowaliśmy inny biokompatybilny i przyjazny dla środowiska olej, który zastąpił pierwszy do uszczelniania mikrokomór. Pierwszy olej (ASAHIKLIN AE-3000 o zawartości 0,1% wag. SURFLON S-386) nazywamy odpowiednio "olejem do płukania", a drugi olej (Fomblin Y25) "olejem uszczelniającym".
Dwuetapowa strategia uszczelniania olejem może doprowadzić do solidnego tworzenia matrycy kropel femtolitrowych w ciągu kilku minut i bez skomplikowanego oprzyrządowania. Ze względu na problem z parowaniem, uznano, że generowanie mikroreaktorów mniejszych niż objętości pikolitrów jest wyzwaniem28. Projekt FemDA rozwiązał ten problem poprzez systematyczną optymalizację materiałów i procesów stosowanych do przygotowania mikroreaktorów/kropel. Kilka godnych uwagi cech powstałych kropel to wysoka jednorodność (lub monodyspersyjność), stabilność i biokompatybilność w skali femtolitrowej. Współczynnik zmienności (CV) objętości kropli wynosi zaledwie 3% (bez korekcji winietowania dla obrazów mikroskopowych), co jest najmniejszym CV wśród platform kropel na świecie, co zapewnia wysoce równoległy i ilościowy pomiar. Kropla femtolitra jest stabilna przez co najmniej 24 godziny bez zanieczyszczenia krzyżowego między kropelkami w temperaturze pokojowej, co jest cenne dla wiarygodnego pomiaru przebiegu w czasie. Jeśli chodzi o biokompatybilność, udało nam się zsyntetyzować różne białka z pojedynczej kopii matrycy DNA w kropli femtolitru, co wcześniej uważano za trudne lub nieefektywne29,30. Warto byłoby wyjaśnić, dlaczego niektóre białka zdolne do syntezy w FemDA nie mogą być syntetyzowane w innych systemach kropelkowych. FemDA był nie tylko postępem technicznym, ale także umożliwił bezprecedensowy pomiar ilościowy, który może skorelować wydajność białka (odzwierciedloną przez intensywność fluorescencji kropli) z liczbą matrycowych cząsteczek DNA w każdej kropli. W rezultacie, histogram intensywności fluorescencji kropelek z CFPS opartego na FemDA wykazał dyskretny rozkład, który można ładnie dopasować za pomocą sumy rozkładów Gaussa o równych odstępach między pikami. Co więcej, prawdopodobieństwo wystąpienia kropelek zawierających różną liczbę cząsteczek DNA idealnie pasowało do rozkładu Poissona31. W ten sposób różna wydajność białka w każdej kropli może być znormalizowana w oparciu o dyskretny rozkład. Ta krytyczna cecha pozwala nam oddzielić informacje o aktywności enzymatycznej od pozornej intensywności, która nie była jeszcze dostępna w przypadku innych platform mikroreaktorów. Istniejące mikroprzepływowe systemy sortowania komórek/kropelek są wykwalifikowane w całkowicie automatycznym sortowaniu i dobrze radzą sobie z koncentracją próbek, ale czasami mogą uzyskać tylko stosunkowo szeroki lub długoogoniasty histogram w aspekcie analitycznym32,33. Nasz wysoce ilościowy i biokompatybilny system FemDA wyznacza nowy punkt odniesienia i wysoki standard analityczny w dziedzinie rozwoju mikroreaktorów.
Oleje i środki powierzchniowo czynne, które mogłyby być używane do przygotowania kropel, są nadal bardzo ograniczone34. Połączenie ASAHIKLIN AE-3000 i SURFLON S-386 zapoczątkowane w FemDA jest nowym członkiem rosnącego arsenału fizykochemicznego interfejsu między fazą wodną a fazą olejową13. Nowy interfejs w FemDA jest fizycznie stabilny, chemicznie obojętny i biologicznie kompatybilny ze złożonymi maszyneriami transkrypcji, translacji i modyfikacji potranslacyjnej dla wielu rodzajów białek13. Byłoby raczej atrakcyjne znalezienie białka, które nie może być syntetyzowane w ustawieniach kropelkowych. Poza tym oszczędność kosztów odczynników jest bardziej widoczna w systemie kropelkowym femtolitrowym niż w systemach reaktorów nanolitrowych i pikolitrowych35,36. W szczególności często występuje duża objętość martwa, która jest spowodowana głównie przez rurki lub zewnętrzne źródła zasilania, w systemach generowania kropel mikroprzepływowych, ale nie w naszym FemDA. Format tablicy jest również faworyzowany przez powtarzającą się i szczegółową charakterystykę mikroskopową (podobną do tak zwanej analizy o wysokiej zawartości) dla każdego pojedynczego reaktora37, a nie tylko pojedynczej migawki dla szybko poruszającego się obiektu. Skala femtolitrowa umożliwiła integrację ponad miliona reaktorów na powierzchni wielkości palca, podczas gdy taka sama liczba reaktorów nanolitrowych (jeśli taka istnieje) wymaga ponad metra kwadratowego powierzchni, co byłoby niewątpliwie niepraktyczne do wyprodukowania lub zastosowania takiego systemu.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL: do użytku elektronicznego.</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 3D</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>Zastosowanie mają również inne podobne mikroskopy (np. Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000).</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan 6,8-difluoro-4-metylobelokliferylu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>Przygotować 5 mM roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku</td></tr><tr><td>Acetonie</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grade</td><td>EL: do użytku elektronicznego. Czystość 99,8%.</td></tr><tr><td>Dmuchawa powietrza</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>Blok aluminiowy</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy stojak na mikroprobówki</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td> <td>(próbka testowa)</td> <td>Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do AGC.</td></tr><tr><td>Wycieraczka BEMCOT PS-2</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji z tłokiem</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>Szkło Matsunami nr</td><td>1 (24 mm i razy 32 mm, grubość 0,13 ~ 0,17 mm)</td> <td>Dostosowane do rozmiaru.</td></tr><tr><td>Stojak na witraże do szkła nakrowego</td><td>Nakayama</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe czysta wycieraczka</td><td>Nippon Paper Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>Mata do cięcia</td><td>GE Healthcare</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik odgazowujący</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>Nóż biurkowy</td><td>Roland</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>Deweloper</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>Firma AZ Electronic Materials została przejęta przez Merck. Inne wywoływacze alkaliczne mogą być również odpowiednie, ale powinny wymagać optymalizacji warunków rozwoju (czas, temperatura itp.)</td></tr><tr><td>Podwójnie powlekana samoprzylepna taśma foliowa Kapton</td><td>Teraoka Seisakusho</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL klasa</td><td>EL: do użytku elektronicznego. Czystość 99,5%.</td></tr><tr>Wersja <td>Fidżi</td><td></td><td></td><td>: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>Płaski nóż do</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Olej Fomblin</td><td>Solvay</td><td>Y25 lub Y25/6</td><td>Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do Solvay. Fomblin Y25/6 jest alternatywą, jeśli Y25 nie jest łatwo dostępny.</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>AS ONE</td><td>TH-900</td><td></td></tr><tr><td>Igła iniekcyjna</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G i razy 70 mm</td></tr><tr><td>Wymagany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Specyfikacja epifluorescencji, kamera CCD lub sCMOS, zmotoryzowany stolik, system autofokusa i obiektyw o wysokiej NA.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>Wersja: 4.5</td></tr><tr><td>Nakładka do maski</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>Inne nakładki na maski są również stosowane, o ile dostępny jest tryb kontaktu próżniowego.</td></tr><tr><td>Pipeta MICROMAN</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>Końcówka tłoka kapilarnego: CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td> Wersja <td>Microsoft</td><td></td><td>: 16.16.15</td></tr><tr><td>Mini komora próżniowa</td><td>JAKO JEDNA</td><td>MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do PCR Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>Średnica 90 mm, wysokość 15 mm.</td></tr><tr><td>Firma Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>Firma AZ Electronic Materials została przejęta przez firmę Merck. Alternatywą jest AZ P4620.</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice polietylenowe</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>Nazwa handlowa: Saniment.</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S lub E6800L</td><td>Do bezkomórkowej reakcji syntezy białek.</td></tr><tr><td>System trawienia jonami reaktywnymi</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>Inne systemy RIE również mają zastosowanie, ale powinny wymagać optymalizacji warunków RIE (natężenie przepływu gazu, ciśnienie w komorze, moc RF, czas trawienia itp.)</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S Taśma</td><td></td></tr><tr><td>klejąca</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>Stężenie 8 M; niebezpieczeństwo.</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Oshigane</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386 środek powierzchniowo czynny</td><td>AGC</td> <td>(próbka testowa)</td> <td>Bezpłatna próbka testowa może być dostępna na zapytanie do AGC.</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 elastomer silikonowy</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>Skład chemiczny: polidimetylosiloksan. Domyślny stosunek mieszania to podstawa : utwardzacz = 10 : 1 (m / m).</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF. SA.1 2A</td> Myjka ultradźwiękowa <td></td></tr><tr><td></td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt próżniowy</td><td>Oshigane</td> <td>(dostosowany)</td> <td>Materiał: delrin; prostokątny stolik na próbkę z wieloma otworami (48 otworów, każdy o średnicy 1 mm); rozmiar jest dostosowany do rozmiaru szkła nakrywkowego (24 mm i razy 32 mm).</td></tr></tbody></table>

femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek dna

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Postępy w rozdzielczości przestrzennej i czułości wykrywania instrumentów naukowych umożliwiają zastosowanie małych reaktorów do badań biologicznych i chemicznych. Aby sprostać zapotrzebowaniu na wysokowydajne mikroreaktory, opracowaliśmy urządzenie do femtolitrowej matrycy kropelkowej (FemDA) i zademonstrowaliśmy jego zastosowanie w masowo równoległych reakcjach bezkomórkowej syntezy białek (CFPS). Ponad milion jednolitych kropel zostało łatwo wygenerowanych w obszarze wielkości palca przy użyciu dwuetapowego protokołu uszczelniania olejem. Każda kropla została zakotwiczona w mikrokomorze femtolitrowej składającej się z hydrofilowego dna i hydrofobowej ściany bocznej. Hybrydowa struktura hydrofilowo-hydrofobowa oraz dedykowane oleje uszczelniające i środki powierzchniowo czynne mają kluczowe znaczenie dla stabilnego zatrzymywania wodnego roztworu femtolitru w przestrzeni femtolitru bez strat związanych z parowaniem. Konfiguracja femtolitrowa i prosta konstrukcja urządzenia FemDA pozwoliły na minimalne zużycie odczynników. Jednolity wymiar reaktorów kropelkowych sprawił, że wielkoskalowe pomiary ilościowe i czasowe były przekonujące i wiarygodne. Technologia FemDA korelowała wydajność białka w reakcji CFPS z liczbą cząsteczek DNA w każdej kropli. Uprościliśmy procedury związane z mikrofabrykacją urządzenia, tworzeniem kropelek femtolitru oraz pozyskiwaniem i analizą mikroskopowych danych obrazowych. Szczegółowy protokół przy zoptymalizowanych niskich kosztach eksploatacji sprawia, że technologia FemDA jest dostępna dla każdego, kto ma standardowe pomieszczenia czyste i konwencjonalny mikroskop fluorescencyjny we własnym miejscu.

Proces mikrofabrykacji składa się z czyszczenia podłoża, funkcjonalizacji powierzchni, nanoszenia powłoki CYTOP, fotolitografii, trawienia suchego, usuwania fotorezystu oraz końcowego czyszczenia. Co istotne, przedstawiony protokół pozwolił na całkowite usunięcie hydrofobowego polimeru CYTOP z wnętrza mikrokomerek (Ryc. 3A), co doprowadziło do powstania wysoce równoległej struktury hydrofilowej wewnątrz hydrofobowej na standardowym podłożu ze szkiełka podstawowego. Dzięki zastosowaniu protok...

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Na podłożu wielkości palca wytwarza się ponad milion jednorodnych kropel. Pojedyncze cząsteczki DNA są losowo rozmieszczone w każdej kropli. Wydajność białka jest proporcjonalna do liczby cząsteczek w kropli.Nasza technika może być wykorzystana do szybkiego i ilościowego pomiaru aktywności enzymu bez skomplikowanej ekspresji i oczyszczania białek. Aby rozpocząć, umieść szklankę nakrywkową na stojaku do barwienia i umieść ją w ośmiomolowym wodorotlenku sodu. Sonikować szkło nakrywkowe i stojak do barwienia przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Wyjmij ruszt do barwienia z wodorotlenku sodu i spłucz szklankę nakrywkową wodą 10 razy. Osusz szkło nakrywkowe pistoletem pneumatycznym. Następnie piecz i susz szklankę nakrywkową na gorącej płycie w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez pięć minut.Przygotować 0,05% roztwór aminozlanu. Zanurz szkło nakrywkowe w tym roztworze i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Opłucz szklaną pokrywę pięć razy w czystej wodzie.Następnie osusz szkło nakrywkowe za pomocą pistoletu pneumatycznego. Piecz na gorącej płycie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieść szklane podłoże nakrywkowe na niestandardowym uchwycie próżniow

a-femtoliter-droplet-array-for-massively-parallel-protein-synthesis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Tutaj prezentujemy adresowalne mikromacierze kropelkowe (ADM), metodę opartą na tablicy kropelkowej, która jest w stanie określić bezwzględną obfitość białek w pojedynczych komórkach. Wykazujemy zdolność ADM do charakteryzowania niejednorodności ekspresji białka supresorowego p53 w ludzkiej linii komórek nowotworowych.

Zliczanie białek w pojedynczych komórkach za pomocą adresowalnych mikromacierzy kropelkowych

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Poznaj metodę syntezy białek w femtolitrowych kroplach z pojedynczych cząsteczek DNA. Technika umożliwia szybkie, ilościowe pomiary aktywności enzymów bez skomplikowanej ekspresji i oczyszczania białek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Przeglądaj więcej filmów