Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Na podłożu wielkości palca wytwarza się ponad milion jednorodnych kropel. Pojedyncze cząsteczki DNA są losowo rozmieszczone w każdej kropli. Wydajność białka jest proporcjonalna do liczby cząsteczek w kropli.

Nasza technika może być wykorzystana do szybkiego i ilościowego pomiaru aktywności enzymu bez skomplikowanej ekspresji i oczyszczania białek. Aby rozpocząć, umieść szklankę nakrywkową na stojaku do barwienia i umieść ją w ośmiomolowym wodorotlenku sodu. Sonikować szkło nakrywkowe i stojak do barwienia przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Wyjmij ruszt do barwienia z wodorotlenku sodu i spłucz szklankę nakrywkową wodą 10 razy. Osusz szkło nakrywkowe pistoletem pneumatycznym. Następnie piecz i susz szklankę nakrywkową na gorącej płycie w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Przygotować 0,05% roztwór aminozlanu. Zanurz szkło nakrywkowe w tym roztworze i inkubuj je przez godzinę w temperaturze pokojowej. Opłucz szklaną pokrywę pięć razy w czystej wodzie.

Następnie osusz szkło nakrywkowe za pomocą pistoletu pneumatycznego. Piecz na gorącej płycie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut. Umieść szklane podłoże nakrywkowe na niestandardowym uchwycie próżniowym do powlekarki wirowej.

Dozuj od 70 do 90 mikrolitrów polimeru CYTOP typu A na środku szklanego podłoża. Następnie natychmiast obtocz polimer. Początkowa powłoka polimerowa pogarsza jakość końcowego układu mikrokomór.

Dozuj polimer na środek szkła nakrywkowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Podnieś powlekane szkło, trzymając je za rogi i umieść na folii aluminiowej. Piecz przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, a następnie przez kolejną godzinę w temperaturze 200 stopni Celsjusza.

Dozuj od 0,2 do 0,3 mililitra fotorezystu w środku podłoża. Natychmiast obrócić fotorezystor z prędkością 6 000 obr./min przez 60 sekund. Użyj chusteczki nasączonej etanolem, aby usunąć nadmiar fotorezystu z krawędzi podłoża.

Piecz podłoże w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby ponownie nawodnić fotorezyst, pozostaw podłoże na 30 minut przy wilgotności względnej od 42 do 60%Załaduj podłoże do nakładki maski i naświetlaj je przez 25 sekund w trybie kontaktu próżniowego. Następnie zanurz podłoże w wywoływaczu na pięć minut, aby rozpuścić naświetlony fotorezyst.

Spłucz podłoże 10 razy czystą wodą. Następnie dokładnie osusz podłoże za pomocą pistoletu pneumatycznego. Umieść podłoże w komorze reakcyjnej maszyny do trawienia jonów reaktywnych i wytraw fotorezystor pokryty CYTOP plazmą tlenową.

Po wytrawieniu usuń pozostały fotorezyst, sonikując podłoże w acetonie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie sonikować substrat do propanolu przez pięć minut. Spłucz, sonikatuj i ponownie spłucz podłoże czystą wodą, jak opisano w manuskrypcie.

Następnie osusz podłoże za pomocą pistoletu pneumatycznego. Za pomocą noża biurkowego przytnij podwójnie powlekaną samoprzylepną taśmę z folii kaptonowej na zdefiniowane kształty mikrokanalików. Przyklej wycięte kawałki taśmy na dnie płaskiej szalki Petriego, aby posłużyły jako mistrz do formowania PDMS.

Wlej mieszaninę PDMS na szalkę Petriego z wzorem taśmy. Następnie umieść szalkę Petriego w mini komorze próżniowej i odpowietrzaj mieszaninę PDMS przez jedną do trzech godzin. Następnie umieść szalkę Petriego w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza i pozostaw na noc, aby utwardziła PDMS.

Po utwardzeniu PDMS oderwij utwardzony elastomer od szalki Petriego i użyj płaskiego obcinaka do, aby wyciąć bloki mikrokanalików PDMS. Następnie wybij otwór na każdym końcu każdego mikrokanału. Na wcześniej przygotowanym podłożu znajdzie się powierzchnia pod układ mikrokomor.

Umieść mikrokanalik PDMS w tej części podłoża. Następnie włóż końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do jednego z otworów w mikrokanaliku PDMS. Najpierw przygotuj roztwór reakcyjny CFPS w probówce do PCR.

Następnie, za pomocą końcówki pipety bez filtra o pojemności 200 mikrolitrów, pobrać 10 mikrolitrów roztworu. Włóż końcówkę pipety do otworu wlotowego mikrokanalika PDMS i dociśnij tłok pipety, aż roztwór wyleje się z wylotu mikrokanału. Przenieś urządzenie FemDA do wstępnie schłodzonego bloku aluminiowego.

Upewnij się, że obszar matrycy mikrokomory szybko zmienia się z półprzezroczystego na przezroczysty. Pobierz 300 mikrolitrów wstępnie schłodzonego oleju do spłukiwania i natychmiast przenieś olej do końcówki pipety w otworze wlotowym mikrokanału. Olej płuczący przemieszcza się do mikrokanalików i wytłacza nadmiar roztworu reakcyjnego znajdującego się na zewnątrz mikrokomór.

Jednocześnie wyjmij dwie włożone końcówki pipet z urządzenia. Natychmiast przenieś urządzenie z bloku aluminiowego na folię parafinową. Włóż przygotowaną końcówkę pipety zawierającą olej uszczelniający do wlotu mikrokanalika PDMS i wstrzykuj olej, aż wyleje się z wylotu.

Kropelki femtolitra są zamykane w poszczególnych mikrokomorach przez olej. Otwórz rozmyty obraz BF. Aby usunąć gładkie, ciągłe tła z każdej klatki, wybierz polecenie Odejmij tło z menu Proces.

Wprowadź wartość 20 dla promienia toczącej się kuli. Zaznacz pole Podgląd i wybierz opcję W porządku. Wybierz opcję Tak po wyświetleniu monitu, czy przetworzyć wszystkie obrazy.

Następnie, aby zredukować szum, wybierz Proces, Filtry, Mediana. Wprowadź wartość 2.0 dla promienia w pikselach. Zaznacz pole Podgląd i wybierz opcję W porządku.

Wybierz opcję Tak po wyświetleniu monitu, czy przetworzyć wszystkie obrazy. Następnie wybierz Obraz, Dostosuj, Próg, aby oddzielić obrazy mikrokomór od tła obrazu. Z menu Wtyczki wybierz FemDA, Analiza FemDA.

Wprowadź przybliżoną minimalną i maksymalną liczbę pikseli w pojedynczej mikrokomorze. Oczekiwana minimalna i maksymalna cyrkularność mikrokomór oraz numery ramek początkowych i końcowych, a następnie wybierz opcję Generuj zwrot z inwestycji, aby wykryć mikrokomory. Pomyślnie wykryte ROI są wyświetlane w menu podręcznym ROITable.

W oknie Analiza FemDA wybierz opcję Zastosuj maskę ROI. Zbadaj obraz, aby zobaczyć, czy mikrokomory zostały prawidłowo wykryte. Otwórz obraz fluorescencji i przesuń go na wierzch.

Kliknij ponownie przycisk Zastosuj maskę ROI, aby dodać ROI do obrazu fluorescencyjnego. W oknie Analiza FemDA wybierz opcję One-Shot, aby przeanalizować dane punktu końcowego obrazu. Wprowadź N w polu Liczba górnych pikseli, aby użyć górnych pikseli każdego zwrotu z inwestycji do obliczenia średniej intensywności odpowiedniej kropli.

Następnie kliknij przycisk Zmierz intensywność, aby obliczyć średnią intensywność wszystkich wykrytych kropel. ROITable jest aktualizowany o nowe dane z obrazu fluorescencyjnego, a histogram jest wyświetlany w nowym oknie. Wyeksportuj dane, klikając przycisk Zapisz jako tekst.

Roztwór fluorescencyjny zamknięto w mikrokomorach FemDA, a intensywność fluorescencji, która jest skorelowana z wielkością kropel, zmierzono za pomocą mikroskopii. Stwierdzono, że kropelki mają wąski rozkład wielkości. Zrekonstruowany obraz 3D z mikroskopii konfokalnej wykazał również stałą wielkość kropli w czasie.

Kropelki były stabilne w temperaturze pokojowej bez strat parowania lub zanieczyszczenia krzyżowego między kropelkami przez co najmniej 24 godziny. Białko fluorescencyjne mNeonGreen zostało zsyntetyzowane w FemDA. Dane obrazu stosu zostały przeanalizowane za pomocą jednoczesnego obrazu w jasnym polu, który uległ rozmyciu.

Ponieważ intensywność fluorescencji każdej kropli jest mierzona na podstawie zawartości białka, histogram silnie sugeruje nierówną liczbę cząsteczek DNA na kroplę. Prawdopodobieństwo, że kropelki zawierają różną liczbę cząsteczek DNA, idealnie pasowało do rozkładu Poissona. Syntezę enzymu fosfatazy alkalicznej przeprowadzono również w FemDA z obrazami rejestrowanymi co pięć minut.

Reakcja wykazała podobny dyskretny rozkład intensywności fluorescencji kropelek we wcześniejszych punktach czasowych, a wyniki histogramu potwierdziły, że nierówna liczba cząsteczek DNA w kropelkach. Pojedyncza cząsteczka DNA zamknięta w pojedynczych kropelkach może być dalej odzyskiwana, amplifikowana i sekwencjonowana, co pozwala na najwyższe możliwe badania przesiewowe białek. Technika kropelkowa charakteryzująca się zarówno małą objętością, jak i wysoką stabilnością pozwala na szybką i precyzyjną diagnostykę molekularną chorób nowotworowych za pomocą określonych biomarkerów.