Name: Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj adaptacyjną metodę stereotaktyczną do precyzyjnego docierania do trudno dostępnych regionów mózgu u myszy i szczurów. Protokół umożliwia implantację kanul oraz mikroinjekcje wirusowych konstruktów w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) granty F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 do G.J.M.) oraz finansowane przez NIDDK Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) i Diabetes, Grant szkoleniowy w zakresie otyłości i metabolizmu T32 DK0007247 (T.H.M.) na Uniwersytecie Waszyngtońskim.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, Guide for the Care and Use of Animals, oraz uzyskały akceptację Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Environmental Health and Safety na University of Washington.
1. Obliczanie współrzędnych kątowych
<ol>
	<li>Korzystając z atlasu mózgu w przekroju wieńcowym, wyznacz trójkąt prostokątny w taki sposób, aby przeciwprostokąt przechodził przez docelowy obszar zainteresowania. Na reprezentatywnym przykładzie (Rysunek 1), celem jest jądro brzuszno-przyśrodkowe (VMN) podwzgórza w 15° kąt od linii środkowej w płaszczyźnie czołowej. 
	UWAGA: Umiejscowienie osi obrotu przedstawione w Rycina 1 (a zatem długość boku C) jest dowolna i może zostać zmodyfikowana w celu ukierunkowania na dowolny region mózgu. Choć może się to wydawać nieintuicyjne, późniejsze etapy protokołu pozwolą na dostosowanie pozycji głowy w osi z w taki sposób, aby punkt ten pokrywał się ze stereotaktycznym centrum rotacji (patrz sekcja 6). Zaleca się jednak, aby kąt rotacji czołowej nie przekraczał 15° ze względu na ograniczenia fizyczne uchwytu głowy.</li>
	<li>Należy ustalić pożądany kąt (a) oraz szacowaną długość boku B, a następnie wykorzystać trygonometrię do obliczenia długości boków A i C. Ten krok jest istotny dla prawidłowego ustawienia głowy podczas rotacji. 
	UWAGA: W przykładzie w Rysunek 1, do przybliżenia długości boku B wykorzystuje się linie siatki atlasu, co pozwala uzyskać wartość 7,576 mm. Informacja ta służy do obliczenia długości boku A: 
	<img alt="Obliczanie wzorów trygonometrycznych; równanie tangensa kąta; schemat edukacji matematycznej." src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	W tym przykładzie wartość 2,03 mm oznacza odległość prawą/lewą (R/L) od linii środkowej, w której kaniula światłowodowa wchodzi do mózgu po obróceniu głowy o 15°.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie oblicz długość boku C, aby przybliżyć współrzędną D/V: 
		<img alt="Rozwiązywanie równania twierdzenia Pitagorasa w celu obliczenia przeciwprostokątnej w trójkącie prostokątnym, pokazano obliczenia." src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: 1) Długość przeciwprostokątnej (C) nie reprezentuje głębokości wstrzyknięcia, lecz będzie pomocna w wyznaczeniu współrzędnej D/V, którą być może trzeba będzie skorygować ze względu na zwiększoną długość w stosunku do boku B w przypadku wstrzyknięć prostopadłych. Zaleca się zatem wykonanie wstrzyknięć testowych w celu optymalizacji współrzędnej D/V. 2) W tym przykładzie celującym w VMN uzyskano dwa zestawy współrzędnych: jeden dla mikroiniekcji bez kąta nachylenia (A/P = -1,4, R/L = 0,4 przy 0°, D/V = -5,7) oraz jedna dla podkątowej implantacji światłowodowej (A/P = -1,4, R/L = 0,0 w 15°, D/V = -5,4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie stereotaksy do procedury pod kątem
<ol>
	<li>Potwierdzić, że rama stereotaktyczna oraz mikromanipulator zostały skalibrowane (pełny protokół znajduje się w instrukcji Kopf).</li>
	<li>Włożyć pomiarowy wzornik wysokości do gniazda płyty podstawowej uchwytu głowy.</li>
	<li>Zamocować lunetę centrującą w uchwycie narzędziowym, a następnie spojrzeć przez lunetę. Regulować pozycję mikromanipulatora, aż krzyż nitkowy zostanie wyrównany i skupiony na krzyżu nitkowym wzornika. 
	UWAGA: Na tym etapie luneta jest ustawiana w płaszczyźnie ogniskowej centrum rotacji uchwytu głowy. Po ustaleniu tej pozycji mikromanipulator nie powinien być przesuwany podczas pozostałych kroków.</li>
	<li>Umieścić pręty uszne w uchwytach i wycentrować je tak, aby linie wskaźnikowe po obu stronach znajdowały się na wartości 0 (Rysunek 3A).</li>
	<li>Użyć pokręteł przesunięcia przyśrodkowo-bocznego oraz przednio-tylnego w uchwycie głowy (Rysunek 2), aby wycentrować pręty uszne w płaszczyznach x i y względem krzyża nitkowego pomiarowego wzornika wysokości (Rysunek 3A).</li>
	<li>Aby wyrównać pozycję pręta usznego w osi z, należy wyjąć pręty uszne z uchwytu oraz usunąć pomiarowy wzornik wysokości. Ponownie włożyć pręty uszne i wycentrować je na wartości 0.</li>
	<li>Spojrzeć przez lunetę. Użyć odpowiednio pokrętła przesunięcia pionowego (Rysunek 3B) oraz pokrętła nachylenia czołowego, aby obniżyć i obrócić pręty uszne, aż krzyż nitkowy lunety pozostanie wycentrowany między prętami usznymi podczas całego obrotu czołowego.</li>
	<li>Aparat stereotaktyczny jest teraz skalibrowany i gotowy do użycia. Nie należy wprowadzać żadnych dalszych korekt w pozycji uchwytu głowy.</li>
</ol>
3. Przygotowanie materiałów do iniekcji/implantacji
<ol>
	<li>Należy upewnić się, że wszystkie instrumenty, narzędzia chirurgiczne i materiały są wysterylizowane i umieszczone w sterylnym polu operacyjnym obok urządzenia stereotaktycznego.</li>
	<li>Konstrukcje wirusowe należy obchodzić się i przechowywać zgodnie z ich poziomem bezpieczeństwa biologicznego oraz odpowiednimi instytucjonalnymi wymogami regulacyjnymi w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Należy pobrać wirusa do strzykawki, dbając o stosowanie właściwych praktyk manipulacyjnych i środków ochrony osobistej.</li>
</ol>
4. Znieczulenie
<ol>
	<li>Zapisz masę ciała myszy przed operacją.</li>
	<li>Wprowadź mysz w głęboką narkozę, używając izofluranu.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz znajduje się w głębokiej narkozie, wykonując test ucisku palca stopy aż do zaniku odruchu cofania. Jeśli zwierzę nadal wykazuje silne odruchy, zwiększ stężenie i/lub czas trwania anestezji.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu do każdego oka, aby utrzymać ich wilgotność podczas operacji.</li>
	<li>Wygol skórę głowy od miejsca tuż za uszami do miejsca tuż za oczami za pomocą trymera.</li>
	<li>Podaj myszy lek przeciwbólowy zatwierdzony przez IACUC.</li>
	<li>Nieprzerwanie monitoruj zwierzę podczas całego zabiegu chirurgicznego i zapewnij wsparcie termiczne.</li>
</ol>
5. Procedura chirurgiczna
<ol>
	<li>Umieść głowę w uchwycie, wkładając górne siekacze w szczelinę poprzeczki zgryzowej, upewniając się, że język znajduje się pod poprzeczką zgryzową.</li>
	<li>Zabezpiecz głowę za pomocą prętów usznych, delikatnie wprowadzając je do zewnętrznego przewodu słuchowego i upewniając się, że pręty są rozmieszczone symetrycznie (zazwyczaj od trzech do czterech w przypadku dorosłej myszy). Ten krok jest krytyczny dla zapewnienia stabilności i wycentrowania głowy przed rotacją.</li>
	<li>W sposób aseptyczny przygotuj ogoloną obszar nacięcia, stosując trzykrotne naprzemienne przemywanie betadyną i tamponami alkoholowymi lub alternatywną, zatwierdzoną przez instytucję metodą przygotowania pola operacyjnego.</li>
	<li>Przykryj zwierzę sterylną chustą operacyjną, aby utrzymać sterylność pola operacyjnego i zmniejszyć ryzyko infekcji pooperacyjnej.</li>
	<li>Odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie wzdłuż linii środkowej sagi skóry głowy. Delikatnie zeskrob powierzchnię czaszki, aby usunąć powięź i odsłonić szwy. 
	UWAGA: Jeśli linie szwów są trudne do zwizualizowania, do czaszki można przyłożyć nadtlenek wodoru za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby poprawić widoczność szwów.</li>
	<li>Włóż zakresometr centrujący do uchwytu i wycentruj krzyż na punkcie bregma (Rysunek 4, panel lewy). Wyzeruj mikromanipulator.</li>
	<li>Przesuń krzyż w kierunku gorszym (kaudalnym) do punktu lambda, odnotowując odległość bregma-lambda (B-L). 
	UWAGA: Jeśli linie szwów nie przebiegają w linii prostej wzdłuż osi środkowej, zaleca się wyznaczenie linii środkowej przy użyciu „linii dopasowania” przechodzącej przez punkty bregma i lambda. Jeśli jednak zastosowano powyższe kroki, początkowe ustawienie siatki zakresomierza powinno znajdować się w połowie odległości między prętami usznymi i ściśle odpowiadać środkowej linii szwu B-L.</li>
	<li>Jeśli odległość B-L jest znacznie mniejsza lub większa niż 4,21 mm, stopniowo koryguj położenie wyznaczonego punktu bregma, aby uzyskać odległość B-L wynoszącą 4,21 mm ± 0,2 mm.</li>
	<li>Zastąp zakresometr centrujący wskaźnikiem wyrównania. Umieść sondy na punktach lambda i bregma, a następnie dostosuj pokrętło nachylenia grzbietowego w uchwycie głowy, aby wypoziomować ją w płaszczyźnie strzałkowej (nosem skierowanym w górę lub w dół), po czym użyj zakresometru centrującego, aby ponownie wyznaczyć punkt bregma.</li>
	<li>Użyj wskaźnika wyrównania, aby wypoziomować głowę w płaszczyźnie czołowej za pomocą pokrętła nachylenia czołowego. Wykonaj pomiary w wielu punktach wzdłuż osi rostralnej/kaudalnej, aby uwzględnić deformacje powierzchni czaszki.</li>
	<li>Zanotuj pozycję na tarczy pokrętła nachylenia czołowego, ponieważ jest to pozycja rotacji 0°.</li>
</ol>
6. Wyznaczanie współosiowości głównych osi obrotu dla współrzędnych kątowych
<ol>
	<li>Zabeziecz celownik centrujący w uchwycie narzędziowym i ustaw mikromanipulator w współrzędnych obliczonych w sekcji 1. Należy pamiętać, że współrzędna R/L dla implantacji pod kątem odpowiada długości boku A.
	<ol>
		<li>W przykładzie na Rysunku 1 współrzędne kątowe dla umieszczenia światłowodu w VMN wynoszą (A/P = -1.4, R/L = [2.03] przy 0° rotacji koronowej, [0.0] przy 15° rotacji koronowej, D/V = -5.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyceluj przez celownik i zaznacz tę współrzędną (R/L 2.03 mm od linii środkowej zgodnie z przykładem dla VMN; Rysunek 4, panel środkowy). Znak ten reprezentuje punkt, w którym kaniula wejdzie do mózgu po obróceniu głowy.</li>
	<li>Przestaw mikromanipulator nad linię środkową (R/L = 0.0). Użyj pokrętła nachylenia koronowego, aby obrócić głowę pod kąt obliczony w sekcji 1.
	<ol>
		<li>Jeśli nitywnie celownika pokrywają się już z zaznaczeniem, przejdź do sekcji 7.</li>
		<li>Jeśli nitywnie celownika nie pokrywają się ze znakiem referencyjnym, dostosuj pozycję głowy w osi z za pomocą pokrętła przesunięcia pionowego (Rysunek 2), aż nitywnie znajdą się jak najbliżej znaku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróć głowę z powrotem do pozycji koronowej 0°. Jeśli w kroku 6.3 dokonano korekty przesunięcia pionowego, ponownie wyznacz bregma za pomocą celownika centrującego.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 6.3 i 6.4 do momentu, gdy nitywnie celownika będą konsekwentnie trafiać w znak referencyjny podczas obracania głowy (Rysunek 4C).</li>
	<li>W tym momencie dowolny punkt obrotu ustalony w sekcji 1 powinien być wyrównany ze stereotaktycznym centrum obrotu.</li>
</ol>
7. Mikrowstrzykiwanie
<ol>
	<li>Umieść wiertło stereotaktyczne w uchwycie i przesuń mikromanipulator do pierwszych współrzędnych wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Zgodnie z przykładem dla celowania w VMN, wykonaj wiercenie przy A/P = -1.4 i R/L = 0.4, utrzymując głowę w poziomie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obniżaj wiertło, aż grot znajdzie się tuż nad czaszką. Włącz wiertło i delikatnie opuszczaj je, aż grot przebije czaszkę (nie przebijaj opony twardej).</li>
	<li>Powtórz czynność dla przeciwległego miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Używając sterylnego uchwytu do igieł, wygnij igłę 27-30G pod kątem 90° (np. z jałowej strzykawki insulinowej 0.5 mL), a następnie za pomocą wygiętej igły delikatnie przebij oponę twardą.</li>
	<li>UWAGA: W przypadku wystąpienia krwawienia, zastosuj ucisk za pomocą sterylnego aplikatora z bawełką i oczyszczaj miejsce sterylną wodą, aż krwawienie ustanie.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do wstrzyknięcia, ostrożnie umieść napełnioną strzykawkę Hamiltona w uchwycie stereotaktycznym. 
	UWAGA: Współrzędne na mikromanipulatorze nie obowiązują po zmianie narzędzia. Jako nowy punkt docelowy wstrzyknięcia przyjmij środek otworu trepanacyjnego.</li>
	<li>Ostrożnie ustaw igłę nad otworem trepanacyjnym.</li>
	<li>Obniżaj igłę, aż lekko dotknie opony twardej w centrum otworu trepanacyjnego. KLUCZOWE: Wyczerz mikromanipulator tylko w osi z, aby zachować współrzędne mikromanipulatora dla lunety do centrowania stereotaktycznego i wiertła.</li>
	<li>Powoli wprowadzaj igłę do mózgu, uważnie obserwując, czy igła nie odchyla się na krawędzi otworu trepanacyjnego. Kontynuuj obniżanie, aż dotrzesz do punktu 0.05 mm brzusznie (ventral) od współrzędnej wstrzyknięcia D/V i odczekaj 1 min. Ten dodatkowy krok tworzy małą „kieszeń”, aby zminimalizować cofanie się wirusa podczas wyciągania igły.</li>
	<li>Powoli podnieś igłę do współrzędnej D/V i rozpocznij wstrzykiwanie. 
	UWAGA: Szybkość przepływu i objętość będą się różnić w zależności od regionu docelowego i projektu eksperymentalnego. W przypadku optogenetycznego wyciszania neuronów VMN pożądane jest odpowiednie pokrycie, dlatego wstrzykuje się 20 nL wirusa z prędkością 1 nL/s.</li>
	<li>Po mikrowstrzyknięciu odczekaj 10 min w miejscu wstrzyknięcia, aby zminimalizować wypływ wirusa podczas wycofywania.</li>
	<li>Powoli wycofuj mikropipetę z mózgu z prędkością około 1 mm/min.</li>
	<li>Gdy igła znajdzie się poza czaszką, wypuść niewielką objętość wirusa, aby upewnić się, że igła nie została zatkana krwią lub tkanką. Przed kontynuacją użyj sterylnego aplikatora z bawełką, aby usunąć wirusa.</li>
	<li>Powtórz kroki 7.6–7.12 dla strony przeciwległej.</li>
	<li>Uszczelnij otwory trepanacyjne po mikrowstrzyknięciu woskiem kostnym, aby usprawnić gojenie (Ryc. 5B).</li>
</ol>
8. Implantacja światłowodu
UWAGA: Po wstrzyknięciu wirusa, zgodnie z sekcją 1, pod wyliczonym kątem implantuje się obustronne kaniule światłowodowe. Należy pamiętać, że współrzędne te powinny być już zaznaczone na czaszce zgodnie z sekcją 6.
<ol>
	<li>Powtórz kroki 7.1–7.4 dla współrzędnych pod kątem.</li>
	<li>Przywróć głowę do pozycji poziomej 0°.</li>
	<li>Następnie użyj wiertarki ręcznej, aby wywiercić cztery dodatkowe otwory na śruby kostne: dwa powinny zostać umieszczone przednio, a dwa tylnie (Rysunek 5A). Będą one służyć jako kotwice do przymocowania światłowodów do czaszki (Rysunek 5D). 
	UWAGA: Upewnij się, że otwory są rozmieszczone w wystarczającej odległości od otworów trepanacyjnych pod kątem, aby pomieścić część tulei światłowodu znajdującą się nad czaszką.</li>
	<li>Jak najdelikatniej, za pomocą małego śrubokręta płaskiego, osadź śruby kostne w taki sposób, aby mocno trzymały się w czaszce, ale nie penetrowały mózgu.</li>
	<li>Zaciśnij kaniulę światłowodową w uchwycie kaniuli i umieść ją w uchwycie stereotaktycznym.</li>
	<li>Obróć głowę pod obliczony kąt, pamiętając ponownie, że współrzędne na mikromanipulatorze nie odnoszą się do nowego narzędzia. Jako cel implantacji przyjmij środek otworu trepanacyjnego pod kątem.</li>
	<li>Opuść światłowód, aż będzie on ledwo dotykał opony twardej w centrum otworu trepanacyjnego (Rysunek 5C). Wyzeruj mikromanipulator w osi z, a następnie powoli opuść światłowód do współrzędnej pod kątem D/V (-5,4 zgodnie z przykładem VMN).</li>
	<li>Użyj żelu cyjanoakrylowego, aby połączyć tuleję światłowodu z ipsylateralnymi śrubami kotwiczącymi, a następnie nanieś akcelerator za pomocą końcówki mikropipety (Rysunek 5D).</li>
	<li>Gdy żel cyjanoakrylowy całkowicie stwardnieje, delikatnie poluzuj uchwyt kaniuli i podnieś go, aż znajdzie się powyżej tulei światłowodu.</li>
	<li>Powtórz kroki 8.5–8.9 dla kontralateralnej współrzędnej pod kątem, a następnie ustaw głowę poziomo. Dla dodatkowego zabezpieczenia wykonaj dodatkowe połączenie między dwiema kaniulami światłowodowymi pod kątem za pomocą żelu cyjanoakrylowego i akceleratora (Rysunek 5D).</li>
	<li>Przygotuj niewielką, stosunkowo cienką ilość cementu dentystycznego. Nałóż go na powierzchnię czaszki, upewniając się, że śruby kotwiczące i podstawy kaniul światłowodowych są całkowicie przykryte. Pozostaw wystarczającą część tulei czystą w celu późniejszego połączenia z patch cordami światłowodowymi.</li>
	<li>Gdy cement całkowicie wyschnie, wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce rekonwalescencyjnej z wsparciem termicznym. Pozwól jej dojść do siebie i przenieś do klatki domowej, gdy stanie się czujna, mobilna i zacznie się pielęgnować.</li>
</ol>
9. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Przez 3 dni po operacji codziennie monitorować zwierzęta pod kątem zachowania, postawy, aktywności i pielęgnacji oraz prowadzić rejestr spożycia pokarmu i masy ciała.</li>
	<li>W przypadku wystąpienia u zwierząt jakichkolwiek ogólnych wskaźników bólu lub złego stanu zdrowia, skonsultować się z lekarzem weterynarii.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem badań behawioralnych zapewnić myszom co najmniej 2 tygodnie na rekonwalescencję oraz ekspresję wirusa.</li>
</ol>
10. Optogenetyka
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia badań optogenetycznych należy odnieść się do pracy Sidor et al.8.</li>
	<li>Po zakończeniu badań należy zweryfikować ekspresję wirusową oraz rozmieszczenie światłowodów.</li>
</ol>

<ol><li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise%2C+fall%2C+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li>
<li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534(2019).</li>
<li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing%2C+packaging%2C+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783(2016).</li>
<li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653(2015).</li>
<li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food%2C+Water%2C+and+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li>
<li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483(2015).</li>
<li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Scences%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li>
<li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li>
<li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549(2017).</li>
<li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+topic+in+optogenetics%3A+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ostatnie postępy w neurobiologii pomogły w zaawansowanym wglądzie i zrozumieniu aktywności i funkcji obwodów neurologicznych mózgu. Obejmuje to zastosowanie technologii optogenetycznych i chemogenetycznych do aktywacji lub wyciszenia dyskretnych populacji neuronów i ich miejsc projekcji in vivo. Ostatnio obejmowało to opracowanie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (np. GCaMP, RCaMP) i innych biosensorów fluorometrycznych (np. dopaminy, noradrenaliny) do rejestrowania in vivo aktywności neuronalnej w określonym typi...

Neuronalna kontrola zachowania, odżywiania i metabolizmu obejmuje koordynację wysoce złożonych, integracyjnych i nadmiarowych obwodów nerwowych. Głównym celem dziedziny neuronauki jest analiza związku między strukturą a funkcją obwodów neuronalnych. Chociaż klasyczne narzędzia neurobiologiczne (tj. zmiany chorobowe, miejscowe zastrzyki farmakologiczne i stymulacja elektryczna) odkryły istotną wiedzę na temat roli określonych regionów mózgu, które kontrolują zachowanie i metabolizm, narzędzia te są ograniczone przez brak swoistości i odwracalności1.
Ostatnie postępy w dziedzinie neuronauki znacznie poprawiły zdolność do badania i manipulowania funkcją obwodu w sposób specyficzny dla typu komórki z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Podejścia Optogenetic2 i chemogenetic3 pozwalają na szybką i odwracalną manipulację aktywnością w genetycznie zdefiniowanych typach komórek swobodnie poruszających się zwierząt. Optogenetyka polega na wykorzystaniu światłoczułych kanałów jonowych, zwanych rodopsynami kanałowymi, do kontrolowania aktywności neuronalnej. Kluczem do tej techniki jest dostarczanie genów rodopsyny kanałowej i źródła światła do aktywacji opsyny. Powszechną strategią dostarczania genów jest połączenie 1) genetycznie zmodyfikowanych myszy wykazujących ekspresję rekombinazy Cre w dyskretnych neuronach oraz 2) zależnych od Cre wektorów wirusowych kodujących rodopsynę kanałową.
Podczas gdy optogenetyka dostarcza eleganckiego, bardzo precyzyjnego środka do kontrolowania aktywności neuronalnej, metoda ta jest uzależniona od udanego stereotaktycznego mikrowstrzykiwania wektora wirusowego i umieszczenia światłowodu w określonym obszarze mózgu. Chociaż procedury stereotaktyczne są powszechne w nowoczesnych laboratoriach neurologicznych (i istnieje kilka doskonałych protokołów opisujących tę procedurę)4,5,6, będąc w stanie konsekwentnie i powtarzalnie celować w dyskretne obszary mózgu wzdłuż linii środkowej (tj. podwzgórze przyśrodkowe, obszar mózgu krytyczny dla regulacji funkcji homeostatycznych7) wiąże się z dodatkowymi wyzwaniami. Wyzwania te obejmują unikanie zatoki strzałkowej górnej, trzeciej komory i sąsiednich jąder podwzgórza. Ponadto istnieją znaczne ograniczenia przestrzenne związane z obustronnym wszczepianiem sprzętu, który jest wymagany do badań nad inhibicją. Mając na uwadze te wyzwania, niniejszy protokół przedstawia modyfikowalną procedurę celowania w dyskretne obszary mózgu za pomocą kątowego podejścia stereotaktycznego.

<table><tbody><tr><td>Kaniule światłowodowe</td><td>Soczewki Doric MFC_200</td><td>/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td><td>Konfigurowalny</td></tr><tr><td>system wyrównywania stereotaktycznego Kopf Model 1900</td><td>Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1900-51 Centralny miernik wysokości</td><td>Kopf</td><td>Model 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1905 Wskaźnik wyrównania</td><td>Kopf</td><td>Model 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1911 Wiertarka stereotaktyczna</td><td>Kopf</td><td>Model 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1915 Luneta centrująca</td><td>Kopf</td><td>Model 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1922 60-stopniowe nauszniki bez pękania</td><td>Kopf</td><td>Model 1922</td> Kopf Model 1923-B <td></td></tr><tr><td>Mysz Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem</td><td>Kopf</td><td>Model 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1940 Mikromanipulator</td><td>Kopf</td><td>Model 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 System mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>kostne myszy</td><td>Tworzywa sztuczne Jeden</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt kaniuli, skuwka 1,25 mm</td> Wiertło chirurgiczne <td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Punkt komórkowy Scientific</td><td>Idealne mikrowiertło</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Chirurgia stereotaktyczna jest niezbędnym narzędziem w nowoczesnym laboratorium neurologicznym. Jednak zdolność do precyzyjnego i dokładnego celowania w trudno dostępne obszary mózgu nadal stanowi wyzwanie, szczególnie w przypadku celowania w struktury mózgu wzdłuż linii środkowej. Wyzwania te obejmują unikanie zatoki strzałkowej górnej i trzeciej komory oraz zdolność do konsekwentnego celowania w selektywne i dyskretne jądra mózgu. Ponadto bardziej zaawansowane techniki neurobiologiczne (np. optogenetyka, fotometria włókien i obrazowanie dwufotonowe) polegają na ukierunkowanym wszczepianiu znacznego sprzętu do mózgu, a częstą przeszkodą są ograniczenia przestrzenne. Przedstawiono tutaj modyfikowalny protokół stereotaktycznego celowania w struktury mózgu gryzoni przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Można go dostosować do 1) modeli mysich lub szczurzych, 2) różnych technik neurobiologicznych i 3) wielu regionów mózgu. Jako reprezentatywny przykład obejmuje obliczenie współrzędnych stereotaktycznych do celowania w jądro brzuszno-przyśrodkowe myszy podwzgórza (VMN) w eksperymencie hamowania optogenetycznego. Procedura ta rozpoczyna się od obustronnego mikrowstrzyknięcia wirusa związanego z adenowirusem (AAV) kodującego światłoczuły kanał chlorkowy (SwiChR++) do modelu myszy zależnego od Cre, a następnie od obustronnej implantacji kaniul światłowodowych pod kątem. Korzystając z tego podejścia, odkrycia pokazują, że aktywacja podzbioru neuronów VMN jest wymagana do nienaruszonej odpowiedzi przeciwregulacyjnej glukozy na hipoglikemię wywołaną insuliną.

Niniejszy protokół opisuje procedurę chirurgiczną do badań optogenetycznych w celu zbadania roli neuronów VMN podwzgłowia w kontroli glikemii9. W pierwszej kolejności zastosowano standardowe (niekątowe) podejście stereotaktyczne do obustronnej mikroiniekcji wirusa inhibitoryjnej channelrodopsyny do VMN. Choć podejście kątowe byłoby również odpowiednie, wybrano podejście standardowe (niekątowe), ponieważ jest ono wystarczające do celowania w interesujący obszar mózgu oraz stanowi prostą, niezawodną...

Opisana tutaj jest procedura stereotaktyczna, która może celować w trudne i trudno dostępne obszary mózgu (ze względu na ograniczenia przestrzenne) przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Protokół ten można dostosować zarówno do modeli mysich, jak i szczurzych i może być stosowany do różnych zastosowań neuronaukowych, w tym implantacji kaniuli i mikroiniekcji konstruktów wirusowych.

Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to adaptowalna procedura stereotaktyczna, która może być stosowana zarówno u myszy, jak i szczurów, i może być stosowana do wielu nowych technik neuronaukowych. Główną zaletą tej elastycznej procedury stereotaktycznej jest jej zdolność do celowania w trudne i trudno dostępne obszary mózgu. Procedurę zademonstruje Chelsea Faber, młoda, utalentowana pracownica naukowa z tytułem doktora w laboratorium.Po upewnieniu się, że rama i mikromanipulator zostały skalibrowane, umieść środkowy wysokościomierz w gnieździe podstawy uchwytu głowicy. Zamocuj lunetę centrującą w uchwycie narzędziowym i skieruj lunetę w dół. Dostosuj położenie mikromanipulatora, aż krzyż nitkowy zostanie wyrównany i skupiony na krzyżu nitkowym miernika, a następnie umieść nauszniki w uchwytach tak, aby linie wskaźnika po obu stronach znajdowały się na zero.Użyj pokręteł przyśrodkowo-bocznych i przednio-tylnych na uchwycie głowy, aby wyśrodkować nauszniki w płaszczyznach X i Y nad krzyżem celownika środkowego wysokościomierza. Aby wyrównać pozycję belki dousznej w osi Z, zdejmij nauszniki z uchwytu i wyjmij środkowy miernik wysokości. Następnie wymień nauszniki i ponownie wyśrodkuj pręty na zero.Następnie ponownie spójrz w dół lunety i użyj odpowiednio pokręteł przesunięcia w pionie i pochylenia koronalnego, aby opuścić i obrócić nauszniki, aż celownik lunety pozostanie wyśrodkowany między paskami usznymi podczas rotacji koronalnej. Aby wyrównać środkową oś obrotu dla współrzędnych kątowych, zabezpiecz lunetę centrującą w uchwycie narzędziowym i ustaw mikromanipulator na obliczonej współrzędnej. Zwróć uwagę, że współrzędna prawo/lewo dla implantacji pod kątem odpowiada długości boku A. Patrząc w dół lunety, zaznacz tę współrzędną, aby reprezentowała punkt, w którym kaniula wejdzie do mózgu, po obróceniu głowy.Ustaw mikromanipulator nad linią środkową i użyj pokrętła nachylenia korony, aby obrócić głowę do obliczonego kąta. Jeśli krzyż nitkowy lunety nie pokrywa się ze znacznikiem odniesienia, użyj pokrętła przesuwu w pionie, aby wyregulować pozycję głowicy w osi Z, aż krzyż nitkowy zrówna się jak najbliżej znaku. W tym momencie dowolny punkt obrotu powinien być wyrównany ze środkiem obrotu stereotaksu.Obróć głowicę z powrotem do pozycji koronalnej o zerowym stopniu przed przystąpieniem do kolejnych etapów wiercenia i mikroiniekcji. Po wykonaniu mikroiniekcji przywróć głowę do pozycji zerowego stopnia i za pomocą wiertarki ręcznej umieść dwa otwory, z przodu, i dwa otwory, z tyłu, wystarczająco daleko od kątowych otworów zadziorów współrzędnych, aby pomieścić część okucia światłowodu, która znajduje się nad czaszką. Po wywierceniu wszystkich otworów użyj małego płaskiego śrubokręta, aby włożyć kościane tak delikatnie, jak to możliwe, tak aby mocno przylegały do czaszki, nie penetrując mózgu.Zaciśnij kaniulę światłowodową w uchwycie kaniuli i umieść uchwyt kaniuli w uchwycie narzędziowym. Obróć głowicę do obliczonego kąta, zwracając uwagę, że współrzędne mikromanipulatora nie mają zastosowania do nowego narzędzia. Użyj środka ustawionych pod kątem otworów zadziorów jako celu implantacji.Opuść światłowód, aż dotknie opony twardej w środku otworu zadziorów i wyzeruj mikromanipulator w osi Z. Powoli opuść światłowód do współrzędnej kąta grzbietowego brzusznego, a następnie użyj żelu cyjanoakrylowego, aby połączyć tuleję światłowodową ze kotwiącymi ipsilateral. Użyj końcówki do mikropipety, aby nałożyć przyspieszacz.Gdy żel całkowicie stwardnieje, delikatnie poluzuj i podnieś uchwyt kaniuli, aż będzie wolny od skuwki. Wszczep drugi światłowód do przeciwległej współrzędnej kątowej, a następnie wypoziomuj głowę. Dla dodatkowego bezpieczeństwa użyj żelu cyjanoakrylowego i akceleratora, aby wykonać dodatkowe połączenie między dwiema kątowymi kaniulami światłowodowymi i nałóż niewielką, stosunkowo cienką ilość cementu dentystycznego na powierzchnię czaszki, uważając, aby dokładnie pokryć kotwiące i podstawę kaniul światłowodowych.Aby zbadać rolę neuronów jądra brzuszno-przyśrodkowego podwzgórza w kontroli glikemii, w tej reprezentatywnej analizie zastosowano standardowe, niekątowe, stereotaktyczne podejście do obustronnej mikroiniekcji wirusa rodopsyny kanału hamującego do jądra brzuszno-przyśrodkowego. Biorąc pod uwagę bliskość jądra brzuszno-przyśrodkowego do linii środkowej, ograniczenia przestrzenne nie pozwalały na implantację obustronnych światłowodów bez kąta, co wymagało opracowania chirurgicznej strategii precyzyjnego wszczepiania światłowodów pod kątem. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to po prostu uzbroić się w cierpliwość i nie spieszyć się, ponieważ konsekwentne i dokładne przydzielanie współrzędnych ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.Procedura ta może być dostosowana i zastosowana do każdej metody neuronaukowej wymagającej mikroiniekcji lub implantacji do mózgu gryzonia, w tym chemogenetyki, optogenetyki i metod fotometrii włókien.

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół zawiera projekty i oprogramowanie niezbędne do ulepszenia istniejącego instrumentu stereotaktycznego do robotycznego (sterowanego numerycznie; CNC) instrument stereotaktyczny za około 1,000 USD (bez wiertarki).

Budowa zrobotyzowanego instrumentu stereotaktycznego o otwartym kodzie źródłowym

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Stereotaktyczna elektroencefalografia (SEEG) jest techniką operacyjną stosowaną w chirurgii epilepsji, która pomaga zlokalizować ogniska napadów. Jest to również wyjątkowa okazja do zbadania funkcji mózgu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób SEEG może być wykorzystany do badania procesów poznawczych u ludzi.

Badanie funkcji głębokich struktur korowych i podkorowych za pomocą elektroencefalografii stereotaktycznej: lekcje z przedniej kory obręczy

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Metodologia SEEG jest uproszczona i przyspieszona dzięki robotowi stereotaktycznemu. Należy zwrócić szczególną uwagę na rejestrację przedoperacyjnego wolumetrycznego rezonansu magnetycznego pacjenta przed użyciem robota na sali operacyjnej. Robot usprawnia procedurę, prowadząc do skrócenia czasu operacji i dokładnych implantacji.

Technika operacyjna i niuanse metodologii stereoelektroencefalograficznej (SEEG) z wykorzystaniem zrobotyzowanego systemu naprowadzania stereotaktycznego

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Ten protokół określa kroki niezbędne do dostarczenia genu poprzez skoncentrowanie ultradźwięków na otwarciu bariery krew-mózg (BBB), ocenę wynikowej ekspresji genu oraz pomiar aktywności neuromodulacyjnej receptorów chemogenetycznych za pomocą testów histologicznych.

Zogniskowane ultradźwięki indukowane otwieraniem bariery krew-mózg w celu celowania w struktury mózgu i oceny neuromodulacji chemogenetycznej

Przedstawiony tutaj protokół demonstruje stereotaksję do mózgu świni za pomocą infuzji wspomaganych konwekcją, z nawigacją wizualizacji rezonansu magnetycznego (MRI) w czasie rzeczywistym i wizualizacją dystrybucji infuzji w czasie rzeczywistym.

Stereotaksja sterowana rezonansem magnetycznym do infuzji do mózgu świni

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Ten protokół opisuje metodę umieszczania elektrod sterowanych neuronami do ogniskowej, przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) podawanej podczas funkcjonalnego rezonansu magnetycznego (fMRI).

Neuronavigated Zogniskowana przezczaszkowa stymulacja prądem stałym podawana podczas funkcjonalnego rezonansu magnetycznego

Poznaj adaptacyjną metodę stereotaktyczną do precyzyjnego docierania do trudno dostępnych regionów mózgu u myszy i szczurów. Protokół umożliwia implantację kanul oraz mikroinjekcje wirusowych konstruktów w badaniach neurobiologicznych.

Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych

Przeglądaj więcej filmów