Adaptacyjne kątowe podejście stereotaktyczne dla wszechstronnych technik neurobiologicznych
7 maja 2020
Opisana tutaj jest procedura stereotaktyczna, która może celować w trudne i trudno dostępne obszary mózgu (ze względu na ograniczenia przestrzenne) przy użyciu kątowego podejścia koronalnego. Protokół ten można dostosować zarówno do modeli mysich, jak i szczurzych i może być stosowany do różnych zastosowań neuronaukowych, w tym implantacji kaniuli i mikroiniekcji konstruktów wirusowych.
Protokół ten jest istotny, ponieważ jest to adaptowalna procedura stereotaktyczna, która może być stosowana zarówno u myszy, jak i szczurów, i może być stosowana do wielu nowych technik neuronaukowych. Główną zaletą tej elastycznej procedury stereotaktycznej jest jej zdolność do celowania w trudne i trudno dostępne obszary mózgu. Procedurę zademonstruje Chelsea Faber, młoda, utalentowana pracownica naukowa z tytułem doktora w laboratorium.
Po upewnieniu się, że rama i mikromanipulator zostały skalibrowane, umieść środkowy wysokościomierz w gnieździe podstawy uchwytu głowicy. Zamocuj lunetę centrującą w uchwycie narzędziowym i skieruj lunetę w dół. Dostosuj położenie mikromanipulatora, aż krzyż nitkowy zostanie wyrównany i skupiony na krzyżu nitkowym miernika, a następnie umieść nauszniki w uchwytach tak, aby linie wskaźnika po obu stronach znajdowały się na zero.
Użyj pokręteł przyśrodkowo-bocznych i przednio-tylnych na uchwycie głowy, aby wyśrodkować nauszniki w płaszczyznach X i Y nad krzyżem celownika środkowego wysokościomierza. Aby wyrównać pozycję belki dousznej w osi Z, zdejmij nauszniki z uchwytu i wyjmij środkowy miernik wysokości. Następnie wymień nauszniki i ponownie wyśrodkuj pręty na zero.
Następnie ponownie spójrz w dół lunety i użyj odpowiednio pokręteł przesunięcia w pionie i pochylenia koronalnego, aby opuścić i obrócić nauszniki, aż celownik lunety pozostanie wyśrodkowany między paskami usznymi podczas rotacji koronalnej. Aby wyrównać środkową oś obrotu dla współrzędnych kątowych, zabezpiecz lunetę centrującą w uchwycie narzędziowym i ustaw mikromanipulator na obliczonej współrzędnej. Zwróć uwagę, że współrzędna prawo/lewo dla implantacji pod kątem odpowiada długości boku A. Patrząc w dół lunety, zaznacz tę współrzędną, aby reprezentowała punkt, w którym kaniula wejdzie do mózgu, po obróceniu głowy.
Ustaw mikromanipulator nad linią środkową i użyj pokrętła nachylenia korony, aby obrócić głowę do obliczonego kąta. Jeśli krzyż nitkowy lunety nie pokrywa się ze znacznikiem odniesienia, użyj pokrętła przesuwu w pionie, aby wyregulować pozycję głowicy w osi Z, aż krzyż nitkowy zrówna się jak najbliżej znaku. W tym momencie dowolny punkt obrotu powinien być wyrównany ze środkiem obrotu stereotaksu.
Obróć głowicę z powrotem do pozycji koronalnej o zerowym stopniu przed przystąpieniem do kolejnych etapów wiercenia i mikroiniekcji. Po wykonaniu mikroiniekcji przywróć głowę do pozycji zerowego stopnia i za pomocą wiertarki ręcznej umieść dwa otwory, z przodu, i dwa otwory, z tyłu, wystarczająco daleko od kątowych otworów zadziorów współrzędnych, aby pomieścić część okucia światłowodu, która znajduje się nad czaszką. Po wywierceniu wszystkich otworów użyj małego płaskiego śrubokręta, aby włożyć kościane tak delikatnie, jak to możliwe, tak aby mocno przylegały do czaszki, nie penetrując mózgu.
Zaciśnij kaniulę światłowodową w uchwycie kaniuli i umieść uchwyt kaniuli w uchwycie narzędziowym. Obróć głowicę do obliczonego kąta, zwracając uwagę, że współrzędne mikromanipulatora nie mają zastosowania do nowego narzędzia. Użyj środka ustawionych pod kątem otworów zadziorów jako celu implantacji.
Opuść światłowód, aż dotknie opony twardej w środku otworu zadziorów i wyzeruj mikromanipulator w osi Z. Powoli opuść światłowód do współrzędnej kąta grzbietowego brzusznego, a następnie użyj żelu cyjanoakrylowego, aby połączyć tuleję światłowodową ze kotwiącymi ipsilateral. Użyj końcówki do mikropipety, aby nałożyć przyspieszacz.
Gdy żel całkowicie stwardnieje, delikatnie poluzuj i podnieś uchwyt kaniuli, aż będzie wolny od skuwki. Wszczep drugi światłowód do przeciwległej współrzędnej kątowej, a następnie wypoziomuj głowę. Dla dodatkowego bezpieczeństwa użyj żelu cyjanoakrylowego i akceleratora, aby wykonać dodatkowe połączenie między dwiema kątowymi kaniulami światłowodowymi i nałóż niewielką, stosunkowo cienką ilość cementu dentystycznego na powierzchnię czaszki, uważając, aby dokładnie pokryć kotwiące i podstawę kaniul światłowodowych.
Aby zbadać rolę neuronów jądra brzuszno-przyśrodkowego podwzgórza w kontroli glikemii, w tej reprezentatywnej analizie zastosowano standardowe, niekątowe, stereotaktyczne podejście do obustronnej mikroiniekcji wirusa rodopsyny kanału hamującego do jądra brzuszno-przyśrodkowego. Biorąc pod uwagę bliskość jądra brzuszno-przyśrodkowego do linii środkowej, ograniczenia przestrzenne nie pozwalały na implantację obustronnych światłowodów bez kąta, co wymagało opracowania chirurgicznej strategii precyzyjnego wszczepiania światłowodów pod kątem. Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to po prostu uzbroić się w cierpliwość i nie spieszyć się, ponieważ konsekwentne i dokładne przydzielanie współrzędnych ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.
Procedura ta może być dostosowana i zastosowana do każdej metody neuronaukowej wymagającej mikroiniekcji lub implantacji do mózgu gryzonia, w tym chemogenetyki, optogenetyki i metod fotometrii włókien.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę stereotaktyczną wykorzystującą ukośny dostęp korony do wskazywania trudno dostępnych obszarów mózgu zarówno w modelach mysich, jak i szczurzych. Ten adaptacyjny protokół może być stosowany w różnych zastosowaniach neuronaukowych, w tym w implantacji kaniulek i mikroiniekcjach konstrukcji wirusowych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Techniki neurochirurgiczne
- Eksperymentalne interwencje w modelach zwierzęcych
Tło
- Procedura umożliwia precyzyjne wskazywanie wymagających obszarów mózgu.
- Może być dostosowana do kilku technik w neuronauce.
- Przydatność dla zarówno mysich, jak i szczurzych modeli zwiększa przydatność.
- Wspiera postęp w technikach wymagających mikroiniekcji lub implantacji.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody dostępu i manipulacji trudnymi obszarami mózgu.
- Ułatwienie różnych zastosowań w neuronauce, takich jak optogenetyka i chemogenetyka.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy dążących do wdrożenia podobnych technik.
Stosowane metody
- Metoda obejmuje stereotaktyczną operację dla ukierunkowanych procedur mózgu.
- Zobacz zarówno mysie, jak i szczure modele stosowane do procedur takich jak implantacja kaniulek.
- Nie są wspomniane żadne przepływy multiomiki.
- Kluczowe kroki obejmują kalibrację mikromanipulatora i wyrównanie współrzędnych dla precyzyjnej implantacji.
- Protokół podkreśla precyzję pacjenta w przypisywaniu współrzędnych dla udanych wyników.
Główne wyniki
- Protokół pomyślnie opisuje kroki niezbędne do ukośnej implantacji i mikroiniekcji.
- Ważne szczegóły proceduralne zapewniają dokładność w wskazywaniu określonych obszarów mózgu.
- Wykazuje zdolność do przeprowadzania dwustronnych implantów światłowodowych mimo ograniczeń przestrzennych.
- Podkreśla znaczenie starannego planowania i wykonywania w interwencjach neurochirurgicznych.
Wnioski
- Ten protokół pokazuje metodę implantacji urządzeń w trudno dostępnych obszarach mózgu.
- Ułatwia różne metody neuronaukowe, zwiększając możliwości badawcze.
- Implikacje rozciągają się na zrozumienie reakcji behawioralnych i fizjologicznych w ukierunkowanych regionach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeting deep brain structures with precision remains a critical bottleneck in neuroscience-driven target validation, particularly for midline-adjacent nuclei where conventional stereotactic approaches fail due to vascular and ventricular constraints. This adaptable angled approach enables reliable access to otherwise inaccessible regions, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in preclinical models. By facilitating consistent hardware implantation for optogenetics, chemogenetics, and fiber photometry, it enhances predictive confidence in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutically relevant nuclei such as the hypothalamic ventromedial nucleus in glucose homeostasis models.
- Operational Value: Supports bilateral viral vector delivery and fiberoptic implantation in spatially constrained brain regions.
- Strategic Value: Reduces failure rates in target modulation experiments due to inaccurate targeting.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible surgical platforms for downstream neuromodulation assays.
- Operational Value: Ensures consistent electrode or cannula placement across animals, reducing variability in readouts.
- Strategic Value: Enables scalable implementation of intracranial techniques in discovery screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains anatomical fidelity when modeling human brain circuits in rodent systems.
- Operational Value: Supports longitudinal studies requiring stable intracranial hardware.
- Strategic Value: Improves reproducibility of behavioral and physiological endpoints in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery biology phase, enabling precise target engagement before progressing to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via targeted neuronal inhibition or activation in disease-relevant circuits.
- Screening: Delivers assay-ready models with verified intracranial targeting for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable neural activity or behavioral outputs linked to precise anatomical targeting.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation through consistent target modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable surgical framework applicable across multiple neuroscience techniques and brain targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by minimizing off-target effects from misplaced implants.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinate systems and angle-adjusted implantation.
- Strategic Value: Reduces resource waste from failed experiments due to inaccurate targeting.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on reliable target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and coordinate system calibration.
- Dependent on precise micromanipulator alignment and angle adjustment capabilities.
- Necessitates validation of implantation accuracy via histological or imaging confirmation.
- Must account for species-specific brain anatomy when adapting between mouse and rat models.
- Relies on meticulous procedural execution to avoid tissue damage during angled tract insertion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Preparing the Stereotax for Angled Procedure
2:02
Aligning the Central Axis of Rotation for Angled Procedure
3:09
Fiberoptic Implantation
5:05
Results: Representative Bilateral Ventromedial Hypothalamus Targeting
5:44
Conclusion
