Name: Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę hodowli organoidów nerkowych na błonie chorioallantoidalnej kurczaka, która zwiększa unaczynienie i przeżywalność tkanek. Technika ta umożliwia wysokiej jakości obrazowanie mikroskopowe rozwoju nerki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez Suomen Akatemia (Akademię Fińską) (206038, 121647, 250900, 260056; Grant Centrum Doskonałości 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Fińskie Stowarzyszenie Nerek i Wątroby, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Szwedzka Fundacja Kulturalna w Finlandii, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Fińskie Towarzystwo Walki z Rakiem), Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013; grant FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608), oraz Horyzont 2020 działania "Skłodowska-Curie", innowacyjna sieć szkoleniowa "RENALTRACT", numer identyfikacyjny projektu 642937. Autorzy dziękują Pauli Haipus, Johannie Kekolahti-Liias i Hannele Härkman za pomoc techniczną.
Rysunki 3, 4 i Film 2 są przedrukowane za zgodą Działu Rozwoju.

Opieka nad zwierzętami i procedury były zgodne z fińskim ustawodawstwem krajowym dotyczącym wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych, Europejską Konwencją o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych (ETS 123) oraz Dyrektywą UE 86/609/EWG.
1. Produkcja minizbiorników do hodowli embrionalnych nerek myszy i organoidów nerkowych na CAM kurczaka i przeprowadzanie eksperymentów ksenotransplantacyjnych
<ol>
	<li>Stosować wkładki do hodowli komórkowych transwell przeznaczone do płytek 6-dołkowych lub 12-dołkowych. 
	UWAGA: W zależności od konkretnego eksperymentu można użyć dużych lub małych minizbiorników. Najlepiej jest używać małych minizbiorników do ksenoprzeszczepu do ośmiu nerek embrionalnych lub gdy kilka minizbiorników zostanie umieszczonych na tym samym zarodku kurczaka (np. próbki eksperymentalne i kontrolne na tym samym CAM kurczaka).</li>
	<li>Wytnij boki wkładek za pomocą obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego z tarczą piły tarczowej lub piły ręcznej, aby utworzyć plastikowy pierścień o wysokości 2 mm z przymocowaną do niego przepuszczalną membraną.</li>
	<li>Wypoleruj krawędzie tych minizbiorników skalpelem lub ostrym nożem.</li>
	<li>Sterylizuj minizbiorniki w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj minizbiorniki w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozwól im wyschnąć w okapie laminarnym.</li>
	<li>Przepłukać minizbiorniki w PBS i pożywce hodowlanej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy/10% FBS/1% penicylina-streptomycyna).</li>
	<li>Umieścić zbiornik na szalce Petriego, na kropli (600 μl/400 μl) pożywki hodowlanej, z membraną skierowaną do góry.</li>
	<li>Wypreparowane ex vivo nerki embrionalne lub organoidy nerkowe ułożyć równomiernie na błonie za pomocą pipety lub szklanej rurki kapilarnej. Unikaj pozostawiania dużej ilości płynu wokół nerek.</li>
	<li>Pozostawić próbki do membrany na 2–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Na małej wkładce można umieścić do ośmiu embrionalnych nerek myszy E11.5 lub organoidów nerkowych. Duża wkładka jest zalecana, jeśli do ksenotransplantacji będą używane większe fragmenty tkanki embrionalnej lub mieszanina komórkowo-hydrożelowa na większej powierzchni CAM.</li>
	<li>Z inkubatora hodowli komórkowych należy wyjąć 8-dniowe kurczaki embrionalne hodowane ex ovo przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami12,13.</li>
	<li>Przenieś minizbiorniki do CAM tak, aby przeszczepy były skierowane w stronę CAM, a membrana je pokrywała. Umieść minizbiorniki na obrzeżach CAM, tak aby nie zakrywały zarodka kurczaka. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z mniejszych minizbiorników wykonanych z wkładek transwell dla płytek 12-dołkowych, na jednym CAM można umieścić do trzech minizbiorników.</li>
	<li>Dodać 500 μl (wkładka 6-dołkowa) lub 300 μl (wkładka 12-dołkowa) pożywki hodowlanej do minizbiorników.</li>
	<li>Próbki należy hodować na CAM dla kurczaków przez maksymalnie 9 dni. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną w minizbiornikach. 
	UWAGA: Unaczynienie próbek można zaobserwować już po 24–48 godzinach od przeszczepienia.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie płyt projektowanych na zamówienie i ustawianie kultur FiZD
<ol>
	<li>Wywierć otwory o średnicy 20 mm w dnie płytki 6-dołkowej. 
	UWAGA: Do eksperymentów FiZD należy użyć 6 płytek dołkowych o głębokości studzienki 16 mm (określonej w Tabeli Materiałów).</li>
	<li>Wypoleruj krawędzie otworów (szczególnie na górnej stronie) za pomocą wiertarki elektrycznej z wiertłem pogłębiającym, skalpela lub ostrego noża.</li>
	<li>Sterylizuj płytki w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj płytki w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 mm x 22 mm należy dokładnie umyć 70% etanolem lub wyczyścić zgodnie z opublikowanym protokołem przez Saarela et al.11.</li>
	<li>Przyklej szkiełka nakrywkowe do górnej strony otworów w płytkach 6-dołkowych za pomocą nietoksycznego kleju tkankowego. Nałóż klej wokół otworu i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe, aby go zakryć. Pozostaw klej do wyschnięcia.</li>
	<li>Sprawdź płytki pod mikroskopem stereoskopowym i w razie potrzeby usuń nadmiar zaschniętego kleju z powierzchni szkiełek nakrywkowych. 
	UWAGA: Sprawdź, czy nad szkiełkiem nakrywkowym nie ma kleju, aby zapewnić równomierne ściskanie próbek.</li>
	<li>Wymieszaj kulki polistyrenowe (wielkość cząstek 70 μm) z równą objętością hydrożelu. Wystarczająca jest objętość 50–100 μl na studzienkę. 
	UWAGA: Mieszaninę hydrożelu i kulek polistyrenowych należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Umieść wkładkę transwell pod mikroskopem preparacyjnym z membraną do góry.</li>
	<li>Próbki (np. zarodkowe nerki ex vivo lub organoidy nerkowe) należy równomiernie ułożyć na błonie.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj mieszaninę hydrożelu i kulek polistyrenowych obok próbek, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych tkanek.</li>
	<li>Odwróć wkładkę transwell tak, aby membrana z zamontowanymi na niej próbkami była skierowana w dół.</li>
	<li>Delikatnie umieść wkładkę w studzience zmodyfikowanej płytki 6-dołkowej i delikatnie dociśnij ją, aby próbki zostały ściśnięte do poziomu kulek. 
	UWAGA: Śledź postęp kompresji za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Jedną ręką przytrzymaj wkładkę lekko dociśniętą do studni i przymocuj ją do płytki, topiąc plastik lutownicą w trzech punktach na obrzeżach wkładki.</li>
	<li>Gdy wkładka jest przymocowana do płytki, dodaj 2 ml pożywki hodowlanej (DMEM/10% FBS/1% penicyliny-streptomycyny) do dołka i kontynuuj składanie pozostałych studzienek na płytce w ten sam sposób.</li>
	<li>Przenieś gotową płytkę do inkubatora na stoliku mikroskopu odwróconego w celu obrazowania poklatkowego.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe próbek przy użyciu odpowiednich ustawień eksperymentalnych. 
	UWAGA: Zmiana pożywki hodowlanej w dołkach płytki podczas eksperymentów poklatkowych nie jest wymagana, ale można ją łatwo wykonać przez otwory po bokach wkładu.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono dwa szczegółowe protokoły, które udoskonalają klasyczną metodę organotypowej hodowli nerek i umożliwiają unaczynienie, rozszerzony rozwój oraz optymalne obrazowanie 4D (tj. obraz 3D i czas) zarodkowych nerek i organoidów ex vivo. W tej sekcji przedstawiono krytyczne kroki metod i omówiono rozwiązywanie problemów.
Istotną różnicą między innymi metodami hodowli CAM a tą ulepszoną metodą hodowli CAM kurcząt jest zastosowanie specjalnie zaprojektowanych minizbiorników w ksenoprzeszcz...

Organotypowa hodowla nerek embrionalnych stała się ważnym modelem do badania nefrostenezy dziesiątki lat temu1,2,3. Organoidy nerkowe reprezentują zaawansowany system modelowy do badania rozwoju zdrowych i chorych nerek4. Główną wadą obu metod jest jednak to, że żadna z nich nie podsumowuje głównej funkcji nerek: filtracji krwi. Nefrony i układ naczyniowy nerek rozwijają się w organoidach nerkowych i kulturach organotypowych podobnie jak we wczesnym stadium rozwoju in vivo; Jednak kłębuszki nerkowe powstałe in vitro pozostają anaczyniowe5. Unaczynienie nerek zarodkowych ex vivo i organoidów nerkowych wykazano wcześniej w eksperymentach transplantacyjnych tylko w warunkach in vivo. Na przykład, przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych organoidów nerkowych pochodzących z komórek macierzystych pod mysią torebkę nerkową umożliwia rozwój nefronów w organoidzie do etapu funkcjonalnego6.
Pośrednim podejściem między kulturami czysto in vitro a metodami transplantacji in vivo jest ksenotransplantacja do CAM ptasich embrionów. Unaczynienie nienaruszonej zawiązki nerki myszy wykazano już wcześniej przy użyciu tego systemu7,8. Wykazano jednak również, że unaczynienie nerek w mysiej nerce po ksenoprzeszczepie pochodziło ze śródbłonka gospodarza, a nie z graft9. Obserwacja ta znacznie zmniejszyła potencjał chimerycznych (ptasich ssaków) modeli embrionalnej nerki do badania rozwoju naczyń nerkowych, ponieważ warunki eksperymentalne nie pozwalały na przeżycie komórek śródbłonka pochodzących od dawcy.
W pierwszej części tego protokołu przedstawiona jest ulepszona metoda hodowli embrionalnych nerek myszy na CAM jaj ptaków, łącząca warunki mikrośrodowiskowe hodowli organotypowej i ksenotransplantacji. Główne ulepszenie w stosunku do poprzednich metod polega na tym, że zamiast umieszczać embrionalne nerki myszy i organoidy nerkowe bezpośrednio na CAM, obszar implantacji jest pokryty przepuszczalnymi minizbiornikami wypełnionymi pożywką, które zaopatrują przeszczepioną tkankę w składniki odżywcze i chronią ją przed wysuszeniem. Wskaźnik powodzenia eksperymentów znacznie wzrasta i poprawiają się warunki rozwoju naczyń krwionośnych pochodzących od dawcy. Zastosowanie tej metody do hodowli ksenotransplantacyjnych skutkuje rozwojem unaczynienia kłębuszkowego zbudowanego z endogennych komórek śródbłonka pochodzących z nerek dawcy.
Szczegółowa analiza morfogenezy komórkowej to kolejne ważne zastosowanie modeli hodowli nerek. Wcześniej opisywane metody pozyskiwania poklatkowych obrazów kultur nerkowych są wystarczające tylko do analizy ogólnej morfologii i wzorca nerki embrionalnej, ale nie do śledzenia pojedynczych komórek10. Niedawno opisano nowatorską metodę Fixed Z-Direction (FiZD) mającą na celu konfokalne obrazowanie poklatkowe 3D organoidów nerkowych i kultur organotypowych o wysokiej rozdzielczości11. W tej metodzie organoidy i narządy embrionalne są delikatnie ściskane między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a przepuszczalną membraną wkładki transwell w specjalnie zaprojektowanej płytce, aż grubość próbki osiągnie 70 μm, zapewniając optymalne warunki optyczne do obrazowania. W drugiej części metod opisano szczegółowy protokół wytwarzania specjalnie zaprojektowanej płytki oraz konfiguracji eksperymentów FiZD do długoterminowego obrazowania organoidów.

<table><tbody><tr><td>Regulowane wiertło łopatkowe</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>Do wiercenia otworów o średnicy 20 mm</td></tr><tr><td>Automatyczna obracarka do jaj</td><td>OLBA B.V., Holandia</td><td>AT-42</td><td>Do inkubacji jaj przed ustawieniem ex ovo.</td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Temperatura ustawiona na 37&deg; C, 90% wilgotności, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cell Inkubator</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Inkubator do hodowli kurczaków. Temperatura ustawiona na 37&deg; C, wilgotność 90%, 5% CO2</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa Cellstar</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>Głębokość studzienek 16 mm dopasowana do wkładów</td></tr><tr><td>Brzeszczot piły tarczowej do narzędzia obrotowego Dremel Mikroskop</td> konfokalny <td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Płytka wielodołkowa Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell z przepuszczalnymi wkładkami z membrany poliwęglanowej</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Do płytek 6-dołkowych. 40 i mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Wiertło stożkowe</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Do polerowania (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Jednorazowa szklana rurka kapilarna</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Profesjonalny</td><td></td></tr> inkubator jaj o <tr><td>wysokiej zawartości glukozy</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td></tr><tr><td>Compact S84</td><td>Grumbach, Niemcy</td><td>8012</td><td>Do inkubacji jaj przed konfiguracją ex ovo. Temperatura ustawiona na 38&deg; C przy wilgotności względnej powyżej 60%</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Jaja</td> zapłodnione VWR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandia</td><td></td><td>Hy-Line White and Nick</td></tr><tr><td>Chick Płodowa surowica bydlęca Hyklon</td><td></td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Klej Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator nasadowy</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Mycie mini zbiorników.</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe</td><td>Krwinkowe</td><td>1000263-10</td><td>70 &mikro; m średnicy</td></tr><tr><td>Obrotowy system narzędzi wielofunkcyjnych</td><td>Lutownica Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Weller</td><td></td><td>TCP S</td><td>Można również stosować podgrzewaną szklaną kapilarnę</td></tr><tr><td>Thincert 12-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych o 0,4 i mikro; M-pore Polistyren Membrane</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych z 0,4 i mikro; Membrana polistyrenowa m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embrionalne organotypy nerek, a zwłaszcza organoidy nerkowe pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych, są doskonałymi narzędziami do śledzenia procesów rozwojowych i modelowania chorób nerek. Modele są jednak ograniczone brakiem unaczynienia i funkcjonalności. Aby rozwiązać ten problem, opracowano ulepszony protokół dotyczący metody ksenoprzeszczepu komórek i tkanek do błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) ptasiego zarodka w celu unaczynienia i przywrócenia przepływu krwi. Szczepy są pokryte specjalnie wykonanymi minizbiornikami, które mocują próbki do CAM i dostarczają im pożywkę hodowlaną, która chroni przeszczepy przed wysuszeniem. Ulepszona metoda hodowli pozwala ksenoprzeszczepom rosnąć do 9 dni. W pracy opisano również, w jaki sposób zapewnić optymalne warunki do długoterminowego obrazowania konfokalnego organoidów nerkowych i kultur organotypowych z wykorzystaniem wcześniej opublikowanej metody Fixed Z-Direction (FiZD). Metoda ta delikatnie kompresuje narząd zarodkowy lub organoid między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a błoną w dużej ilości podłoża i zapewnia doskonałe warunki do obrazowania przez okres do 12 dni. Razem metody te umożliwiają unaczynienie i przepływ krwi do organoidów nerkowych i organotypowych hodowli nerek z ulepszonym obrazowaniem konfokalnym. Opisane tutaj metody są bardzo korzystne dla badania podstawowych i stosowanych funkcji nerek ex vivo. Obie metody mają zastosowanie do różnych typów tkanek i organoidów.

Przedstawiony tutaj protokół hodowli na błonie chalazowej (CAM) umożliwił bardzo wydajną unaczynienie organoidów nerkowych i nerek embrionalnych w wyniku ksenotransplantacji na CAM kurczaka (Rysunek 1, Film 1). Minireservoiry zawierające pożywkę dostarczały składników odżywczych do tkanki dawcy i chroniły ją przed wysychaniem w okresie poprzedzającym właściwe unaczynienie. Metoda ta zapewniła sprzyjające warunki do wzrostu komórek śródbłonka pochodzących od dawcy. W związku ...

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Hodowla narządów nerkowych i organelli pochodzących z zaprogramowanych komórek macierzystych stanowią doskonałe sposoby badania mechanizmów stojących za rozwojem i chorobą nerek. Obecny system hodowli narządów nie zapewnia jednak przepływu krwi do nerki. Z tego powodu obecne modele są niekompletne i nie oddają głównej funkcji nerki, jaką jest filtracja krwi.W niniejszej publikacji przedstawiono ulepszony protokół hodowli i wizualizacji nerek zarodkowych i organoidów na błonie kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurzego. W naszym nowatorskim układzie eksperymentalnym nakładamy na zalążki nerki przeszczepione na CAM przepuszczalne zbiorniki oznaczające, które są wypełnione pożywką hodowlaną. Protokół ten znacznie zwiększa przeżywalność zaczątków nerek, a także wewnętrznych komórek śródbłonka.Metoda umożliwia przepływ krwi do rozwijającego się kłębuszka nerkowego. Niedawno opublikowaliśmy również nowatorską metodę hodowli narządowej o stałym kierunku, która oferuje konfokalne obrazowanie poklatkowe 3D w wysokiej rozdzielczości. Metoda ta zapewniła optymalne warunki do długotrwałego obrazowania konfokalnego organoidów i zaczątków narządów.W podejściu delikatnie ściskamy tkankę między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a przepuszczalną membraną. Tutaj pokazujemy, jak powstają specjalnie zaprojektowane talerze i jak przeprowadzane są eksperymenty kulturowe. Dlatego w niniejszej publikacji przedstawiamy ulepszoną technikę hodowli organelli nerkowych.Metoda ta oferuje lepszy sposób modelowania genezy organelli i przeprowadzania obrazowania w wysokiej rozdzielczości w celu badania embrionalnych nerek i organoidów nerkowych ex vivo. W zależności od eksperymentu weź kontr-inserty komórek transferowych przeznaczone do płytek sześciodołkowych lub 12-dołkowych. Wytnij boki wkładu za pomocą narzędzia Dremel, aby utworzyć plastikowy pierścień o wysokości dwóch milimetrów z przymocowaną do niego przepuszczalną membraną.Wypoleruj krawędzie pierścienia z opiłków skalpelem lub ostrym nożem. Sterylizuj mini zbiorniki w 70% etanolu przez co najmniej godzinę. Następnie umyj mini zbiorniki w autoklawie wodą destylowaną i wysusz je w okapie laminarnym.Przepłucz mini zbiorniki w PBS i pożywce hodowlanej. Umieść zbiornik na szalce Petriego na naszej kropli pożywki hodowlanej z membraną skierowaną do góry. Ułóż wypreparowane ex vivo nerki zarodkowe lub organoidy nerkowe na błonie.Należy unikać pozostawiania dużej ilości płynu wokół próbek i pozostawić je w inkubatorze do hodowli komórkowych na okres od dwóch do 24 godzin. Przeszczep eksenalny wykonuje się do błony kosmówkowo-omoczniowej ośmiodniowego kurczaka embrionalnego ex ovo. Przenieś mini zbiorniki tak, aby membrana zakrywała przeszczep.Umieść je na obrzeżach CAM tak, aby nie zakrywały zarodka. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do mini zbiorników. Próbki należy hodować na CAM kurczaka przez maksymalnie dziewięć dni.Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną w mini zbiornikach. Unaczynienie próbek można zaobserwować już od 24 do 48 godzin po przeszczepie. Wykonanie specjalnie zaprojektowanych sześciodołkowych płytek do utrwalonej hodowli.Musisz zacząć od wywiercenia 20-milimetrowych otworów w dolnej części płyty za pomocą wiertarki z odpowiednim wiertłem. Następnie wypoleruj krawędzie otworów w górnej części płyty. Na koniec sterylizuj płytki w 70% etanolu przez co najmniej godzinę.Następnie umyj płytki w autoklawie wodą destylowaną i wysusz je w okapie lemiar. Umyj szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22x22 milimetrów w 70% etanolu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Przyklej szkiełko nakrywkowe na górze otworu w dnie studni za pomocą kleju tkankowego.Po wyschnięciu sprawdź płytki pod sterylnym mikroskopem i usuń nadmiar kleju. Najpierw wymieszaj podwielokrotność kulek polistyrenowych z równą objętością wodoru. Umieść wkładkę transfillową pod mikroskopem preparacyjnym z membraną skierowaną do góry i ułóż nerki na membranie.Ostrożnie dodaj kroplę mieszanki kulek hydro-żelowych obok nerek. Odwróć wkładkę transfillową tak, aby membrana i nerki były skierowane w dół. Następnie ostrożnie umieść wkładkę w naszym dołku z specjalnie zaprojektowaną sześciodołkową płytką.Wsuń wkładkę bardzo delikatnie do studzienki. Śledź stopień spłaszczenia z mikroskopu, aż nerka znajdzie się na poziomie kulek. Przytrzymaj wkładkę lekko dociśniętą do studni jedną ręką i przymocuj ją do płytki, topiąc plastik w trzech punktach na obrzeżach wkładki za pomocą lutownicy.Dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do studzienki przez otwór z boku. Rozpoczynając obrazowanie poklatkowe, przenieś płytkę do inkubatora na stoliku mikroskopu odwróconego. Nasz zmodyfikowany protokół wychwytywania CAM umożliwia wysoce wydajną unaczynienie organoidów nerkowych i nerek embrionalnych.Wiele zbiorników zawierających pożywkę hodowlaną dostarcza tkankę dawcy i chroni ją przed wysuszeniem w początkowym okresie czasu poprzedzającego unaczynienie. Ten film pokazuje przepływ komórek krwi kurczaka w embrionalnym ośrodku nerkowym myszy przeszczepionym do CAM kurczaka i hodowanym przez siedem dni. Ten panel rysunkowy pokazuje, że nasza ulepszona metoda hodowli CAM zapewnia warunki permisywne dla komórek śródbłonka pochodzących z nerek.Ryciny A i B pokazują, że nerki embrionalne hodowane przez pięć dni w odstępach między dniami były szczepione centralnie do CAM kurczaka przez pięć dni. Barwienie mysimi specyficznymi przeciwciałami CD-31 pokazuje, że sieć komórek śródbłonka ośrodka nerkowego przeszczepionego do CAM jest bardziej rozległa niż w kontroli po lewej stronie. Na rysunku C widzimy, że naczynia krwionośne myszy są zabarwione mysim przeciwciałem CD-31 specyficznym dla myszy, a to najbardziej w przypadku naczyń krwionośnych kurczaka.Ryciny D i E pokazują kriosekcje embrionalnych nerek myszy hodowanych na kulturze podróżniczej lub CAM kurczaka przez pięć dni i barwionych CD-31 i Hoechst. Unaczynienie kłębuszków nerkowych jest bardziej dojrzałe w nerkach hodowanych na CAM kurczaka niż w kulturach kontrolnych. Rycina F przedstawia embrionalną nerkę myszy hodowaną na CAM transgenicznego kurczaka GFP przez siedem dni.Komórki śródbłonka myszy są barwione przeciwciałem CD-31 i możemy zaobserwować, że unaczynienie w ksenoprzeszczepionych nerkach myszy jest głównie, ale nie wyłącznie, pochodzenia mysiego. Nowatorska hodowla o ustalonym kierunku umożliwia hodowlę zarodkowych nerek i organoidów w ograniczonej odległości. W tradycyjnej kulturze podróżniczej hodowane narządy są umieszczane na filtrze, który jest utrzymywany w interfejsie ośrodka powietrznego za pomocą metalowej siatki.Metoda ta zapewnia dobre warunki do rozwoju i wzrostu, ale nie jest optymalna dla obrazowania. W hodowli o ustalonym kierunku wyhodowany organ jest wciskany między szklane dno naczynia a membranę, a jego grubość jest kontrolowana przez kulki polistyrenowe pełniące tutaj rolę przekładek. Rozwijające się narządy można obrazować bezpośrednio przez szkło nakrywkowe, co zapewnia lepszy widok narządu.Ten panel rysunkowy pokazuje, że nerki embrionalne i organoidy nerkowe mogą być hodowane metodą hodowli w ustalonym kierunku. Obrazy w jasnym polu embrionalnych nerek i organoidów nerkowych w siódmym dniu pokazują normalny rozwój. Na rysunku C ekspresja GFB została aktywowana w rozwijających się nefronach organoidu nerkowego przez Rysunek D pokazuje nerkę z urazem, jednym zabarwieniem na pąku euretrycznym i sześcioma dwoma barwieniami oznaczającymi komórki prekursorowe nefronu.Rysunki E i F przedstawiają nerkę myszy hodowaną przez 12 dni. Uraz pierwszy i barwienie nefronem pokazują pączek eurethric i podocites. Film również przedstawia embrionalną nerkę MTMG, pochodzącą z Taiwan Cree, gdzie Taiwan Cree indukuje ekspresję GFB w komórkach śródbłonka.Widzimy, że komórki śródbłonka nerki są obecne w rozwijającej się nerce embrionalnej, a sieć śródbłonka może również rozwijać się w metodzie hodowli. W panelu po prawej stronie można zobaczyć, jak komórki śródbłonka migrują do szczeliny naczyniowej nefronu w kształcie litery S. Tutaj przedstawiliśmy ulepszony protokół ksenotransplantacji organoidów nerkowych i nerek embrionalnych do CAM kurczaków.Protokół ten znacznie zwiększa przeżywalność zaczątków nerek, a także ich wewnętrznych komórek śródbłonka. Metoda umożliwia przepływ krwi do rozwijającego się kłębuszka nerkowego. Innym przedstawionym tutaj protokołem jest metoda hodowli narządów o ustalonym kierunku, która poprawia jakość obrazowania i pomaga badać genezę organelli na poziomie pojedynczej komórki.Obrazy o wysokiej rozdzielczości nadają się do automatycznej segmentacji komórek i komputerowego badania zachowania komórek w organoidach nerkowych i hodowlach nerek.

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje metodę badania rozwoju narządów za pomocą ulepszonego zestawu ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów. Metoda ta pozwala na rozwój w pełni unaczynionych, hodowanych narządów embrionalnych i organoidów.

Organotypowa hodowla nerek na CAM kurczaka: technika przeszczepiania mysich eksplantatów nerek na CAM kurczaka w celu wywołania powstania architektury naczyń nerkowych

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj ulepszoną metodę hodowli organoidów nerkowych na błonie chorioallantoidalnej kurczaka, która zwiększa unaczynienie i przeżywalność tkanek. Technika ta umożliwia wysokiej jakości obrazowanie mikroskopowe rozwoju nerki.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Przeglądaj więcej filmów