Name: Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj przesiewowe badania leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych z użyciem larw Danio rerio. Ta metoda umożliwia szybkie testowanie odpowiedzi komórek nowotworowych pacjenta na leki i identyfikację nowych związków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez V Foundation V Scholar Award oraz NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (dla J.S. Blackburna) i NIH Training Grant T32CA165990 (dla M.G. Haney).

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky (protokół 2015-2225). Próbki od pacjentów zostały pobrane w ramach Institutional Review Board Uniwersytetu Kentucky (protokół 44672). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane zgodnie z tym protokołem muszą zostać zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania.
1. Rozmrażanie komórek ostrej białaczki limfoblastycznej u pacjenta pierwotnego
<ol>
	<li>Rozmrozić pierwotne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pacjenta z zamrożonego materiału w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast po rozmrożeniu komórek przenieś komórki w pożywce do zamrażania (90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z powolnym pipetowaniem, unikając pęcherzyków powietrza. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do rozmrażania o temperaturze 37 °C (25% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco firmy Iscove [IMDM]) kroplami (około 2-3 s na ml) do komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: PBMC pobrano z próbek krwi pacjenta w momencie diagnozy. Płaszcz kożuchowy oddzielono przez odwirowanie gęstości, a komórki przemyto 2x w RPMI 1640 + 10% FBS. Komórki policzono i zamrożono 107 komórek na kriowial w 1 ml pożywki do zamrażania i przechowywano w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 100 x g przez 10 minut i odessać pożywkę z osadu komórkowego. Powtórz dodawanie pożywki do rozmrażania, odwirowywanie i aspirację jeszcze jeden raz, aby usunąć wszelkie pozostałości DMSO.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i usunąć 10 μl w celu zliczenia na automatycznym liczniku komórek lub hemocytometrze. Dodać 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl komórek usuniętych do zliczenia. Policz liczbę komórek na ml i zapisz, aby później obliczyć objętość do ponownego zawieszenia komórek do ksenoprzeszczepu (patrz krok 2.5). 
	nuta: Zazwyczaj ksenoprzeszczepuje się 500 komórek na larwę danio pręgowanego. Na przykład 5 x 105 komórek jest potrzebnych do wstrzyknięcia 1,000 danio pręgowanego. Żywotność powinna wynosić >85% do wykorzystania do ksenoprzeszczepu. W tym eksperymencie żywotność komórek wynosiła 96% po rozmrożeniu, oceniana za pomocą barwienia błękitem trypanowym.</li>
</ol>
2. Fluorescencyjne znakowanie komórek za pomocą DiI
<ol>
	<li>Odwirować żądaną liczbę komórek w 5 ml PBS przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zabarwić minimum 2 x 106 komórek w przypadku zbrylania się lub problemów z obciążeniem igły podczas wstrzykiwania.</li>
	<li>Sporządzić roztwór barwiący nadchloranu 1,1'-dioktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI) (5 ml PBS zawierającego 4 μl na ml barwnika DiI, tabela materiałów) i ponownie zawiesić osad komórek w roztworze barwiącym. 
	nuta: Gęstość komórek nie powinna przekraczać 2 x 106 komórek/ml po ponownym zawieszeniu w roztworze barwiącym.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze 37 °C w osłonie przed światłem przez 20 minut, delikatnie wirować, a następnie inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Przemyć komórki 5 ml PBS, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Powtórz mycie, odwirowanie i aspirację jeszcze jeden raz.</li>
	<li>Zawieś komórki w 1 μl PBS na 250 000 żywych komórek i przenieś do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj zawieszone komórki na lodzie w ciemności i natychmiast kontynuuj mikroiniekcje. 
	nuta: Gwarantuje to, że 500 komórek pacjenta jest wstrzykiwanych do danio pręgowanego za pomocą każdej pompy iniekcyjnej o objętości 2 nL.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja larw danio pręgowanego
UWAGA: Mikroiniekcje powinny być zakończone w ciągu 1−3 godzin od barwienia, aby poprawić żywotność komórek.
<ol>
	<li>Przed barwieniem komórek i wstrzyknięciem przygotuj płytki agarozowe do wstrzykiwań, wlewając 25 ml 3% agarozy w 1x Tris/boran/EDTA (TBE) do szalki Petriego i pozwól jej zestalić się. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Również przed barwieniem komórek i wstrzyknięciem należy zdechorionować 2 dpf danio pręgowanego za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. W celu ręcznej dechorionacji pociągnij kleszczemi z przeciwległych końców ochronnej kosmówki danio pręgowanego, aż kosmówka się rozerwie i danio pręgowany stanie się nieotoczony10. 
	nuta: Dechorionację można również wykonać za pomocą leczenia enzymatycznego pronazą, jak opisano wcześniej10. Kacper (roy-/-; Do tych eksperymentów użyto danio pręgowanego z masy perłowej11. Do ksenoprzeszczepu można wykorzystać każdy szczep larwalny danio pręgowanego. Jeśli pigment zakłóca obrazowanie lub wizualizację, leczenie propylotiouracylem (PTU) może być zastosowane w celu zablokowania syntezy melaniny, jeśli optycznie czyste szczepy danio pręgowanego nie są dostępne12.</li>
	<li>Igły należy schłodzić w temperaturze 4 °C lub na lodzie, aby zapobiec zbrylaniu się komórek podczas mikroiniekcji. Załaduj 5 μl barwionych komórek do schłodzonej, nienitkowej igły ze szkła borokrzemianowego za pomocą końcówek do pipet do mikroładowarek. 
	nuta: Metody ustawiania mikrowtryskiwaczy i igieł zostały wcześniej opublikowane13.</li>
	<li>Załadować igłę do ramienia mikrowtryskiwacza. Skosować końcówkę igły za pomocą sterylnej żyletki. Zmierz wielkość kropel w oleju mineralnym za pomocą mikrometru stopniowego, utrzymując objętość kropli na stałym poziomie 2 nL (~0,15 mm średnicy) przez cały czas.</li>
	<li>Użyj 350 μl 4 mg / ml tricaine-S do znieczulenia ~ 30 zdechorionowanych 2 dpf danio pręgowanego na szalce Petriego zawierającej 25 ml pożywki E3. Po ~1 min przenieś znieczulone larwy na płaską płytkę iniekcyjną (3% agarozy na szalce Petriego) i wstrzyknij larwy jedną pompą barwionych komórek w pożądane miejsce wstrzyknięcia (np. żółtko lub osierdzie; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). 
	nuta: Miejsce wstrzyknięcia należy wybrać w oparciu o cel eksperymentu. Najczęstszym miejscem wstrzyknięcia jest żółtko. Aby komórki krążyły w krwiobiegu, jako miejsca wstrzyknięcia można wykorzystać osierdzie, przewód Cuviera, przestrzeń okołooczodołową lub przestrzeń zaoczodołową. Można również wykorzystać ortotopowe miejsca wstrzyknięć, takie jak mózg.</li>
	<li>Zmyć larwy z płytki iniekcyjnej na 10 cm2 szalkę Petriego (30 larw na płytkę) zawierającą pożywkę E314 bez błękitu metylenowego i inkubować w temperaturze 28 °C przez 1 godzinę okresu odbudowy. Kontynuować wstrzykiwanie, aż zostanie wstrzyknięta żądana liczba larw. 
	nuta: Najlepiej wstrzyknąć 2-2,5-krotnie liczbę larw potrzebną do eksperymentów. Nastąpi pewne wymieranie larw z powodu stresu spowodowanego wstrzyknięciem i podwyższoną temperaturą inkubacji. Zazwyczaj, po ćwiczeniu z tą techniką, 800-1,500 larw danio pręgowanego może zostać wstrzykniętych przez jedną osobę w ciągu 1-3 godzin, kiedy należy wstrzyknąć barwione komórki.</li>
	<li>Przenieść płytki z wstrzykniętymi larwami do inkubatora o temperaturze 34 °C. Nie umieszczaj szalek Petriego larw bezpośrednio na metalowej półce w inkubatorze, aby zapobiec przegrzaniu wody E3. Na przykład umieść pustą szalkę Petriego między półką a szalką Petriego z larwami, aby działała jako bufor. Martwe larwy danio pręgowanego należy usunąć po 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia (hpi).</li>
</ol>
4. Ustawianie ekranu narkotykowego z ksenoprzeszczepowanym danio pręgowanym
<ol>
	<li>Przy 48 hpi przesiewaj larwy danio pręgowanego pod kątem fluorescencji/wszczepienia guza i zdrowia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C,D). Usuń martwego lub zniekształconego danio pręgowanego i wybierz danio pręgowanego z podobnym szczepieniem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, D, 1−3 i 1'−3'). Usuń nieszczepionego danio pręgowanego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C,D, 5 i 5').
	<ol>
		<li>W przypadku ryb z wstrzykiwanym żółtkiem należy usunąć ryby, w których nie widać granic żółtka wokół wszczepionej masy komórkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, 4), ponieważ utrudnia to kwantyfikację. W przypadku ryb, u których wstrzyknięto osierdzie, należy usunąć ryby, w których wstrzyknięta masa komórkowa wdziera się do woreczka żółtkowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D, 4').</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj danio pręgowanego do 96-dołkowej płytki. Aby to zrobić, odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 μl, wystarczająco dużą, aby zmieścił się w niej danio pręgowany o napięciu 4 dpf. Odessać 150 μl pożywki E3 z jednym daniem pręgowanym z płytki za pomocą pipety P200 i dodać do pustego dołka płaskodennej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć badany lek w wymaganej objętości pożywki E3 w 150 μl na studzienkę. Przygotuj lek w stężeniu 2-krotnym od pożądanego. Na przykład przygotuj 20 μM leku w E3, jeśli pożądane stężenie końcowe wynosi 10 μM, ponieważ połowa całkowitej objętości w każdym dołku składa się z roztworu leku. W przypadku grupy kontrolnej DMSO dodać DMSO w tej samej objętości co lek.</li>
	<li>Dodać 150 μl 2x rozcieńczonego roztworu leku do każdej studzienki zawierającej larwy danio pręgowanego w 150 μl E3, aby uzyskać końcową objętość 300 μl z 1x roztworem leku na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 34 °C. Codziennie sprawdzać, czy nie ma martwych danio pręgowanego. Po 2 dniach, jeśli jest to pożądane, odświeżyć lek, usuwając 200 μl płynu z każdej studzienki 96-dołkowej płytki i zastępując 200 μl 1x rozcieńczonego roztworu leku lub DMSO w pożywce E3. 
	nuta: Najlepsze wyniki uzyskano po 3 dniach leczenia farmakologicznego w tym eksperymencie; Jednak długość leczenia farmakologicznego może wahać się od 2 do 4 dni i może wymagać optymalizacji w zależności od przeprowadzanego eksperymentu lub stosowanych leków.</li>
</ol>
5. Obrazowanie ksenoprzeszczepowanego danio pręgowanego za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, urządzenia do obrazowania wyposażonego w urządzenie do obrazowania i automatyczny próbnik
<ol>
	<li>Przygotować 1 l świeżej 4 mg/ml trikainy i 1,5 l pożywki E3. Napełnij butelkę z podłożem 1 z pożywką E3, a butelkę z podłożem 2 z trikainą.</li>
	<li>Usuń wszystkie niechciane kanały fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i dodaj żądany kanał (DiI w tym eksperymencie). Sprawdź żądany kanał fluorescencyjny, ponieważ zdjęcie zostanie wykonane tylko dla kanałów ze znacznikiem wyboru. Wybierz także sposób robienia zdjęć (stosy z, automatyzacja, pętle szeregowe itp.). 
	nuta: W tym eksperymencie ostrość została ręcznie ustawiona dla każdej sfotografowanej ryby, aby uzyskać jak największą liczbę obrazów z optymalną ostrością.</li>
	<li>Zobrazuj rybę kontrolną DMSO przed rybą leczoną lekiem, aby można było ustawić odpowiedni czas ekspozycji w oprogramowaniu do obrazowania. Po ustawieniu ekspozycji nie zmieniaj czasu ekspozycji na czas trwania eksperymentu. 
	nuta: Ostrość można regulować ręcznie dla każdego danio pręgowanego, aby upewnić się, że nie ma nieostrych obrazów, lub w przypadku w pełni zautomatyzowanego obrazowania, ta sama ostrość może być używana między rybami, które nie są ostrzone obrazy, które są odrzucane, lub rybami ponownie obrazowanymi przed wykonaniem analizy. Co więcej, eksperyment ten można przeprowadzić przy użyciu dowolnego obrazowania fluorescencyjnego, a następnie określić ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja fluorescencji za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ.</li>
	<li>Przejdź do punktu menu Plik | Otwórz i wybierz żądany plik .czi. Oprogramowanie wyświetli okno opcji importu.
	<ol>
		<li>Aby wyświetlić stos, wybierz pozycję Hyperstacks, zaznacz opcję Otwórz pliki pojedynczo, zaznacz opcję Automatyczne skalowanie i zaznacz opcję Podziel kanały. W polu opcji koloru wybierz opcję Kolorowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij Wtyczki | Makra | Rekord.</li>
	<li>Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg. Wybierz typ obrazu jako czerwony z menu rozwijanego po prawej stronie okna progu. Dostosuj minimalny próg, aż oprogramowanie będzie podświetlać tylko obszary z fluorescencją (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) i kliknij przycisk Zastosuj. Oprogramowanie przekonwertuje zdjęcie na czarno-białe, z wybranym obszarem w kolorze czarnym. 
	nuta: Użyj tego samego progu dla każdego obrazu na ekranie leku, aby wyniki były ustandaryzowane i porównywalne.</li>
	<li>Kliknij pozycję Analizuj | Miara. Oprogramowanie wyświetli okno wyników zawierające obszar fluorescencyjny dla tego obrazu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Create (Utwórz) w oknie Macro Recorder (Rejestrator makr). Spowoduje to otwarcie nowego okna z kodem makra. Zaznacz wszystkie żądane obrazy do analizy i otwórz je tak, jak w kroku 6.2.</li>
	<li>Wybierz opcję Uruchom w oknie z makrem. Okno wyników będzie teraz zawierać obszar dla każdego obrazu. 
	nuta: Analizę obrazu można przeprowadzić indywidualnie bez nagrywania i uruchamiania makra, a także poprzez powtarzanie powyższych kroków dla każdego obrazu.</li>
	<li>Skopiuj zmierzone dane do arkusza kalkulacyjnego. Uśrednić całkowitą fluorescencję wszystkich próbek kontrolnych (DMSO). Oblicz procentową różnicę, korzystając z następującego wzoru: –[(średnia powierzchnia DMSO – obszar eksperymentalny)/średnia powierzchnia DMSO] x 100% (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos%3A+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li>
<li>Topczewska, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+tumorigenic+pathways+converge+via+Nodal+signaling%3A+role+in+melanoma+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness.</a> Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).</li>
<li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate%2C+migrate%2C+produce+melanin%2C+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).</li>
<li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).</li>
<li>Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15+years+of+zebrafish+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">15 years of zebrafish chemical screening.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).</li>
<li>Ghotra, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole+animal+bio-imaging+assay+for+human+cancer+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination.</a> PLoS One. 7 (2), 31281(2012).</li>
<li>Chang, T. -Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+On+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).</li>
<li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+automating+the+imaging+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tools for automating the imaging of zebrafish larvae.</a> Methods. 96, 118-126 (2016).</li>
<li>Henn, K., Braunbeck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dechorionation+as+a+tool+to+improve+the+fish+embryo+toxicity+test+%28FET%29+with+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+C%3A+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio).</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Embryo+Xenograft+and+Metastasis+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay.</a> Bio-Protocol. 8 (18), (2018).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Cold Spring Harbor Laboratory Press. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+medium+%28for+zebrafish+embryos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">E3 medium (for zebrafish embryos).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).</li>
<li>Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Xenograft+Platform%3A+Evolution+of+a+Novel+Cancer+Model+and+Preclinical+Screening+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li>
<li>Moore, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+normal+and+malignant+cell+engraftment+into+optically+clear+prkdc-null+SCID+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Engrafted+Human+Cancer+and+Therapy+Responses+in+Immunodeficient+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu wykazaliśmy standaryzowaną metodę rozmrażania i wstrzykiwania pierwotnych komórek białaczkowych pacjenta do danio pręgowanego jako modelu ksenoprzeszczepu. Opracowaliśmy również protokół wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków u ksenografowanych ryb danio pręgowanego przy użyciu urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny i automatycznego próbnika. Wcześniej ksenoprzeszczepy były zgłaszane z ludzkimi liniami komórkowymi, a kwantyfikacja ksenoprzeszczepowanych guzów w sposób wyso...

Ksenografowanie pierwotnych nowotworów pacjenta lub ludzkich linii komórkowych raka do organizmów modelowych jest szeroko stosowaną techniką do badania progresji i zachowania guza in vivo, odpowiedzi guza na leczenie farmakologiczne oraz interakcji komórek rakowych z mikrośrodowiskiem, między innymi. Tradycyjnie, komórki są ksenoprzeszczepiane myszom z obniżoną odpornością i pozostaje to standardem w tej dziedzinie. Jednak ten system modelowy ma kilka ograniczeń, takich jak wysoki koszt, niska liczba powtórzeń, trudności w dokładnym określeniu obciążenia guzem in vivo oraz wydłużony czas potrzebny na wszczepienie guza i zakończenie testów na obecność narkotyków. W ostatnich latach danio pręgowany pojawił się jako alternatywny model ksenoprzeszczepu, a pierwszy przypadek został opisany w 2005 roku, z liniami komórek ludzkiego czerniaka znakowanymi zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) przeszczepionymi do zarodków w stadium blastuli1,2. Ostatnio larwy danio pręgowanego w ciągu 2 dni po zapłodnieniu (dpf) były wykorzystywane jako biorcy ksenoprzeszczepów, aby umożliwić kontrolę anatomicznej lokalizacji wstrzyknięcia i wykorzystać w wysokiej rozdzielczości obrazowanie in vivo interakcji guza z otaczającym mikrośrodowiskiem3,4.
Danio pręgowany oferuje wiele zalet jako model ksenoprzeszczepu. Po pierwsze, dorosłe danio pręgowany można trzymać w pomieszczeniach i szybko hodować w dużych ilościach przy stosunkowo niskich kosztach. Każda para godowa dorosłego danio pręgowanego może wyprodukować setki larw ryb tygodniowo. Ze względu na swoje niewielkie rozmiary, te larwy danio pręgowanego mogą być trzymane na 96-dołkowych płytkach w celu wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Larwy nie muszą być karmione w trakcie typowego eksperymentu z ksenoprzeszczepem, ponieważ ich woreczek żółtkowy dostarcza składników odżywczych, które podtrzymują je przez pierwszy tydzień życia. Co więcej, danio pręgowany nie ma w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego do 7 dpf, co oznacza, że nie wymagają napromieniania ani schematów immunosupresyjnych przed wstrzyknięciem ksenoprzeszczepu. Wreszcie, optycznie przezroczyste linie danio pręgowanego pozwalają na obrazowanie interakcji między guzem a mikrośrodowiskiem w wysokiej rozdzielczości.
Być może najbardziej obiecującym zastosowaniem danio pręgowanego jako modelu ksenoprzeszczepu jest możliwość przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na próbkach ludzkiego raka w sposób, który nie jest możliwy przy użyciu żadnego innego organizmu modelowego. Larwy wchłaniają leki z wody przez skórę, co ułatwia podawanie leków5. Ponieważ zwierzęta są trzymane na 96-dołkowych płytkach, zwykle w 100-300 μl wody, badania przesiewowe wymagają mniejszych ilości leków w porównaniu z myszami. Obecnie istnieje kilka różnych metod standaryzacji i kwantyfikacji wpływu leków na obciążenie nowotworami u ludzi u danio pręgowanego, z których niektóre są bardziej praktyczne niż inne w celu zwiększenia skali testów pojedynczych leków do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład niektóre grupy dysocjują ryby na zawiesiny pojedynczych komórek i określają ilościowo znakowane fluorescencyjnie lub barwione komórki nowotworowe poprzez obrazowanie pojedynczych kropelek zawiesiny i ilościowe określanie fluorescencji za pomocą półautomatycznego ImageJ macro4. Opracowano półautomatyczną metodę obrazowania całych larw, w której larwy ryb utrwalono na 96-dołkowych płytkach i zobrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przed ponownym wyrównaniem obrazów kompozytowych i kwantyfikacją ognisk komórek nowotworowych6. Oba te testy są dość pracochłonnymi metodami oznaczania ilościowego, co sprawiło, że naprawdę wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w modelach ksenoprzeszczepów danio pręgowanego stały się niepraktyczne.
Ten problem został rozwiązany przez opracowanie Vertebrate Automated Screening Technology (VAST) Bioimager and Large Particle (LP) Sampler, jednostki obrazowania wyposażonej w mikroskop fluorescencyjny oraz automatycznej jednostki próbnika (Rysunek 1 i Tabela Materiałów), która jest prawdziwie zautomatyzowaną metodą wysokoprzepustowego obrazowania larw danio pręgowanego7,8,9. Za pomocą tego urządzenia, ryby są znieczulane, automatycznie pobierane próbki z płytki 96-dołkowej, umieszczane w kapilarze i obracane do ustalonej orientacji w oparciu o ustalone preferencje użytkownika, obrazowane, a następnie umieszczane z powrotem w tym samym dołku nowej płytki 96-dołkowej w celu dalszych badań lub odrzucane. Połączenie tej technologii obrazowania z ksenoprzeszczepami danio pręgowanego może pozwolić na spersonalizowaną medycynę, która wykorzystuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w dużych bibliotekach związków leczniczych przeciwko pojedynczym nowotworom pacjenta. Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego stanowią również zakrojoną na szeroką skalę i tanią metodę badania zarówno toksyczności, jak i skuteczności nowych związków in vivo. Danio pręgowany może być stosowany jako wstępny etap badań przesiewowych przed przystąpieniem do mysich modeli ksenoprzeszczepów.
Opracowaliśmy usprawniony przepływ pracy dla ksenoprzeszczepu komórek białaczki pierwotnego pacjenta do danio pręgowanego i wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków z automatycznym obrazowaniem i kwantyfikacją, które mogą być stosowane do innych pierwotnych komórek nowotworowych pacjenta lub linii komórek rakowych. W tym procesie pracy wykorzystano jednostkę obrazowania wyposażoną w mikroskop fluorescencyjny i automatyczny próbnik w celu ulepszenia obecnych metod standaryzacji i kwantyfikacji oraz stanowi zautomatyzowaną alternatywę dla poprzednich, bardziej pracochłonnych metod ilościowego określania masy guza in vivo.

<table><tbody><tr><td>10x Koncentrat płynny TBE</td><td>VWR</td><td>0658-5L</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa, płaska dno</td><td>CELLTREAT</td><td>229195</td><td>VAST jest kompatybilna z różnymi standardowymi lub głębokimi płytkami 24, 48 lub 96-dołkowymi</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego bez filamentu</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-EI126-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>E3 podłoże</td><td></td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Femtotips Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (Premium inaktywowana termicznie)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FIDŻI</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td></tr> https://imagej.net/Fiji <tr><td>Zmodyfikowany Iscove's Dulbecco's Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36150</td><td></td></tr><tr><td>Próbnik dużych cząstek (LP) Union</td><td>Biometrica</td><td>N/A</td><td>Automatyczny próbnik http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</td></tr><tr><td>Olej mineralny Metotreksat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)</td><td>Caisson labs</td><td>PBL06-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr stopniowy (400-stopniowy)</td><td>Hausser Scientific</td><td>400-S</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair Aquatic</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VAST Bioimager</td><td>Union Biometrica</td><td>N/ </td><td>Mikroskop wyposażony we fluorescencje https://www.unionbio.com/vast/</td></tr> <tr><td>Vincristine Sulfate</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T117-0005</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów są kluczowe w określaniu, jak różne nowotwory reagują na leczenie farmakologiczne w systemie in vivo. Modele mysie są standardem w tej dziedzinie, ale danio pręgowany pojawił się jako alternatywny model z kilkoma zaletami, w tym możliwością wysokowydajnych i tanich badań przesiewowych leków. Danio pręgowany pozwala również na badania przesiewowe leków in vivo z dużą liczbą powtórzeń, które wcześniej można było uzyskać tylko za pomocą systemów in vitro. Możliwość szybkiego wykonywania badań przesiewowych leków na dużą skalę może otworzyć możliwość spersonalizowanej medycyny z szybkim przekazywaniem wyników z powrotem do kliniki. Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego mogą być również wykorzystywane do szybkich badań przesiewowych w kierunku mutacji, które można by wykorzystać, w oparciu o odpowiedź guza na terapie celowane lub do identyfikacji nowych związków przeciwnowotworowych z dużych bibliotek. Obecnie głównym ograniczeniem w tej dziedzinie jest ilościowe określenie i automatyzacja procesu, tak aby badania przesiewowe leków mogły być wykonywane na większą skalę i były mniej pracochłonne. Opracowaliśmy przepływ pracy do ksenoprzeszczepu pierwotnych próbek pacjentów do larw danio pręgowanego i wykonywania badań przesiewowych leków na dużą skalę przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w jednostkę obrazowania i zautomatyzowaną jednostkę próbnika. Metoda ta pozwala na standaryzację i kwantyfikację wszczepionego obszaru guza i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne u dużej liczby larw danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest korzystna w porównaniu z tradycyjnymi badaniami przesiewowymi leków w hodowli komórkowej, ponieważ pozwala na wzrost komórek nowotworowych w środowisku in vivo przez cały okres leczenia farmakologicznego i jest bardziej praktyczna i opłacalna niż myszy w przypadku badań przesiewowych leków in vivo na dużą skalę.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, w żółtku i osierdziu rybek zebrafish wykonano ksenoprzeszczepy z pierwotnych PBMC pacjenta, które zostały pierwotnie wyizolowane od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek T (T-ALL) w momencie diagnozy i zamrożone jako żywa próbka. W 48. godzinie po infekcji (hpi) przefiltrowano ksenoprzeszczepione ryby pod kątem obecności fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych (Rycina 2C,D) i poddano je leczeniu chemioterapeuty...

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Nasz proces badań przesiewowych ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwala na zautomatyzowane obrazowanie i kwantyfikację ludzkich komórek nowotworowych oraz ich odpowiedzi na leczenie farmakologiczne. Może być używany do szybkiego testowania odpowiedzi komórek nowotworowych pacjenta na znane leki lub do identyfikacji nowych związków przeciwnowotworowych. Wykorzystanie modeli ksenografu danio pręgowanego i badań przesiewowych leków pozwala na uzyskanie liczby replikantów Inviva, które wcześniej można było uzyskać tylko za pomocą systemów in vitro.Jest również znacznie bardziej opłacalny niż modele mysie podczas badań przesiewowych przez duże biblioteki związków. Ten przepływ pracy składa się z kilku etapów, od wykrzyknika komórek rakowych u danio pręgowanego do obrazowania odpowiedzi na lek, które najlepiej uczy się poprzez demonstrację wizualną. Na początek odwiruj co najmniej dwa razy od 10 do szóstych komórek w pięciu milimetrach PBS w ilości 200 razy g przez pięć minut i odessaj supernatant.Ponownie zawieś paletę komórek w pięciu milimetrach roztworu barwiącego dii. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chronić przed światłem przez 20 minut. Następnie delikatnie wiruj i inkubuj komórki na lodzie przez 15 minut, chroniąc przed światłem.Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 razy g przez pięć minut i odessać supernatant. Umyj komórki, dodając pięć mililitrów PBS, odwirowując 200 razy g przez pięć minut i odsysając supernatant. Powtórz pranie jeszcze jeden raz.Ponownie zawiesić komórki w jednym mikrolitrze PBS na 250 tysięcy żywych komórek i przenieść je do 1,5 milimetrowej mikroprobówki wirówkowej. Utrzymuj zawieszone komórki na lodzie w ciemności. Przed barwieniem komórek i wstrzykiwaniem należy przygotować płytki agarozowe do wstrzykiwań, wlewając 25 milileerów trzyprocentowej agarozy w 1X TBE do szalki Petriego i pozostawić do zestalenia.Przechowuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Również przed barwieniem komórek i wstrzyknięciem należy odchlorować zebry dwa dni po zapłodnieniu za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Pociągnij kleszczami z przeciwległych końców ochronnej kosmówki zebry, aż kosmówka się rozerwie, a danio pręgowany zostanie uwolniony.Aby zapobiec zbrylaniu się komórek podczas mikroiniekcji, należy wstępnie schłodzić igły ze szkła borokrzemianowego bez włókien w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie. Natychmiast po zabarwieniu komórek użyj końcówki pipety do mikroładowarki, aby załadować pięć mikrolitrów barwionych komórek do schłodzonej igły. Załadować igłę do ramienia mikrowtryskiwacza.Wypoziomuj końcówkę igły za pomocą sterylnej żyletki. Za pomocą mikrometru stopniowego zmierz wielkość kropel w oleju mineralnym. Utrzymuj stałą objętość kropli na poziomie dwóch nanolitrów, co ma około 1,5 milimetra średnicy.Minutę po znieczuleniu przenieś znieczulone larwy na przygotowaną płaską płytkę iniekcyjną z trzyprocentową agarozą i wstrzyknij larwy jedną pompą barwionych komórek w żądane miejsce wstrzyknięcia. Wszystkie wstrzyknięcia należy wykonać w ciągu jednej do trzech godzin po zabarwieniu komórek, aby zapobiec zbrylaniu się igły. Zmyć larwy z płytki iniekcyjnej na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 bez błękitu metylenowego i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinny okres rekonwalescencji.Przenieś naczynie z wstrzykniętymi larwami do inkubatora o temperaturze 34 stopni Celsjusza. Z pustą szalką Petriego umieszczoną między półką a szalką Petriego larw, która działa jako bufor. Po 48 godzinach od wstrzyknięcia należy przebadać larwy danio pręgowanego pod kątem fluorescencyjnego wszczepienia komórek nowotworowych i ich zdrowia.Usuń martwe lub zniekształcone danio pręgowane i wybierz zebry z podobnym szczepieniem. Usuń nieszczepionego danio pręgowanego. W przypadku ryb z wstrzykiwanym żółtkiem należy usunąć ryby w miejscach, w których granice jarzma nie są widoczne wokół wszczepionej masy komórkowej.W przypadku ryb, w które wstrzyknięto osierdzie, należy usunąć ryby, w których wstrzyknięta masa komórkowa wdziera się do worka z żółtkiem. Aby przenieść wybraną rybę na 96-dołkową płytkę, najpierw odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, wystarczająco dużą, aby zmieściła się w niej danio pręgowany po czterech dniach od zapłodnienia. Odessać 150 mikrolitrów pożywki E3 z jedną rybą danio pręgowaną z płytki za pomocą pipety P200 i dodać ją do pustego dołka na płaskiej 96-dołkowej płytce.Dodaj 150 mikrolitrów 2X rozcieńczonego roztworu leku do każdej studzienki zawierającej larwy zebry, aby osiągnąć końcową objętość 300 mikrolitrów z 1X roztworem leku na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Codziennie sprawdzaj, czy nie ma martwych ryb danio pręgowanego.Po dwóch dniach, jeśli jest to pożądane, odświeżyć lek, zastępując 200 mikrolitrów płynu z każdej studzienki roztworem leku 1X lub DMSO w pożywce E3. W oprogramowaniu Zen blue usuń wszystkie niechciane kanały fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i dodaj kanał Dii. Sprawdź żądany kanał fluorescencyjny.W tym samym oknie wybierz, w jaki sposób zostaną wykonane zdjęcia, stosy Z, automatyzacja, pętle i serie i tak dalej. Wyobraź sobie rybę kontrolną DMSO przed rybą leczoną lekiem. I ustaw odpowiedni czas naświetlania w oprogramowaniu do obrazowania.Aby określić ilościowo fluorescencję, otwórz oprogramowanie imagej. Przejdź do pliku, otwórz i wybierz żądany plik CHI. Oprogramowanie wyświetli okno opcji importu.Do przeglądania stosu wybierz hyperstacks, sprawdź otwarte pliki pojedynczo, sprawdź automatyczne skalowanie i sprawdź podział kanałów. Jako opcję koloru wybierz opcję kolorowe. Następnie kliknij wtyczki, makra, nagraj.Kliknij obraz, dostosuj, próg. Wybierz typ obrazu jako czerwony z menu rozwijanego po prawej stronie okna progu. Dostosuj minimalny próg, aż oprogramowanie będzie podświetlać tylko obszary za pomocą fluorescencji, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.Oprogramowanie konwertuje zdjęcie na czarno-białe z wybranym obszarem w kolorze czarnym. Kliknij przycisk Analizuj i mierz. Oprogramowanie wyświetla okno wyników zawierające obszar fluorescencyjny dla tego obrazu.Kliknij przycisk Utwórz w oknie rejestratora makr. Spowoduje to otwarcie nowego okna z kodem makra. Zaznacz wszystkie żądane obrazy do analizy i otwórz zgodnie z opcją układania w stos lub koloru.Wybierz opcję uruchom w oknie z makrem. Okno wyników zawiera teraz obszar dla każdego obrazu. W tym protokole, po 48 godzinach od wstrzyknięcia, ksenoprzeszczepowane ryby zostały przebadane pod kątem znakowanych fluorescencyjnie komórek nowotworowych i leczone chemioterapią lub DMSO.Ogólnie rzecz biorąc, ksenoprzeszczepowane ryby leczone winkrystyną wykazały największy i najbardziej konsekwentny spadek masy komórek ksenoprzeszczepowanych w porównaniu z rybami leczonymi DMSO. Ryby leczone deksametazonem wykazały około połowę zmniejszenia powierzchni guza w porównaniu z winkrystyną. Ale nadal wykazywał zmniejszenie obszaru guza w porównaniu do DMSO.Procedura ta może być stosowana do badań przesiewowych dowolnej linii komórek nowotworowych lub próbki pacjenta pod kątem odpowiedzi na różne leki lub specyficzne terapie celowane, dając wgląd w guz każdego pacjenta.

drug-screening-primary-patient-derived-tumor-xenografts

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Ten protokół opisuje procedury optymalizacyjne w opartym na wirusie, dwufluorescencyjnie znakowanym modelem ksenoprzeszczepu guza, wykorzystującym larwy danio pręgowanego jako gospodarzy. Ten heterogeniczny model ksenoprzeszczepu naśladuje skład tkankowy mikrośrodowiska raka trzustki in vivo i służy jako bardziej precyzyjne narzędzie do oceny reakcji leków w spersonalizowanych modelach zPDX (ksenoprzeszczep pobrany od pacjentów z danio pręgowanego).

Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany od pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj przesiewowe badania leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych z użyciem larw Danio rerio. Ta metoda umożliwia szybkie testowanie odpowiedzi komórek nowotworowych pacjenta na leki i identyfikację nowych związków przeciwnowotworowych.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów