Name: Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę pomiaru reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Technika umożliwia średnioprzepustowe badanie leków na próbkach pochodzących od pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] oraz Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Chcielibyśmy podziękować dr Alanie Welm (University of Utah) za dostarczenie guza PDX z rakiem piersi. Chcielibyśmy również podziękować personelowi Medycyny Porównawczej, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) za utrzymanie modelu PDX oraz członkom laboratorium Gujral za pomocne dyskusje. N.N.A jest wspierany przez JSPS Overseas Research Fellowship i Interdisciplinary Training Grant od FHCRC. A.J.B. jest wspierany przez Chromosome Metabolism and Cancer Training Grant od FHCRC.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals wynikającymi z Animal Welfare Act oraz wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach biomedycznych.
1. Przygotowanie skrawków tkanki nowotworowej
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli plastrów tkankowych (TSC) zgodnie z recepturą podaną w Tabeli 1. Pożywkę wysterylizować, filtrując ją za pomocą jednostki filtracyjnej próżniowej 0,45 µm.</li>
	<li>Nalać 250 µL pożywki TSC do każdego dołka płytki 24-dołkowej lub 1 mL pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przechowywać płytkę w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu użycia. 
	UWAGA: Pożywkę i suplementy można zoptymalizować w zależności od typów tkanek i celów eksperymentalnych. Ilość pożywki powinna być wystarczająca jedynie do nasączenia porowatej membrany wkładu hodowlanego. Nie należy przekraczać poziomu membrany. Należy dostosować objętość pożywki, jeśli jej poziom jest zbyt niski lub zbyt wysoki. W przypadku testowania czynników immunomodulujących zaleca się suplementację pożywki IL-210.</li>
	<li>W przypadku użycia tkanki nowotworowej pochodzącej od myszy, uśmiercić zwierzęta zgodnie z zalecaną procedurą, zdezynfekować odsłoniętą skórę myszy, rozpylając 70% etanol, a następnie wyciąć guzy technikami aseptycznymi. Tkankę nowotworową przechowywać w probówce zawierającej lodowaty zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS).</li>
	<li>W przypadku użycia świeżych tkanek nowotworowych pacjentów, przechowywać je w lodowatym HBSS w krótkim terminie lub w lodowatym roztworze Belzera z Uniwersytetu w Wisconsin (UW) przy dłuższym przechowywaniu (do 24 h) w celu zachowania żywotności tkanki. 
	UWAGA: Pomyślnie przygotowano plastry z tkanki PDX przesłanej w transporcie nocnym w lodowatym roztworze UW.</li>
	<li>Przenieść tkankę nowotworową na płytkę hodowlaną 10 cm zawierającą lodowaty HBSS. Przeciąć guz na pół skalpelem, gdy jest zanurzony w lodowatym HBSS. Uformować tkankę nowotworową w cylindry za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 6 mm i przyciąć jedną stronę, aby stworzyć płaską powierzchnię. Tkanki przechowywać w lodowatym HBSS do momentu użycia. 
	UWAGA: Należy unikać włączania obszaru martwiczego tkanki, który zazwyczaj znajduje się w centrum i ma nieprzezroczysty oraz kruchy wygląd.</li>
	<li>Przygotować wibrotom. Zdezynfekować cały sprzęt za pomocą 70% etanolu. Umieścić kuwetę z buforem wibrotomu przykrytą pokrywą z pleksiglasu w centrum łaźni lodowej wibrotomu. Dodać lód do łaźni i napełnić kuwetę schłodzonym HBSS, aby utrzymać niską temperaturę tkanki podczas krojenia. Przymocować żyletkę do uchwytu ostrza. 
	UWAGA: Chociaż utrzymywanie wibrotomów w środowisku półsterylnym nie wpłynęło na wcześniejsze eksperymenty, zaleca się przechowywanie wibrotomu w komorze z laminarnym przepływem powietrza, jeśli jest ona dostępna.</li>
	<li>Ostrożnie podnieść wycięty fragment tkanki nowotworowej z HBSS za pomocą pęsety z ząbkami i usunąć nadmiar buforu, osuszając tkankę bezpyłowym ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Nanieść kroplę medycznego kleju cyjanoakrylowego na płytkę do preparatów i umieścić tkankę na tej kropli. Pozostawić klej do wyschnięcia na powietrzu przez 2–3 min, a następnie umieścić płytkę w kuwecie z buforem. Dolać HBSS, aż tkanka zostanie całkowicie zanurzona w buforze. 
	UWAGA: Montowanie tkanek w pozycji pionowej i stabilnej jest kluczowe dla uzyskania jednorodnie pociętych plastrów. Jeśli zamontowane tkanki są niestabilne, należy dodać więcej kleju wokół tkanki, aby utrzymać pozycję pionową, lub zdjąć tkankę, spłaszczyć jej dno i przykleić ponownie. Tkanki elastyczne mają tendencję do przesuwania się i wyginania podczas krojenia, w takim przypadku odpowiednie mogą być krótsze fragmenty (&lt;5 mm) i wielokrotne przejścia. W przypadku tkanek niezwykle kruchych ręczniki papierowe mogą zniszczyć tkankę. Wówczas tkankę można położyć na plastikowej powierzchni, aby odprowadzić nadmiar HBSS.</li>
	<li>Dostosować ustawienia wibrotomu. Stosowane są następujące parametry: grubość cięcia = 250 µm, amplituda = 3,00 mm, prędkość krojenia = 0,01–0,25 mm/s oraz kąt ostrza = 15°–21°. 
	UWAGA: Zoptymalizować ustawienia krojenia w zależności od sztywności tkanki. Miękkie tkanki łatwiej kroić pod większym kątem ostrza przy niższej prędkości. Kąt ostrza 18°, prędkość krojenia między 0,10–0,18 mm/s i amplituda 3,00 mm sprawdzają się w przypadku guzów mysich 4T1 oraz PDX HCI010. Sztywniejszą tkankę można kroić z większą prędkością ostrza.</li>
	<li>Wyznaczyć punkty startowe i końcowe ostrza i dostosować wysokość stolika. Uruchomić urządzenie w trybie ciągłym, aby wyciąć plastry przez kilka cykli, aż tkanki zostaną pocięte jednorodnie.</li>
	<li>Kontynuować krojenie tkanki. Przenieść plastry wraz z niewielką ilością buforu HBSS na wkład do hodowli komórkowych z pożywką za pomocą pipety transferowej z szeroką końcówką, wykorzystując ssanie do podniesienia całego plastra. Umieścić jeden plaster na wkładzie w płytce 24-dołkowej. Wkład do płytek 6-dołkowych może pomieścić do czterech plastrów w celu przeprowadzenia analizy powtórzonej. 
	UWAGA: Jeśli ostatnia krawędź plastra tkanki jest nadal przytwierdzona do niepociętej tkanki, należy zatrzymać wibrotom i oddzielić plaster tkanki dwiema pęsetami z cienką końcówką, nie dotykając i nie nakłuwając plastrów. Oddzielna żyletka może być przydatna do usuwania zwisającej tkanki.</li>
	<li>Usunąć nadmiar buforu za pomocą pipety transferowej z cienką końcówką.</li>
	<li>Gdy ostrze zbliży się do przyklejonych tkanek, należy zatrzymać urządzenie, opuścić stolik, usunąć utwardzoną tkankę oddzielnym ostrzem i zamontować nową tkankę. Kontynuować krojenie, aż zostanie zebrana odpowiednia liczba plastrów.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze z nawilżaniem ustawionym na 37 °C i 5% CO2. Plastry tkankowe są hodowane na granicy fazy powietrze-ciecz na wkładzie do hodowli komórkowych. Plastry tkankowe są gotowe do eksperymentów 24–48 h po początkowym przygotowaniu. W przypadku długoterminowej hodowli wymieniać pożywkę co 2–3 dni.</li>
</ol>
2. Pomiar żywotności
<ol>
	<li>W celu pomiaru żywotności skrawka tkanki, zgodnie z instrukcją producenta, wymień medium na odczynnik do pomiaru żywotności oparty na luminescencji, zawierający lucyferazę oraz prosubstrat w rozcieńczeniu 1:1 000 w medium TSC. Odczynnik mierzy aktywność redukcyjną żywych komórek przekształcających prosubstrat w lucyferynę11. Nanieś 50 µL mieszaniny enzym-substrat na powierzchnię każdego skrawka tkanki.</li>
	<li>Inkubuj przez noc przy delikatnym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej umieszczonej w wilgotnej inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Sygnały luminescencyjne można mierzyć za pomocą czytnika mikropłytek lub urządzenia do obrazowania in vivo dla tkanek hodowanych na płytce 24-dołkowej. Aby zmierzyć indywidualną żywotność wielu tkanek na płytce 6-dołkowej, należy użyć systemu obrazowania in vivo.
	<ol>
		<li>Przy użyciu czytnika mikropłytek, umieść płytkę bez pokrywy. Do eksperymentu odpowiedni będzie każdy typ czytnika mikropłytek zdolnego do pomiaru intensywności luminescencji. Zastosowano następujące ustawienia: czas odczytu = 1 s, pomiar z góry, wzmocnienie (gain) = 200. 
		UWAGA: Aby uzyskać wyższą dokładność, do przeprowadzenia eksperymentu należy użyć białej mikropłytki. Przetestowano 24-dołkowe płytki z białymi ściankami i przezroczystym dnem i w większości przypadków przezroczyste płytki nie wpływają negatywnie na wyniki.</li>
		<li>Przy użyciu systemu obrazowania in vivo do pomiaru żywotności, umieść płytkę w centrum stolika i zdejmij pokrywę. Wykonaj standardowe zdjęcia fotograficzne, a następnie zdjęcia luminescencyjne przy ustawieniu pola widzenia stolika na C, automatycznym czasie ekspozycji, wartości f-stop = 1 oraz ustawieniu obiektywu na mikropłytkę z wysokością obiektu = 0.0 cm.</li>
		<li>Ilościowo określ intensywność luminescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania dołączonego do systemu obrazowania in vivo. Wyznacz spójne obszary zainteresowania (ROI) wokół każdego skrawka tkanki. W niniejszym protokole jako ROI zastosowano okrąg o średnicy 1 cm (patrz Rysunek 1). Zmierz całkowity strumień (p/s) obszaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena wpływu leku na skrawki tkanek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem leczenia zmierz bazową żywotność, korzystając z odczynnika do pomiaru żywotności opartego na luminescencji, zgodnie z opisem w sekcji 2. 
	UWAGA: Jeśli kilka tkanek wykazuje znacznie niższą żywotność w porównaniu do pozostałych, należy pominąć te tkanki w analizie.</li>
	<li>Rozpuść leki w dimetylosulfoksydzie (DMSO), aby przygotować roztwory zapasowe. Przygotuj 10-krotny roztwór leku w TSC lub innym medium hodowlanym (25 µL/dołek dla płytki 24-dołkowej zawierającej 250 µL medium) w pożądanych stężeniach. Jako kontrolę nośnika przygotuj medium zawierające równoważną objętość DMSO.</li>
	<li>Dodaj 10-krotny roztwór leku do medium hodowlanego na dnie dołka. Wymieszaj za pomocą pipety i przenieś 50 µL medium na wierzch tkanek. 
	UWAGA: Jeśli dostępnych jest kilka skrawków tkanki, wykonaj pomiary w duplikacie lub triplikacie dla każdego warunku.</li>
	<li>Inkubuj przez noc z delikatnym wytrząsaniem na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wysokiej wilgotności.</li>
	<li>Wyjmij płytkę z wytrząsarki i inkubuj w warunkach statycznych w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wysokiej wilgotności.</li>
	<li>W wybranych punktach czasowych zmierz intensywność luminescencji tkanek za pomocą czytnika mikropłytek lub systemu obrazowania in vivo. Zazwyczaj efekty działania leków stają się wykrywalne po 1–6 dniach leczenia. 
	UWAGA: Odczynnik do pomiaru żywotności oparty na luminescencji jest stabilny przez co najmniej 3 dni w warunkach hodowli. Jednakże substrat może zostać wyczerpany podczas analizy, w zależności od aktywności metabolicznej tkanki. Jeśli w tkankach, które wcześniej wykazywały wysokie sygnały, zaobserwowany zostanie znaczący spadek sygnału, uzupełnij substrat we wszystkich dołkach.</li>
	<li>Oblicz pozostałą żywotność leczonych tkanek nowotworowych, korzystając z następującego równania: 
	<img alt="Równanie żywotności komórek z wykorzystaniem zmiany luminescencji; wzór do analizy danych eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Żywotność leczonej tkanki jest normalizowana względem jej żywotności bazowej oraz zmiany żywotności kontrolnych tkanek nowotworowych.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole demonstrujemy platformę do ilościowych badań skuteczności leków w czasie rzeczywistym na organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. System hodowli warstw tkanek zapewnia wyraźne zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami in vitro opartymi na komórkach poprzez uchwycenie heterogeniczności komórek i cech fizjologicznych natywnego mikrośrodowiska guza. Platforma ta umożliwia również zwiększenie przepustowości testów skuteczności leków, pomagając wypełnić lukę między badaniami nad hodowlami komórkowymi a ...

Interakcje komórek rakowych z fizycznymi i biochemicznymi właściwościami otaczającej tkanki zrębu tworzą TME. TME może stymulować wzrost guza, przerzuty i modulować odpowiedź guza na terapię1. W konwencjonalnym rozwoju leków przedklinicznych kandydaci na leki są zazwyczaj najpierw badani przesiewowo przy użyciu hodowlanych linii komórek nowotworowych, platformy testowej, która krytycznie nie ma klasy TME<sup="xref">2. Ten brak fizjologicznego TME w etapach wstępnych badań przesiewowych opartych na komórkach może ograniczać odkrywanie skutecznych środków w modelach zwierzęcych z nowotworem i może przyczyniać się do wysokiego wskaźnika ścierania wielu obiecujących leków onkologicznych w późniejszych klinicznych stadiach rozwoju3.
Pomimo znaczenia TME w modulowaniu odpowiedzi na leki nowotworowe, ograniczenia eksperymentalne ograniczają zastosowanie bardziej fizjologicznie istotnych systemów na wczesnych etapach odkrywania i rozwoju leków. Niepraktyczne jest badanie przesiewowe setek środków terapeutycznych na guzach z modeli zwierzęcych lub próbek guzów pacjentów. Rzeczywiście, próbki chirurgiczne są rzadkimi zasobami o różnym pochodzeniu genetycznym, a badanie przesiewowe tysięcy potencjalnych cząsteczek w modelach zwierzęcych nie jest wykonalne ze względu na skalę eksperymentów, koszty i dobrostan zwierząt.
Hodowla plastrów tkanki nowotworowej, gdzie precyzyjnie wycięte, cienkie skrawki guza są hodowane ex vivo, może rozwiązać problem ograniczenia fizjologicznego TME w testach przesiewowych leków. Historycznie rzecz biorąc, dziedzina neuronauki była pionierem i dokonała szeroko zakrojonych optymalizacji hodowli warstw dla tkanki mózgowej4. Ostatnio wiele badań wykazało przygotowanie wycinków z różnych typów tkanek nowotworowych, w tym guzów pochodzących z linii komórkowych, spontanicznych modeli nowotworów, ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych guzów pacjenta. Hodowla warstw tkanek ex vivo łączy w sobie korzyści zarówno z hodowli in vivo, jak i in vitro5. Wycinki tkanki nowotworowej zachowują nienaruszoną architekturę tkanki i różnorodny skład komórek, co umożliwia badanie komórek nowotworowych w kontekście TME.
Ten protokół wprowadza organotypowy system hodowli warstw tkanek nowotworowych w połączeniu z bardzo czułym testem żywotności w czasie rzeczywistym do oceny reakcji na leki. Testy skuteczności leków na organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej we wcześniej wprowadzonych protokołach polegają na pomiarze zmian żywotności komórek poprzez włączenie barwnika fluorescencyjnego, immunohistochemię (IHC) lub test MTT ((bromek 3- [4, 5-dimetylotiazol-2-ylo]-2, 5 difenylotetrazoliku)6,7,8,9. Jednak wszystkie te metody są testami punktu końcowego i charakteryzują się niską czułością, długim czasem przetwarzania, złożonymi analizami danych, wąskim zakresem sygnału i wysokim błędem eksperymentalnym. Nasz odczynnik kompatybilny z żywymi komórkami na bazie luminescencji ulepsza te testy, zapewniając szeroki zakres sygnału i natychmiastowy (~5 min) pomiar bez wcześniejszego przetwarzania i minimalnego przetwarzania końcowego. Odczynnik ten jest bardzo czuły i może współistnieć w pożywce do hodowli komórkowych, umożliwiając ciągły i trwający w czasie pomiar żywotności komórek. Ten system testowy ma zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych kandydatów na leki na wycinkach tkanek w przedklinicznym opracowywaniu leków.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji o średnicy 6 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>Do TSC średnia</td></tr><tr><td>solkucja chłodnicza Belzer UW (roztwór UW)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza tnące ze stali nierdzewnej z podwójną krawędzią</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>Do krojenia</td></tr><tr><td>doksorubicyny (chlorowodorku)</td> <td>Kajman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki z cienką końcówką</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki z cienką końcówką</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Do podłoża TSC</td></tr><tr><td>HBSS bez wapnia, magnezu lub fenolu Czerwony</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, University of Utah</td><td>Rak piersi PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Roztwór buforowy</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Dla podłoża TSC</td></tr><tr><td>ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>Dla podłoża TSC</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td> Leica VT1200S <td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Do pożywki TSC</td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 &mikro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 &mikro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Do podłoża TSC</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Klej tkankowy TED</td><td>PELLA</td><td>10033</td><td>Długopis do kleju</td></tr><tr><td>Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td> Do <td></td></tr><tr><td>testu żywotności komórek TSC RealTime-Glo MT</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>Do TSC medium</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Przemysłowe żyletki z pojedynczą krawędzią</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Do usuwania sklejonych tkanek</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>Do TSC średniego</td></tr><tr><td>pirogronianu sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW13115E</td><td>Do TSC</td></tr><tr><td>medium Staurosporine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Tooothed</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Szeroka końcówka</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Drobna końcówka</td></tr><tr><td>William's medium E, bez glutaminy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>Do podłoża TSC</td></tr></tbody></table>

pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Tkanki nowotworowe składają się z komórek rakowych, infiltrujących komórek odpornościowych, komórek śródbłonka, fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. To złożone środowisko tworzy mikrośrodowisko guza (TME) i może modulować odpowiedź na terapię in vivo lub odpowiedź na lek ex vivo. Konwencjonalne badania przesiewowe w celu odkrywania leków przeciwnowotworowych są przeprowadzane na komórkach hodowanych w monowarstwie, systemie, w którym krytycznie brakuje wpływu TME. W związku z tym systemy eksperymentalne, które integrują czułe i wysokoprzepustowe testy z fizjologicznym TME, wzmocnią przedkliniczny proces odkrywania leków. W tym miejscu wprowadzamy hodowlę warstw tkanki nowotworowej ex vivo jako platformę do średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Organotypowa hodowla plastrów tkanek to precyzyjnie wycięte, cienkie skrawki guza, które są utrzymywane przy wsparciu porowatej błony na granicy faz ciecz-powietrze. W tym protokole opisujemy przygotowanie i utrzymanie wycinków tkanek przygotowanych z guzów myszy i guzów z modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX). Aby ocenić zmiany żywotności tkanek w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, wykorzystaliśmy biokompatybilny test żywotności oparty na luminescencji, który umożliwia szybki i czuły pomiar żywotnych komórek w tkance w czasie rzeczywistym. Korzystając z tej platformy, oceniliśmy zależne od dawki odpowiedzi wycinków tkanek na inhibitor wielu kinaz, staurosporynę, i czynnik cytotoksyczny, doksorubicynę. Ponadto demonstrujemy zastosowanie plastrów tkankowych w farmakologii ex vivo, przeprowadzając badania przesiewowe 17 leków klinicznych i przedklinicznych na wycinkach tkanek przygotowanych z pojedynczego guza PDX. Nasza fizjologicznie istotna, wysoce czuła i solidna platforma badań przesiewowych ex vivo znacznie usprawni przedkliniczne odkrywanie leków onkologicznych i podejmowanie decyzji dotyczących leczenia.

W niniejszej pracy prezentujemy protokół czasowej oceny skuteczności wielu leków dla skrawków tkanki nowotworowej przygotowanych z tkanki guza piersi myszy 4T1 oraz modelu PDX raka piersi, HCI01012. Z powodzeniem przygotowano skrawki tkankowe z kilku guzów pochodzenia mysiego, PDX oraz świeżych guzów pacjentów10. Ogólny schemat przygotowania tkanki nowotworowej i testu skuteczności leków przedstawiono na Rysunku 1. Generalnie z pojedynczego guz...

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Nasz protokół jest kompatybilny z innymi metodami analizy molekularnej i umożliwia ocenę, w jaki sposób leki wpływają na żywotność wycinków tkanek w takcie oraz na wykonywanie badań przesiewowych o średniej przepustowości. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy zmierzyć żywotność całego wycinka tkanki w czasie rzeczywistym przy bardzo niewielkiej ilości obróbki wstępnej lub końcowej. Technika ta przyspiesza przedkliniczne opracowywanie leków i onkologię poprzez testowanie kandydatów na leki lub wycinków tkanek pobranych bezpośrednio z próbek tkanki nowotworowej pacjenta.Nasza metoda oceny żywotności tkanek w czasie rzeczywistym jest dość wszechstronna i może być stosowana w badaniach z zakresu biologii nowotworów, neuronauki i biologii rozwoju. Przygotowanie w taktach żywotnych wycinków tkanek jest kluczem do sukcesu zabiegu. Ustawienia wibratomu w pożywce należy dostosować do rodzaju i twardości tkanki.W dniu pozyskania wycinka tkanki nowotworowej należy podać 250 mikrolitrów pożywki do hodowli wycinków tkanek na dołek na 24-dołkowej płytce i umieścić jedną wkładkę do hodowli tkankowej w każdym dołku. Następnie umieść płytkę w inkubatorze z wilgotnością 37 stopni Celsjusza

measuring-real-time-drug-response-in-organotypic-tumor-tissue-slices

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Źródło: Ciraku, L., et. al. Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza przerzutowego do mózgu raka piersi. J. Vis. Exp. (2021). Ten film pokazuje obrazowanie komórek nowotworowych wyrażających lucyferazy w organotypowym wycinku mózgu myszy. Lucyferyna jest dodawana do pożywki, a płytkę umieszcza się w komorze systemu obrazowania in vivo. Parametry przechwytywania obrazu są dostosowywane, a kształt i rozmiar guza są definiowane. Następnie rejestrowane są sygnały...

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny wzrostu guza w organotypowym wycinku mózgu myszy

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Poznaj metodę pomiaru reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Technika umożliwia średnioprzepustowe badanie leków na próbkach pochodzących od pacjentów.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Przeglądaj więcej filmów